An electron microscopic study of neocortex of Syrian hamsters (Mesocricetus auratus) infected with SARS-CoV-2 (Coronaviridae: Coronavirinae: Betacoronavirus: Sarbecovirus)

Full Text

Введение

SARS-СoV-2 как возбудитель COVID-19 стал объектом пристального изучения в силу высокой социальной значимости пандемийной ситуации [1, 2]. Биология вируса, генетическая изменчивость и многообразие вариантов его белков были детально описаны в отечественной [3–5] и зарубежной [6, 7] научной литературе.

Ранее считали, что влияние вируса SARS-СoV-2 на организм человека ограничено респираторной системой. В связи с возникновением у пациентов аносмии и агевзии научным сообществом было выдвинуто предположение о воздействии вируса на центральную нервную систему (ЦНС) [8], которое позже подтвердилось при анализе симптомов неврологических и психических расстройств [9–11] у пациентов в остром и отдалённом периодах течения COVID-19.

Основными способами защиты от вируса к настоящему времени признаны вакцинопрофилактика и иммунотерапия [12–15], тогда как данные о противовирусной активности средств химиотерапии более скромны [16], а критерии оценки их эффективности в рамках доклинических исследований до настоящего времени не уточнены.

Необходимость проведения электронно-микроскопического исследования (ЭМИ) неокортекса на экспериментальной модели инфекции SARS-CoV-2 определена различной эффективностью антиметаболитов синтеза вирусной рибонуклеиновой кислоты (РНК) и ингибиторов РНК-полимеразы, активность которых в отношении РНК-содержащих вирусов в культуре доказана [17]. Высказано предположение, что различная эффективность препаратов может быть сопряжена в первую очередь с их способностью воздействовать на вирусные частицы за гистогематическими барьерами. Направленная модификация молекул препаратов с учётом гистотопографических особенностей репликации вируса может повысить их эффективность и расширить безопасное применение.

В связи со значимыми поражениями ЦНС при COVID-19 [2] цель исследования – изучение ультраструктурных изменений нейронов и глиальных клеток – представляет фундаментальный и практический интерес для выявления особенностей патогенеза повреждений и разработки подходов к оценке эффективности противовирусных лекарственных средств на доклиническом этапе.

Материал и методы

Экспериментальное исследование проводили на 24 самцах сирийских хомяков [18] в возрасте 4–6 недель массой тела 80–100 г, полученных из питомника ЗАО «НПО «Дом фармации» (Санкт-Петербург). Животных содержали в стандартных условиях вивария.

Культуру вируса SARS-CoV-2 выделяли из ПЦР-позитивного (полимеразная цепная реакция) материала, полученного от больных COVID-19, и накапливали на культуре клеток почки африканской зелёной мартышки (Chlorocebus sabaeus) Vero (B) («БиолоТ», Россия), согласно ранее описанным в литературе методикам [19, 20]. На этой же клеточной линии определяли тканевую цитопатическую дозу вируса (ТЦД₅₀/мл) по методу Рида и Менча [21].

Были сформированы контрольная и опытные группы животных. Массу животных регистрировали до заражения и ежедневно в течение последующих 28 суток. Перед заражением животных наркотизировали раствором «Золетил 100» в дозе 40 мг/кг внутрибрюшинно. Далее механическим дозатором интраназально каждому хомяку опытной группы вводили по 26 мкл культуры вируса, содержащей SARS-CoV-2 в количестве 4×10⁴ ТЦД₅₀/мл [22]. Эвтаназию животных проводили на 3-и, 7-е или 28-е сутки после заражения передозировкой общего анестетика (растворы «Ксила» 20 мг/мл и «Золетил 100» 50 мг/мл, соотношение 1 : 1) в объеме 1 мл на 1 кг массы тела внутримышечно.

Для ЭМИ извлечённый мозг рассекали на фронтальные срезы толщиной в 1–1,5 мм и префиксировали в охлаждённой до 4 °C смеси 4% параформальдегида и 0,5% глутарового альдегида (на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2–7,4)). Выделенные кусочки неокортекса сенсомоторного отдела коры через 1,5–2 ч дофиксировали в растворе 1% четырёхокиси осмия (все реактивы – Sigma-Aldrich, Германия). Обезвоживали материал в растворах этилового спирта восходящей концентрации и абсолютного ацетона. В процессе дегидратации контрастировали ткань в кусочках 3,5% уранилацетатом на 70° этаноле. Пропитку и заливку смесью аралдитов (Fluka, Швейцария) с ориентацией кусочков выполняли под лупой. Полимеризацию проводили в термостате при 37 и 60 °C в течение трёх суток [23].

