The molecular evolution of Dabie bandavirus (Phenuiviridae: Bandavirus: Dabie bandavirus), the agent of severe fever with thrombocytopenia syndrome

Full Text

Введение

Острая лихорадка с тромбоцитопеническим синдромом (severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS) представляет собой вирусное заболевание, характеризующееся гипертермией, тромбоцито- и лейкопенией, симптомами поражения желудочно-кишечного тракта и нервной системы, а также проявлениями геморрагического синдрома. Летальность при ней составляет от 6 до 30% [1–3]. Возбудитель заболевания во время первичного выделения (в 2009 г.) был отнесён к роду Phlebovirus семейства Bunyaviridaе и предварительно назван вирусом SFTS [4][5]. В настоящее время согласно классификации Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV) этот агент носит название «вирус Даби» (ВД) (Dabie bandavirus, DBV) и относится к роду Bandavirus семейства Phenuiviridae порядка Bunyavirales [6]. Анализ информации о SFTS свидетельствует, что данная нозологическая форма представляет потенциальную опасность для общественного здравоохранения Российской Федерации [3][7–11]. Это обусловливается наличием эпидемических очагов в сопредельных с дальневосточным регионом РФ территориях, широким ареалом распространения клещей (Acari) видов Haemaphysalis longicornis и Rhipicephalus microplus – основных векторов передачи инфекции [4], повсеместно встречающихся в Китайской Народной Республике (КНР) и смежных регионах [10]. В пользу указанного положения свидетельствуют также высока летальность при заболевании, сложность его идентификации по клинической картине, а также отсутствие в РФ средств не только профилактики и лечения, но и диагностики. Дополнительные потенциальные проблемы может создать установленная возможность инфицирования человека при передаче возбудителя SFTS от заражённых животных [12]. В трансмиссии ВД важную роль может играть антропогенная деятельность (выпас животных и туризм) [13].

Целью представленного обзора является анализ молекулярной эволюции ВД – возбудителя острой лихорадки с тромбоцитопеническим синдромом.

Структурные особенности вируса Даби

Строение генома ВД соответствует таковому для других представителей рода Bandavirus. Геном состоит из 3 сегментов (L, M и S) «минус»-РНК. L-сегмент включает 6368 п.н. и содержит 1 открытую рамку считывания, кодирующую 2084 аминокислоты (РНК-зависимая РНК-полимераза). M-сегмент состоит из 3366 п.н. и содержит также 1 открытую рамку считывания, кодирующую 1073 аминокислоты (предшественник гликопротеинов Gn и Gc). Наконец, S сегмент, содержащий 1744 п.н., имеет амбисенсную организацию, кодирует белок нуклеокапсида NP в антисмысловой ориентации и вирусный неструктурный белок (NSs) – в смысловой ориентации [4][14].

Все выделенные на протяжении 2009–2010 гг. изоляты ВД по нуклеотидной последовательности генома являются близкородственными; уровень гомологии по всем геномным сегментам составляет 96%. Концевые участки всех 3 сегментов у ВД, как и у других представителей семейства Phenuiviridae, содержат короткие консервативные 5’- и 3’-нетранслируемые области. Будучи высококомплементарными, они формируют петлевидную структуру сегментов РНК [15].

Указанные 5’- и 3’- концевые области всех 3 сегментов генома сходны с таковыми для других вирусов рода Bandavirus семейства Phenuiviridae порядка Bunyavirales [15]. Данные полногеномного секвенирования показали, что ВД вместе с вирусами Гуэрту (GTV), Хартленд (HRTV), Малсур (MV), вирусами группы острова Хантер (HIGV) и Бханджа (BHAV) образуют монофилетическую группу в пределах рода Bandavirus [16].

Изучение последовательностей генома вируса Даби

Филогенетический анализ, проведённый с помощью определения полноразмерных последовательностей L-, M- и S-сегментов ВД, установил, что данный возбудитель занимает промежуточное положение между 2 другими группами рода Bandavirus семейства Phenuiviridae (группа сицилийской москитной лихорадки, в которую помимо одноименного вируса (SFSV) входят также вирусы лихорадки долины Рифт (ВЛДР, RVFV), Пунта-Торо (PTV), Тоскана и Массила, и группа вируса Укуниеми (UUKV). Следовательно, рассматриваемый вирус является прототипным агентом третьей группы рода Bandavirus. Близкородственными ВД являются вирусы HRTV, MV и вирусы группы острова Хантер. Они выделены от больных людей в США, летучих мышей (Chiroptera) в Индии и клещей в Австралии [17–20].

