Молекулярная эволюция вируса Даби (Phenuiviridae: Bandavirus: Dabie bandavirus) – возбудителя острой лихорадки с тромбоцитопеническим синдромом

Полный текст

Введение

Острая лихорадка с тромбоцитопеническим синдромом (severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS) представляет собой вирусное заболевание, характеризующееся гипертермией, тромбоцито- и лейкопенией, симптомами поражения желудочно-кишечного тракта и нервной системы, а также проявлениями геморрагического синдрома. Летальность при ней составляет от 6 до 30% [1–3]. Возбудитель заболевания во время первичного выделения (в 2009 г.) был отнесён к роду Phlebovirus семейства Bunyaviridaе и предварительно назван вирусом SFTS [4][5]. В настоящее время согласно классификации Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV) этот агент носит название «вирус Даби» (ВД) (Dabie bandavirus, DBV) и относится к роду Bandavirus семейства Phenuiviridae порядка Bunyavirales [6]. Анализ информации о SFTS свидетельствует, что данная нозологическая форма представляет потенциальную опасность для общественного здравоохранения Российской Федерации [3][7–11]. Это обусловливается наличием эпидемических очагов в сопредельных с дальневосточным регионом РФ территориях, широким ареалом распространения клещей (Acari) видов Haemaphysalis longicornis и Rhipicephalus microplus – основных векторов передачи инфекции [4], повсеместно встречающихся в Китайской Народной Республике (КНР) и смежных регионах [10]. В пользу указанного положения свидетельствуют также высока летальность при заболевании, сложность его идентификации по клинической картине, а также отсутствие в РФ средств не только профилактики и лечения, но и диагностики. Дополнительные потенциальные проблемы может создать установленная возможность инфицирования человека при передаче возбудителя SFTS от заражённых животных [12]. В трансмиссии ВД важную роль может играть антропогенная деятельность (выпас животных и туризм) [13].

Целью представленного обзора является анализ молекулярной эволюции ВД – возбудителя острой лихорадки с тромбоцитопеническим синдромом.

Структурные особенности вируса Даби

Строение генома ВД соответствует таковому для других представителей рода Bandavirus. Геном состоит из 3 сегментов (L, M и S) «минус»-РНК. L-сегмент включает 6368 п.н. и содержит 1 открытую рамку считывания, кодирующую 2084 аминокислоты (РНК-зависимая РНК-полимераза). M-сегмент состоит из 3366 п.н. и содержит также 1 открытую рамку считывания, кодирующую 1073 аминокислоты (предшественник гликопротеинов Gn и Gc). Наконец, S сегмент, содержащий 1744 п.н., имеет амбисенсную организацию, кодирует белок нуклеокапсида NP в антисмысловой ориентации и вирусный неструктурный белок (NSs) – в смысловой ориентации [4][14].

Все выделенные на протяжении 2009–2010 гг. изоляты ВД по нуклеотидной последовательности генома являются близкородственными; уровень гомологии по всем геномным сегментам составляет 96%. Концевые участки всех 3 сегментов у ВД, как и у других представителей семейства Phenuiviridae, содержат короткие консервативные 5’- и 3’-нетранслируемые области. Будучи высококомплементарными, они формируют петлевидную структуру сегментов РНК [15].

Указанные 5’- и 3’- концевые области всех 3 сегментов генома сходны с таковыми для других вирусов рода Bandavirus семейства Phenuiviridae порядка Bunyavirales [15]. Данные полногеномного секвенирования показали, что ВД вместе с вирусами Гуэрту (GTV), Хартленд (HRTV), Малсур (MV), вирусами группы острова Хантер (HIGV) и Бханджа (BHAV) образуют монофилетическую группу в пределах рода Bandavirus [16].

Изучение последовательностей генома вируса Даби

Филогенетический анализ, проведённый с помощью определения полноразмерных последовательностей L-, M- и S-сегментов ВД, установил, что данный возбудитель занимает промежуточное положение между 2 другими группами рода Bandavirus семейства Phenuiviridae (группа сицилийской москитной лихорадки, в которую помимо одноименного вируса (SFSV) входят также вирусы лихорадки долины Рифт (ВЛДР, RVFV), Пунта-Торо (PTV), Тоскана и Массила, и группа вируса Укуниеми (UUKV). Следовательно, рассматриваемый вирус является прототипным агентом третьей группы рода Bandavirus. Близкородственными ВД являются вирусы HRTV, MV и вирусы группы острова Хантер. Они выделены от больных людей в США, летучих мышей (Chiroptera) в Индии и клещей в Австралии [17–20].