Ультратонкие срезы 50–60 нм готовили на ультратоме LKB-III (LKB, Швеция). Регистрацию изменений структуры тканей и их фотофиксацию осуществляли на электронном микроскопе FEI Tecnai G2 Spirit BioTWIN (FEI Company, Нидерланды) при ускоряющем напряжении 80 кВ, предоставленном Центром коллективного пользования Института эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова РАН. В каждом образце проводили морфометрический анализ клеток и сосудов, а также их подсчёт.

Результаты описательной статистики приведены в виде медианы (Me) и межквартильного размаха ([Q₁; Q₃]). Для множественных сравнений показателей несвязанных групп применяли Н-критерий Краскела–Уоллиса при номинальном уровне статистической значимости различий p < 0,05. Сравнение проводили с аналогичными характеристиками животных группы виварного контроля.

Животных содержали в надлежащих условиях вивария (разрешение Главного государственного ветеринарного инспектора Санкт-Петербурга № 78-1102/19, сертификат ISO 9001:2015 № ST.RU.0001.M0017187, сертификат соответствия стандарту GLP № GLP-0727-1020). Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus Author Guidelines For Animal Use (IAVES, 23 July 2010). Протокол исследования одобрен Комитетом по этике биомедицинских исследований организации (протокол № 21 от 23.11.2020).

Результаты и обсуждение

Изменения клеток неокортекса

При инфицировании животных SARS-CoV-2 отчётливо прослеживали появление вирусных частиц в нейронах сенсомоторного неокортекса с признаками повышения синтеза белка. Выявляли нейроны с глубоко узурированными контурами ядер, в некоторых из них наблюдали активные крупные ядрышки (рис. 1). В цитоплазме отмечали массу рибосом, как собранных в полисомы, так и адгезированных на мембранах органелл.

 

Рис. 1. Ультраструктурные изменения неокортекса сирийских хомяков после заражения SARS-CoV-2 4×10⁴ ТЦД50/мл (26 мкл/особь интраназально): а – умеренно гиперхромный нейрон с деформированным контуром ядра (+), крупным ядрышком (Яш) и скоплением РНК-позитивного материала в цитоплазме; б – апоптоз нейрона на стадии фрагментации ядра, на вклейке – большое скопление вирусов; в – вирусные частицы в терминальных участках неравномерно расширенных канальцев эндоплазматического ретикулума; г – фрагмент дендрита с мультивезикулярными тельцами (МВТ), содержащий вирионы. Электронограммы. Увеличения: а – 16 500; б – 6000; вклейка – 17 000; в, г – 60 000.

 

Шероховатый эндоплазматический ретикулум (ЭР) был гипертрофирован и неравномерно расширен, на терминальных фрагментах канальцев прослеживали вирусные частицы, их отшнуровывание и миграцию к аппарату Гольджи (АГ). Уже к 3-м суткам эксперимента отмечали выраженные изменения АГ: мембраны его цистерн набухали, слипались, сливаясь в единый конгломерат, часто с гомогенизированным содержимым внутри. По периферии АГ в цистернах локализовались вирусные частицы, ассоциированные и с мембранами, и с элементами цитоскелета. По-видимому, слабоконтрастные вирионы за счёт белкового процессинга в АГ приобретают отчетливую белковую короновидную структуру поверхности, а затем отшнуровываются от терминальных участков цистерн органеллы. На 7-е сутки после заражения SARS-CoV-2 в нейронах сенсомоторного отдела коры количество повреждений АГ значительно возрастало.

Практически каждый нейрон всех слоёв неокортекса содержал множество вирусов различной степени зрелости и локализации. В нейронах вирусные частицы отмечали не только в перикарионах, но и в отростках нейроцитов, в том числе миелинизированных, а также в пресинаптических аксонных терминалях и шипиках дендритов.