По структуре генома ВД наиболее близок к вирусу Укуниеми, уровень гомологии с которым по L-, Mи S-сегментам РНК составляет 34, 24 и 29% соответственно [8]. Эти данные нашли подтверждение в ходе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей структурных белков ВД и других представителей рода Bandavirus семейства Phenuiviridae. Выявлено, что РНК-зависимая РНК-полимераза и гликопротеины ВД в наибольшей степени близкородственны соответствующим вируса Укуниеми, однако белок нуклеокапсида ВД наиболее близок к аналогичному структурному протеину ВЛДР (уровень гомологии 41,4%). Наиболее уникальным аминокислотным составом характеризуется неструктурный белок NSs, для которого уровень гомологии с другими представителями Bandavirus находится на низком уровне (от 11,2 до 16,0%) [21].

Полные последовательности L-, M- и S-cегментов генома ВД депонированы в GenBank (№ KF358691, KF358692 и KF358693 соответственно). Они являются достаточно близкими, что свидетельствует о наличии общего предка [1].

При анализе геномных последовательностей изолятов ВД, выделенных в КНР в 2009–2011 гг., первоначально была установлена циркуляция 2 линий возбудителя. С учётом характера различий между ними наиболее вероятно, что данные линии являются продуктом гомологичной рекомбинации в процессе молекулярной эволюции вируса [6]. Последующие исследования сообщили о наличии 5 генотипов ВД, циркулирующих на территории КНР [7, 11, 17, 18]. Исследование геномной структуры варианта, изолированного в Японии, указывает на его близкое родство со штаммами ВД из КНР. При этом влияние пространственных и/или временны́х факторов выделения возбудителя на изменение его генетического материала не установлено [5].

Проведена также идентификация изолята вируса, детектированного в провинции Канвондо (Южная Корея). Секвенирование геномной РНК выявило его близкое родство по отношению к штаммам, выделенным на территории КНР и Японии. Уровень гомологии по сегментам L, M и S составил 95,8–99,8, 94,1– 99,9 и 94,8–99,7% соответственно [1].

Установление закономерностей молекулярной эволюции вируса Даби

С целью характеристики молекулярной эволюции ВД и эпидемиологии вызываемого им заболевания выполнен детальный филогенетический анализ изолятов из КНР, Южной Кореи и Японии [13]. Проанализировано 125 последовательностей Sсегмента, 100 последовательностей M-сегмента и 99 – L-сегмента. Филогенетические деревья для всех сегментов геномной РНК построены c применением метода максимального правдоподобия (maximum likelihood) в программном обеспечении MEGA v.5. Филодинамический анализ осуществлён с использованием модели BSP (Bayesian skyline pilot) при помощи программы BEAST (версия 1.8.2). При расчёте времени расхождения различных линий ВД от общего предка сравнивали общее соотношение числа несинонимических и синонимических нуклеотидных замен для генов белков L, M, NP и NSs. Наличие селективного отбора для L- и M-сегментов РНК, а также генов белков NSs и NP подтверждали с помощью метода прямой эволюции белковой последовательности [22]. Филогенетические деревья для сегментов L, M и S, построенные согласно методу байесовского анализа, имели сходную топологическую структуру. Построенное при анализе геномных последовательностей сегмента S филогенетическое дерево представлено на рисунке.

В ходе филогенетического анализа, проведённого по каждому сегменту генома для 122 штаммов ВД, выделенных между 2010 и 2014 гг., в т.ч. 108 штаммов из КНР (61 из провинции Хэнань, 21 из провинции Цзянсу, 8 – из провинции Шаньдун, 7 из провинции Ляонин, 4 из провинции Хубэй, 4 из провинции Аньхой и 3 – из провинции Чжэцзян), 8 штаммов из Японии и 6 – из Южной Кореи, установлено наличие 5 генотипов (линии А, В, С, D, Е). Линия А содержит наибольшее число штаммов вируса (55). Все они, за исключением 1 выделенного в Южной Корее штамма Gangwon, изолированы на территории КНР. Там же детектированы все штаммы, входящие в линию В (провинции Хэнань, Цзянсу, Шаньдун, Аньхой, Ляонин). Линия С включает также 2 штамма из КНР, выделенные в провинциях Шаньдун и Цзянсу (КНР); большинство штаммов линии D изолированы в КНР и 1 (KASJH) – в Южной Корее. Наконец, к линии Е отнесены все 8 штаммов, выделенные в Японии, 3 штамма из архипелага Чжоушань в Восточно-Китайском море и 4 – с о. Чеджудо (Южная Корея). Следовательно, штаммы ВД из КНР представлены во всех генотипах, штаммы из Южной Кореи входят в линии А, D и Е, в то время как штамм из Японии относится к линии Е [24].