По структуре генома ВД наиболее близок к вирусу Укуниеми, уровень гомологии с которым по L-, Mи S-сегментам РНК составляет 34, 24 и 29% соответственно [8]. Эти данные нашли подтверждение в ходе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей структурных белков ВД и других представителей рода Bandavirus семейства Phenuiviridae. Выявлено, что РНК-зависимая РНК-полимераза и гликопротеины ВД в наибольшей степени близкородственны соответствующим вируса Укуниеми, однако белок нуклеокапсида ВД наиболее близок к аналогичному структурному протеину ВЛДР (уровень гомологии 41,4%). Наиболее уникальным аминокислотным составом характеризуется неструктурный белок NSs, для которого уровень гомологии с другими представителями Bandavirus находится на низком уровне (от 11,2 до 16,0%) [21].

Полные последовательности L-, M- и S-cегментов генома ВД депонированы в GenBank (№ KF358691, KF358692 и KF358693 соответственно). Они являются достаточно близкими, что свидетельствует о наличии общего предка [1].

При анализе геномных последовательностей изолятов ВД, выделенных в КНР в 2009–2011 гг., первоначально была установлена циркуляция 2 линий возбудителя. С учётом характера различий между ними наиболее вероятно, что данные линии являются продуктом гомологичной рекомбинации в процессе молекулярной эволюции вируса [6]. Последующие исследования сообщили о наличии 5 генотипов ВД, циркулирующих на территории КНР [7, 11, 17, 18]. Исследование геномной структуры варианта, изолированного в Японии, указывает на его близкое родство со штаммами ВД из КНР. При этом влияние пространственных и/или временны́х факторов выделения возбудителя на изменение его генетического материала не установлено [5].

Проведена также идентификация изолята вируса, детектированного в провинции Канвондо (Южная Корея). Секвенирование геномной РНК выявило его близкое родство по отношению к штаммам, выделенным на территории КНР и Японии. Уровень гомологии по сегментам L, M и S составил 95,8–99,8, 94,1– 99,9 и 94,8–99,7% соответственно [1].

Установление закономерностей молекулярной эволюции вируса Даби

С целью характеристики молекулярной эволюции ВД и эпидемиологии вызываемого им заболевания выполнен детальный филогенетический анализ изолятов из КНР, Южной Кореи и Японии [13]. Проанализировано 125 последовательностей Sсегмента, 100 последовательностей M-сегмента и 99 – L-сегмента. Филогенетические деревья для всех сегментов геномной РНК построены c применением метода максимального правдоподобия (maximum likelihood) в программном обеспечении MEGA v.5. Филодинамический анализ осуществлён с использованием модели BSP (Bayesian skyline pilot) при помощи программы BEAST (версия 1.8.2). При расчёте времени расхождения различных линий ВД от общего предка сравнивали общее соотношение числа несинонимических и синонимических нуклеотидных замен для генов белков L, M, NP и NSs. Наличие селективного отбора для L- и M-сегментов РНК, а также генов белков NSs и NP подтверждали с помощью метода прямой эволюции белковой последовательности [22]. Филогенетические деревья для сегментов L, M и S, построенные согласно методу байесовского анализа, имели сходную топологическую структуру. Построенное при анализе геномных последовательностей сегмента S филогенетическое дерево представлено на рисунке.

В ходе филогенетического анализа, проведённого по каждому сегменту генома для 122 штаммов ВД, выделенных между 2010 и 2014 гг., в т.ч. 108 штаммов из КНР (61 из провинции Хэнань, 21 из провинции Цзянсу, 8 – из провинции Шаньдун, 7 из провинции Ляонин, 4 из провинции Хубэй, 4 из провинции Аньхой и 3 – из провинции Чжэцзян), 8 штаммов из Японии и 6 – из Южной Кореи, установлено наличие 5 генотипов (линии А, В, С, D, Е). Линия А содержит наибольшее число штаммов вируса (55). Все они, за исключением 1 выделенного в Южной Корее штамма Gangwon, изолированы на территории КНР. Там же детектированы все штаммы, входящие в линию В (провинции Хэнань, Цзянсу, Шаньдун, Аньхой, Ляонин). Линия С включает также 2 штамма из КНР, выделенные в провинциях Шаньдун и Цзянсу (КНР); большинство штаммов линии D изолированы в КНР и 1 (KASJH) – в Южной Корее. Наконец, к линии Е отнесены все 8 штаммов, выделенные в Японии, 3 штамма из архипелага Чжоушань в Восточно-Китайском море и 4 – с о. Чеджудо (Южная Корея). Следовательно, штаммы ВД из КНР представлены во всех генотипах, штаммы из Южной Кореи входят в линии А, D и Е, в то время как штамм из Японии относится к линии Е [24].