Нарастающие в течение инфекционного процесса деструктивные изменения приводили, по-видимому, к формированию мультивезикулярных телец (МВТ). На ранних сроках в нейронах МВТ встречались относительно редко, их количество возрастало со временем. По аналогии с прослеженными ранее изменениями клеток культуры Vero (B) МВТ, как и везикулы промежуточного компартмента (ПК), играющего важную роль в сопряжении ЭР и АГ, можно считать транспортной формой [24], обеспечивающей выход вируса из заражённых нейронов на поздних сроках инфекционного процесса. Таким образом, в отличие от эпителиальных клеток культуры, в цитозоле нейроцитов удалось проследить свободную миграцию вирусов, массовый выход которых возможен при достижении критических параметров и гибели клетки.

Для системной оценки изменений нейронов и глии проводили морфометрический анализ клеточных популяций (табл. 1). Установлено, что через трое суток после заражения в неокортексе возрастает количество умеренно гиперхромных нейронов, тогда как к 7-м суткам значимо увеличивается количество апоптотически изменённых клеток (рис. 1 б), по-видимому, как результат глубокой вирус-ассоциированной перестройки метаболизма, сохранявшейся до окончания периода наблюдения. В эти же сроки прослеживали нарастание представительства атипичной глии и признаков нейронофагии.

 

Таблица 1. Состав популяций нейронов и глии в неокортексе сирийских хомяков после заражения SARS-CoV-2 4×10⁴ ТЦД₅₀/мл (26 мкл/особь интраназально), Me [Q₁; Q₃], %

Table 1. The neuronal and glial cell composition of the Syrian hamsters neocortex after SARS-CoV-2 infection with 4×10⁴ TCID₅₀/ml (26 µl/individual, intranasally), Me [Q₁; Q₃], %

Популяция клеток Cell population	Характеристика Characteristic	Продолжительность наблюдения (группа) Observation period (group)
		Контроль Control (n = 9)	3 суток 3 days (n = 5)	7 суток 7 days (n = 5)	28 суток 28 days (n = 5)
Нейроны Neurons	Нормохромные Normochromic	75,5 [70, 1; 85, 0]	71,3 [57, 1; 73, 3]	79,0 [78, 0; 86, 5]	67,8 [63, 5; 78, 1]
	Умеренно гиперхромные Moderately hyperchromic	13,8 [7, 9; 15, 7]	17,2* [16, 6; 19, 1]	12,3 [7, 3; 14, 9]	12,4 [11, 3; 14, 2]
	Гиперхромные Hyperchromic	7,6 [4, 4; 13, 7]	10,1 [8, 0; 25, 4]	6,8 [6, 0; 7, 9]	14,1 [12, 3; 22, 7]
	Апоптотические Apoptotic	0,4 [0, 3; 0, 8]	0 [0; 7, 1]	5,6* [3, 1; 5, 9]	6,4* [2, 7; 7, 1]
	Парные Twin	17,4 [15, 7; 18, 3]	19,1 [14, 7; 19, 3]	20,9 [16, 1; 21, 4]	17,0 [10, 6; 20, 0]
	Прилежащие к базальной мембране Adjacent to basement membrane	1,7 [0, 8; 2, 1]	3,3* [2, 3; 5, 5]	2,4 [1, 7; 2, 6]	1,4 [1, 2; 3, 1]
Олигодендроциты Oligodendrocytes	Нормохромные Normochromic	80,9 [74, 0; 89, 0]	84,2 [82, 8; 87, 9]	81,3 [35, 5; 84, 2]	72,5 [62, 5; 77, 1]
	Гиперхромные Hyperchromic	7,7 [1, 3; 11, 5]	10,3 [9, 1; 10, 5]	7,9 [0; 21, 0]	17,5* [15, 0; 18, 8]
	Апоптотические Apoptotic	10,0 [7, 2; 12, 3]	5,3 [3, 0; 6, 9]	18,8 [7, 9; 33, 3]	12,5 [9, 3; 20, 0]
Астроциты Astrocytes	Нормохромные Normochromic	95,1 [89, 2; 100]	95,6 [94, 4; 98, 2]	94,7 [94, 1; 95, 1]	100,0 [97, 6; 100]
	Гиперхромные Hyperchromic	Не прослежены Not traced
	Апоптотические Apoptotic	4,9 [0; 9, 8]	2,8 [1, 8; 4, 4]	5,3 [4, 9; 5, 9]	0 [0; 2, 4]
Атипичные глиоциты Atypical gliocytes		3,6 [1, 4; 7, 1]	11,3* [7, 1; 11, 6]	8,6* [7, 5; 11, 0]	4,7 [1, 4; 5, 0]

Примечание. *Различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (Н-критерий Краскела–Уоллиса, p < 0,05).