В дальнейшем выявлено, что филогенетические деревья для сегментов L и M содержат 6 различных генотипов, обозначенных как A, B, C, D, E и F, а S-сегмент включает 5 генотипов (за исключением генотипа линии D). Результаты, полученные позже, указывают на присутствие 2 субгенотипов в генотипе F, который образуют главным образом штаммы из Японии и КНР [19]. При этом 2 штамма, выделенные в провинции Чжэцзян (КНР) [23], формируют субгенотип I генотипа F.

Таким образом, в результате филогенетического анализа установлено, что ВД может быть разделён на 2 клайда, содержащие 6 генотипов [9][15][16][25]. Структура филогенетических деревьев для L-, Sи M-сегментов этих генотипов указывает на то, что все они происходят от одного общего предка. Это, в свою очередь, служит свидетельством наличия коциркуляции различных вариантов вируса, в особенности относящихся к одному генотипу. Штаммы из разных мест выделения, относящиеся к одному генотипу, имеют выраженное родство, за исключением генотипа D, содержащего только 1 штамм. С другой стороны, в пределах одного и того же генотипа пространственные факторы эволюции могут не иметь определяющего значения [13]. Штаммы, изолированные в Японии и Южной Корее, являются близкородственными по отношению к таковым из КНР [5][9][25]. В частности, выделенные на территории Южной Кореи, как и циркулирующие в провинции Аньхой (КНР), штаммы отнесены к генотипу А. Штаммы ВД, выделенные от клещей и других животных (а также от больных людей), распределены по эволюционным ветвям филогенетического дерева. В то же время изолированные на одной и той же территории штаммы также могут относиться к различным ветвям, т.е. влияние географического фактора не всегда является преобладающим [9][15][16][25].

A. Li и соавт. [16] провели исследование 72 полногеномных последовательностей РНК ВД. Результаты позволили дополнить уже имеющиеся данные; были получены в том числе отсутствовавшие сведения о последовательностях геномной РНК штаммов, выделенных в ключевых эпидемических регионах, включая провинции Шаньдун, Ляонин и Хубэй (КНР) [13][21].

Установление явления реассортации для вируса Даби

У ВД, как и у других вирусов, геном которых представлен сегментированной «минус»-РНК, выявлено наличие феномена реассортации [17][26][27]. Роль данного процесса в эволюции РНК-содержащих вирусов хорошо известна [28–33]. Он является важной детерминантой вирусного выживания и диверсификации. Например, реассортация вируса гриппа может привести к появлению новых пандемических штаммов [34].

Для реассортации необходимо, чтобы геном вируса состоял как минимум из 2 сегментов. Когда 2 или более вируса одновременно инфицируют одну клетку, распределение геномных сегментов в потомстве происходит случайным образом. Следовательно, потомство может иметь данные сегменты более чем от одного родителя, и в результате их смешения повышается генетическая вариабельность. Значение этого процесса для выживания и диверсификации вируса демонстрирует антигенный дрейф, обычно наблюдаемый у вируса гриппа. Реассортация может приводить к возрастанию патогенности и способности к трансмиссии различными векторами [35]. У представителей семейства Bunyaviridae в ходе реассортации обычно происходит обмен сегментов М геномной РНК. Для ВД первоначально была установлена реассортация при участии S-сегмента [15][29] и лишь затем – M- и L-сегментов [13]. Продукты генов Lи S-сегментов играют большую роль в процессах вирусной транскрипции и репликации. Несмотря на то что уровень идентичности этих сегментов у различных генотипов высокий, установлено возможное влияние их реассортации на степень репликации и патогенность вируса [13]. Следовательно, обнаружение рассматриваемого явления имеет большое значение для мониторинга SFTS.

Доказательством наличия феномена реассортации ВД служит установленный факт потенциальной принадлежности отдельных сегментов одного и того же штамма к различным генотипам. Так, штамм AHL по результатам анализа L-сегмента отнесён к генотипу Е, по данным изучения М-сегмента – к генотипу В и S-сегмента – к генотипу D [22]. Результаты L. Liu и соавт. указывают на 2 случая реассортации для изученных нуклеотидных последовательностей штаммов. L- и S-сегменты штаммов LN2012_41, LN2012_42, LN2012_12 и LN2012_34 принадлежат к генотипу В, в то время как их же M-сегменты – к генотипу А. У штамма LN2012_58 M- и S-сегменты относятся к генотипу А, а L сегмент – к генотипу В [13]. В процессе анализа полногеномных последовательностей 122 штаммов ВД, выделенных в КНР, Японии и Южной Корее, установлено, что 14 из них являются реассортантами. Реассортация М- и S сегментов выявлена у 9 штаммов: HL/Injected, HL/Egg/G2, HL/Larvae/ G2, HL/Nymph/G2, HL/Adult/G2, HN13, 2012YXX1, HN_278 и LN2012-58. У 5 штаммов – LN2012-14, LN2012-34, LN2012-41, LN2012-42 и AHL – обнаружена реассортация в S-сегменте. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что для ВД наличие реассортантных вариантов является частым событием [24].

A. Li с соавт., проанализировав 72 полногеномных последовательностей РНК, 292 последовательности L-сегмента, 302 последовательности М-сегмента и 502 – S-сегмента, выявили 37 предполагаемых последствий генетической рекомбинации. Наибольшая частота рекомбинации (5,1%) установлена для L-сегмента; для М- и S-сегментов этот показатель составил 3,6 и 0,8% соответственно. Выявлено также 12 реассортантов ВД, 6 из которых представляют вновь идентифицированные формы. Кроме того, мутационный анализ установил наличие 7 сайтов мутаций, которые потенциально могут быть использованы для классификации генотипов. Явления рекомбинации и реассортации геномной РНК ВД продемонстрированы в пробах из клещей [16].

Изучение особенностей эволюции вируса Даби

Относительно времени появления ВД в литературе приводятся различные временны́е интервалы. Согласно результатам байесовского анализа, базирующегося на данных по отдельным сегментам генома, этот возбудитель возник 50–225 лет назад, впервые появившись, вероятно, в провинции Хуаянгшан (КНР) [13]. По мнению же других исследователей, ВД появился 50–150 лет назад [2]. В соответствии с данными A. Li и соавт., полученными с помощью коалесцентного анализа, вирус возник в начале XVIII в. на территории китайской провинции Чжэцзян, при этом генотип F был наиболее ранним [16].

Скорость эволюции генома ВД оценена как 2,28 × 10^-4, 2,42 × 10^-4 и 1,19 × 10^-4 нуклеотидных замен/сайт/год для S-, M- и L-сегментов генома соответственно. Следовательно, скорость эволюции сегментов генома РНК ВД различна, будучи максимальной для сегмента M и минимальной – для L [24].

L. Liu и соавт. при анализе этого параметра ВД установили, что общий предок для его различных генотипов возник ~182–194 года назад. Данный инфекционный агент появился 42 (95% доверительный интервал, I₉₅ 20–87) года назад в горной местности Даби (Центральный Китай), где располагаются провинции Хэнань, Хубэй, Аньхой, Цзянсу. Около 37 (I₉₅ 8–77) лет назад вирус проник в провинцию Шаньдун из Хэнань и 33 (I₉₅ 16–67) года назад – из Цзянсу в провинцию Ляонин на Северо-Востоке Китая. Затем ВД распространился на архипелаг Чжоушань в Восточно-Китайском море, о. Чеджудо (Южная Корея) и Японию приблизительно 31 (I₉₅ 13–61) год назад, став эндемичным для данных областей [13].

Начало расхождения от общего предка для всех 5 линий относится к 1972 г. (I₉₅ 1927–1992 гг.): для линии А – 1987 г. (I95 1962–2003 гг.), для линии В – 1977 г. (I₉₅ 1937–1996 гг.), для D – 1981 г. (I₉₅ 1947–1998 гг.) и для линии Е – 1983 г. (I₉₅ 1953–2001 гг.).

Линии А и С дивергировали друг от друга в 1978 г. (I₉₅ 1940–1996 гг.). В 1976 г. (I₉₅ 1930–1995 гг.) линия D, в свою очередь, дивергировала от линий А и С. Разделение линий В и Е произошло в 1974 г. (I₉₅ 1932–1994 гг.). Время расхождения генотипов ВД от общего предка составляет по результатам анализа S-сегмента 191 (I₉₅ 51–381) год назад; по данным изучения М-сегмента 182 (I₉₅ 73–353) года назад; по результатам анализа L-сегмента – значительно ранее, 294 (I₉₅ 82–681) года назад [20]. Данные по дивергенции для каждого генотипа представлены в таблице.

Аналогичные показатели для этих 6 генотипов получены с помощью байесовского коалесцентного анализа. Установлено, что L- и S-сегменты генотипов B и F старше, чем соответствующие сегменты других генотипов, однако результаты анализа M-сегмента показывают, что генотипы D и F ранее произошли от общего предка [13]. Относительно генотипа С данные, основанные на анализе L-, M- и S-сегментов ВД, свидетельствуют о его недавнем возникновении, возможно, во втором десятилетии XXI в. [13].