Note. *The differences are statistically significant compared to control group (Kruskal–Wallis H test, p < 0.05).

 

Репродукция вируса

Ультраструктурный анализ неокортекса заражённых SARS-CoV-2 животных выявил формирование вирусных «фабрик». Их наличие отмечали преимущественно в нейронах, глиоцитах и эпендимоцитах (рис. 2). Причем в последних формирование вирусных частиц прослеживали с участием шероховатого ЭР, тогда как в нейронах и глиоцитах вирусные «фабрики» сформированы на основе АГ, что подтверждают и другие авторы [25]. Вирусные «фабрики» всегда ассоциированы с митохондриями (Мх), обеспечивающими процесс репродукции вируса энергетически, а также, возможно, триггерными сигналами.

 

Рис. 2. Варианты вирусных «фабрик» в неокортексе сирийских хомяков после заражения SARS-CoV-2 4×10⁴ ТЦД50/мл (26 мкл/особь интраназально): а – вирусные «фабрики», сформированные в нейронах комплексом Гольджи; б – в дендритах нейронов «фабрики» сформированы аппаратом Гольджи и шероховатым эндоплазматическим ретикулумом уже на 3-и сутки инфицирования; в эпендимоцитах (в) и эндотелии пиальных сосудов (г) вирусный процессинг в основном задействует структуры эндоплазматического ретикулума. Электронограммы. Увеличения: а – 43 000; б – 26 500; в – 60 000; г – 26 500.

 

Следует отметить, что персистирование вируса в паренхиме мозга на первых этапах инфекционного процесса не приводит к существенным дистрофическим изменениям нейронов и глиоцитов, а напротив, поддерживает уровень их усиленной пластической и необходимой энергетической активности. Вирусные «фабрики» в нейронах неокортекса прослеживали до 28 суток, когда в ткани лёгких ПЦР-методами вирус уже не определялся [26, 27].

Аутоиммунная агрессия и демиелинизация

Помимо повреждения нейритов и глиоцитов, прослеживали изменения миелиновых волокон. Осевые цилиндры нередко соответствовали вариантам валлеровского перерождения с тёмной дегенерацией и распадом аксонов погибших нейронов. С большей частотой демиелинизация прослежена без дегенерации нейритов как самостоятельный патологический процесс, опосредованный повреждением олигодендроцитов (рис. 3). Прослеживали расширение узлов перехватов Ранвье и отслоение формирующих междоузлие миелиновых ламелл. Деструкция миелиновых оболочек проявлялась в расслоении и разволокнении ламелл, зернистом и везикулярном распаде миелина. Частота наблюдений дегенерации миелинового аппарата возрастала со временем наблюдения, что коррелировало с увеличением количества гиперхромных вакуолизированных олигодендроцитов к 28-м суткам после заражения, по-видимому, связанным с аутоиммунным повреждением этих клеток. Элиминация заражённых олигодендроцитов к окончанию периода наблюдения, вероятно, также опосредована аутоиммунным конфликтом.

 

Рис. 3. Повреждение олигодендроцитов и миелинового аппарата в неокортексе сирийских хомяков на 7-е сутки после заражения SARS-CoV-2 4×10⁴ ТЦД50/мл (26 мкл/особь интраназально): а – проявления валлеровского перерождения с тёмной дегенерацией нейрита; б – апоптоз олигодендроцита на стадии фрагментации ДНК; в – дезорганизация миелинового аппарата в зоне перехвата Ранвье; г – расслоение ламелл миелиновой оболочки. Электронограммы. Увеличения: а – 43 000; б – 11 500; в – 16 500; г – 26 500.

 

Изменения гематоэнцефалического барьера

Нейроны и глиоциты представляют вариант забарьерных популяций клеток, поражение которых подтверждает способность вируса поражать укрытые от прямого иммунного контроля структуры. Для косвенной характеристики функциональной активности формирующих гематоэнцефалический барьер микрососудов неокортекса оценивали профиль базальной мембраны (БМ), степень нарушения её регулярной коллагеновой структуры и состояние периваскулярных отростков астроцитов (табл. 2). Установлено, что вирусная инвазия сопровождается спазмом микрососудов с извилистым профилем БМ и участками периваскулярных отёков уже на 3-и – 7-е сутки после заражения. По-видимому, эти изменения, наряду с выявленным в некоторых случаях тромбозом (рис. 4), способствуют гипоксии тканей, что подтверждает значимое увеличение к этому времени количества гиперхромных и умеренно гиперхромных нейронов, взаимодействующих с БМ сосудов без глиальных посредников. Компенсаторные изменения сопряжены с активацией «спящих» резервных сосудов, количество которых сокращается начиная с 7-х суток и до окончания наблюдения.