Установление положительной селекции вируса Даби

Данные относительно скорости эволюции и время расхождения генотипов ВД от общего предка указывают на то, что основным фактором природного селективного давления является естественный отбор [7][17]. Показатель селективного давления на этот вирус определяли по соотношению dN/dS (отношение количества несинонимических замен к синонимическим) с помощью программного пакета HyPhy на базе сервера Datamonkey (http://www.datamonkey.org/). В случае М-сегмента эта величина (0,14) была относительно выше, чем для L-сегмента и генов NP и NSs, кодируемых S-сегментом. У гена белка NP значение показателя dN/dS (0,089) оказалось бо́льшим, чем у гена белка NSs (0,0371). Величина dN/dS для гена белка L была равной 0,048 [13].

Выявление положительной и отрицательной селекции проведено методами FEL (fixed effects likelihood), IFEL (internal branch fixed-effects likelihood), FUBAR (fast unconstrained Bayesian approximation) и МЕМЕ (mixed-effects model of evolution; multiple EM for motif elicitation) из пакета программ HyPhy [13]. При помощи метода IFEL определено, что позиции 243 и 1353 L-сегмента, а также участки 36 и 500 М-сегмента являются результатом положительной селекции. С помощью метода FEL показана положительная селекция позиции 322 сегмента М. Наряду с этим с применением обоих методов не установлена положительная селекция в генах белков NC или NSs [13].

При использовании метода FUBAR продемонстрировано, что в генах белков L, M, NSs, NP содержится от 26 до 56% позиций, представляющих результат отрицательной селекции. Этот показатель был выше для L-сегмента (56%) и ниже – для M-сегмента и гена N (47 и 39% соответственно). Для гена белка NSs установлено наименьшее значение среди сравниваемых генов – 26%. Положительная позиция в селекции идентифицирована лишь у М-сегмента (позиции 322 и 641).

В целях выявления фиксированных и более случайных положительных позиций селекции использован метод МЕМЕ. С его помощью обнаружены 5 позиций в L-сегменте (20, 243, 1653, 1656 и 1749) и 9 – в М-сегменте (позиции 323, 384, 553, 638, 641, 650, 925 и 1032). Только 1 аналогичная позиция положительной селекции (228) зарегистрирована в гене белка NSs. Анализ селективного давления на ВД демонстрирует, что позитивная селекция по геномным сегментам L, M и гену белка NSs выявлена у 4 генотипов (А, С, D, Е) из 6 изученных [13].

При определении скорости эволюции ВД и времени происхождения генотипов данного возбудителя от общего предка установлено, что эволюция рассматриваемого вируса происходит в 2–4 раза медленнее по сравнению с ВЛДР. Этот факт подтверждает точку зрения, согласно которой РНК-содержащие вирусы, векторами передачи которых являются комары (Culicidae), эволюционируют более быстро в сравнении с вирусами того же семейства, для которых векторами передачи служат клещи [13].

Заключение

Таким образом, для определения эпидемиологических характеристик SFTS и прогноза возможных эпидемических вспышек ключевое значение имеет понимание филогенетических факторов, определяющих трансмиссию возбудителя инфекции. С момента идентификации ВД вызванные им эпидемии произошли в нескольких странах Восточной Азии. Быстрый рост заболеваемости SFTS указывает на то, что рассматриваемый патоген имеет эпидемический потенциал и представляет собой реальную опасность для общественного здравоохранения [36–38].

Анализ эволюции генома ВД позволил установить вероятное время происхождения от общего предка, выявить феномены реассортации и положительной селекции. Имеющиеся данные позволяют предположить, что этот инфекционный агент потенциально способен использовать множественные механизмы для повышения уровня изменчивости.

About the authors

T. E. Sizikova

FSBI «Central Scientific Research Institute No. 48» of the Ministry of Defense of Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1817-0126

141306, Sergiev Posad, Russia

Россия

V. N. Lebedev

FSBI «Central Scientific Research Institute No. 48» of the Ministry of Defense of Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6552-4599

141306, Sergiev Posad, Russia

Россия

S. V. Borisevich

FSBI «Central Scientific Research Institute No. 48» of the Ministry of Defense of Russian Federation

Author for correspondence.
Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-6742-3919

Sergey V. Borisevich, D.Sci. (Biol.), Professor, Corresponding Member of the RAS, Director

141306, Sergiev Posad, Russia

Россия

References

Supplementary files