 

Таблица 2. Изменения микрососудов неокортекса сирийских хомяков после заражения SARS-CoV-2 4×10⁴ ТЦД₅₀/мл (26 мкл/особь интраназально), Me [Q₁; Q₃], %

Table 2. Microvascular changes in the Syrian hamsters neocortex after SARS-CoV-2 infection with 4×10⁴ TCID₅₀/ml (26 µl/individual, intranasally), Me [Q₁; Q₃], %

Состояние сосуда Condition of the vessel	Периваскулярное пространство Perivascular space	Продолжительность наблюдения (группа)/ Observation period (group)
		Контроль/Control (n = 9)	3 суток/3 days (n = 5)	7 суток/7 days (n = 5)	28 суток/28 days (n = 5)
Норма Normal	Без отёка /Without edema	40,6 [35, 2; 46, 1]	31,2 [27, 4; 32, 8]	15,0* [14, 8; 16, 8]	18,9* [17, 8; 20, 5]
	С отёком/With edema	19,6 [16, 4; 23, 8]	19,4 [15, 8; 19, 8]	26,7* [26, 3; 28, 8]	27,3* [26, 3; 32, 2]
Констрикция Constriction	Без отёка/Without edema	7,5 [6, 5; 8, 5]	12,9* [10, 8; 14, 5]	7,5 [6, 6; 8, 9]	6,8 [4, 0; 9, 0]
	С отёком/With edema	21,6 [15, 8; 25, 5]	26,7 [23, 2; 29, 0]	39,6* [38, 8; 42, 6]	34,7 [33, 1; 40, 2]
Дилатация Dilatation	Без отёка/Without edema	Не прослежены/Not traced
	С отёком/With edema	В единичном количестве на 7-е сутки после заражения/ In a single amount at day 7 post-infection
«Спящие» Dormant	Без отёка/Without edema	5,1 [3, 2; 6, 7]	4,8 [4, 3; 6, 9]	4,0* [3, 4; 5, 0]	1,5* [1, 5; 1, 9]
	С отёком/With edema	2,8 [2, 2; 4, 4]	4,8 [3, 1; 5, 4]	3,0 [1, 6; 6, 3]	6,8* [5, 0; 11, 0]
Итого сосудов с отёком БМ Total vessels with edema of basal membrane		43,9 [37, 5; 52, 0]	53,8 [49, 6; 56, 0]	72,5* [70, 3; 77, 0]	69,7* [67, 8; 77, 2]

Примечание. *Различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (Н-критерий Краскела–Уоллиса, p < 0,05).

Note. *The differences are statistically significant compared to control group (Kruskal–Wallis H test, p < 0.05).

 

Рис. 4. Структурные изменения гематоэнцефалического барьера в неокортексе сирийских хомяков после заражения SARS-CoV-2 4×10⁴ ТЦД50/мл (26 мкл/особь интраназально): а – спазмированный капилляр с отёчным периваскулярым пространством (ПВПр); б – прямой контакт (стрелки) нейрона (Н) с микрососудом, заполненным эритроцитами (Эр); в – спящий резервный капилляр, просвет (ПрК) которого перекрыт ядром эндотелиоцита (ЯЭц); г – вирусные тельца проникают в нейрон (Н), преодолевая базальную мембрану (БМ) сосуда. Электронограммы. Увеличения: а – 6000; б – 4200; в – 11 500; г – 60 000.

 

Прослеженные электронно-микроскопические изменения структур неокортекса не позволяют относиться к COVID-19 исключительно как к респираторной инфекции. Подобно вирусу геморрагической лихорадки Эбола, пролиферация которого также происходит в головном мозге [28], применительно к SARS-CoV-2 прослежено значение этой системы в вирусной репродукции и накоплении, что ввиду особенностей проницаемости гематоэнцефалического барьера определяет сложности проведения противовирусной химиотерапии.

Заключение

Проведённое ЭМИ предоставило важную информацию для формирования подходов к терапии новой коронавирусной инфекции. Забарьерное персистирование вируса объяснило формирование когнитивных нарушений и расстройств внимания у реконвалесцентов COVID-19. Формирующиеся демиелинизирующие процессы, сопряжённые, по-видимому, с иммунным контролем и элиминацией контаминированных вирусом глиальных клеток, определяют болевые проявления и мигрирующие нарушения двигательной активности. Принципиально важно, что большинство применяемых антиметаболитов синтеза РНК и блокаторов вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы представляют достаточно гидрофильные соединения, а их способность воздействовать на вирусную продукцию в нервной ткани весьма ограничена. Это обстоятельство определяет необходимость проведения дальнейшего дизайна молекул лекарств, создания универсальных и безопасных в применении противовирусных средств. Вместе с тем прослеженная роль АГ определяет возможность влияния на гликозилирование как вирусных белков, так и их мишеней на поверхности клеток, что, вероятно, и достигалось посредством применения гидроксихлорохина и его производных [1, 29], показавших свою эффективность в попытках ранней краткосрочной терапии COVID-19 [30].

Таким образом, результаты проведённого морфологического анализа компартментализации метаболических процессов могут быть применены для выявления механизмов протекания инфекции SARS-CoV-2 и поиска направлений разработки новых лекарственных средств.

Участие авторов: Парамонова Н.М. – концепция и дизайн исследования, обработка материала, электронная микроскопия, написание текста статьи; Чепур С.В. – концепция и дизайн исследования, статистическая обработка результатов, написание текста статьи; Первак М.О. – обработка материала, редактирование статьи; Мясников В.А. – концепция и дизайн исследования, редактирование; Тюнин М.А. – концепция и дизайн исследования, редактирование; Ильинский Н.С. – сбор и обработка материала, редактирование статьи; Каневский Б.А – вирусологическая работа, редактирование статьи, Смирнова А.В. – вирусологическая работа, обработка материала, редактирование статьи.

Благодарности. Авторы выражают искреннюю благодарность А.С. Никишину и П.С. Баевой за участие в создании биологических моделей.

Финансирование. Исследование выполнено за счёт государственного бюджета.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus author guidelines for animal use (IAVES, 23 July 2010). Программа и протокол исследования одобрен Комитетом по этике биомедицинских исследований ФГБУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины» Министерства обороны Российской Федерации, 195043, г. Санкт-Петербург, Россия (протокол № 21 от 23.11.2020 г.).

About the authors

Natal’ya M. Paramonova

State Research Testing Institute of Military Medicine of the Ministry of Defense of the Russian Federation; Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: gniiivm_2@mil.ru
ORCID iD: 0000-0001-5451-3555
SPIN-code: 2945-3310

Senior researcher

Russian Federation, 195043, Saint Petersburg; 194223, Saint Petersburg

Sergey V. Chepur

State Research Testing Institute of Military Medicine of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: gniiivm_2@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-7625-2744
SPIN-code: 3828-6730

Dr. Sci. (Med.), Professor, Head of the Institute

Russian Federation, 195043, Saint Petersburg

Mariya О. Pervak

State Research Testing Institute of Military Medicine of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: gniiivm_7@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-1395-823X

Junior researcher

Russian Federation, 195043, Saint Petersburg

Vadim A. Myasnikov

State Research Testing Institute of Military Medicine of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: gniiivm_7@mil.ru
ORCID iD: 0000-0001-7232-4678

Cand. Sci. (Med.), Head of the Scientific-Research Department

Russian Federation, 195043, Saint Petersburg

Mikhail A. Tyunin

State Research Testing Institute of Military Medicine of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: gniiivm_7@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-6974-5583
SPIN-code: 6161-7029

Cand. Sci. (Med.), Vice-head of the Scientific-Research Department

Russian Federation, 195043, Saint Petersburg

Nikita S. Ilinskiy

State Research Testing Institute of Military Medicine of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: nika_il2@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7406-753X
SPIN-code: 5511-7800

Deputy Head of the Scientific-Research Department

Russian Federation, 195043, Saint Petersburg

Boris A. Kanevskij

State Research Testing Institute of Military Medicine of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: gniiivm_7@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-6255-8232
SPIN-code: 2549-9294

Deputy Head of the Scientific-Research Department

Russian Federation, 195043, Saint Petersburg

Anna V. Smirnova

State Research Testing Institute of Military Medicine of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: janis_1@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0483-5032
SPIN-code: 4897-0219

Researcher

Russian Federation, 195043, Saint Petersburg

References

Supplementary files