В дальнейшем выявлено, что филогенетические деревья для сегментов L и M содержат 6 различных генотипов, обозначенных как A, B, C, D, E и F, а S-сегмент включает 5 генотипов (за исключением генотипа линии D). Результаты, полученные позже, указывают на присутствие 2 субгенотипов в генотипе F, который образуют главным образом штаммы из Японии и КНР [19]. При этом 2 штамма, выделенные в провинции Чжэцзян (КНР) [23], формируют субгенотип I генотипа F.

Таким образом, в результате филогенетического анализа установлено, что ВД может быть разделён на 2 клайда, содержащие 6 генотипов [9][15][16][25]. Структура филогенетических деревьев для L-, Sи M-сегментов этих генотипов указывает на то, что все они происходят от одного общего предка. Это, в свою очередь, служит свидетельством наличия коциркуляции различных вариантов вируса, в особенности относящихся к одному генотипу. Штаммы из разных мест выделения, относящиеся к одному генотипу, имеют выраженное родство, за исключением генотипа D, содержащего только 1 штамм. С другой стороны, в пределах одного и того же генотипа пространственные факторы эволюции могут не иметь определяющего значения [13]. Штаммы, изолированные в Японии и Южной Корее, являются близкородственными по отношению к таковым из КНР [5][9][25]. В частности, выделенные на территории Южной Кореи, как и циркулирующие в провинции Аньхой (КНР), штаммы отнесены к генотипу А. Штаммы ВД, выделенные от клещей и других животных (а также от больных людей), распределены по эволюционным ветвям филогенетического дерева. В то же время изолированные на одной и той же территории штаммы также могут относиться к различным ветвям, т.е. влияние географического фактора не всегда является преобладающим [9][15][16][25].

A. Li и соавт. [16] провели исследование 72 полногеномных последовательностей РНК ВД. Результаты позволили дополнить уже имеющиеся данные; были получены в том числе отсутствовавшие сведения о последовательностях геномной РНК штаммов, выделенных в ключевых эпидемических регионах, включая провинции Шаньдун, Ляонин и Хубэй (КНР) [13][21].

Установление явления реассортации для вируса Даби

У ВД, как и у других вирусов, геном которых представлен сегментированной «минус»-РНК, выявлено наличие феномена реассортации [17][26][27]. Роль данного процесса в эволюции РНК-содержащих вирусов хорошо известна [28–33]. Он является важной детерминантой вирусного выживания и диверсификации. Например, реассортация вируса гриппа может привести к появлению новых пандемических штаммов [34].

Для реассортации необходимо, чтобы геном вируса состоял как минимум из 2 сегментов. Когда 2 или более вируса одновременно инфицируют одну клетку, распределение геномных сегментов в потомстве происходит случайным образом. Следовательно, потомство может иметь данные сегменты более чем от одного родителя, и в результате их смешения повышается генетическая вариабельность. Значение этого процесса для выживания и диверсификации вируса демонстрирует антигенный дрейф, обычно наблюдаемый у вируса гриппа. Реассортация может приводить к возрастанию патогенности и способности к трансмиссии различными векторами [35]. У представителей семейства Bunyaviridae в ходе реассортации обычно происходит обмен сегментов М геномной РНК. Для ВД первоначально была установлена реассортация при участии S-сегмента [15][29] и лишь затем – M- и L-сегментов [13]. Продукты генов Lи S-сегментов играют большую роль в процессах вирусной транскрипции и репликации. Несмотря на то что уровень идентичности этих сегментов у различных генотипов высокий, установлено возможное влияние их реассортации на степень репликации и патогенность вируса [13]. Следовательно, обнаружение рассматриваемого явления имеет большое значение для мониторинга SFTS.

Доказательством наличия феномена реассортации ВД служит установленный факт потенциальной принадлежности отдельных сегментов одного и того же штамма к различным генотипам. Так, штамм AHL по результатам анализа L-сегмента отнесён к генотипу Е, по данным изучения М-сегмента – к генотипу В и S-сегмента – к генотипу D [22]. Результаты L. Liu и соавт. указывают на 2 случая реассортации для изученных нуклеотидных последовательностей штаммов. L- и S-сегменты штаммов LN2012_41, LN2012_42, LN2012_12 и LN2012_34 принадлежат к генотипу В, в то время как их же M-сегменты – к генотипу А. У штамма LN2012_58 M- и S-сегменты относятся к генотипу А, а L сегмент – к генотипу В [13]. В процессе анализа полногеномных последовательностей 122 штаммов ВД, выделенных в КНР, Японии и Южной Корее, установлено, что 14 из них являются реассортантами. Реассортация М- и S сегментов выявлена у 9 штаммов: HL/Injected, HL/Egg/G2, HL/Larvae/ G2, HL/Nymph/G2, HL/Adult/G2, HN13, 2012YXX1, HN_278 и LN2012-58. У 5 штаммов – LN2012-14, LN2012-34, LN2012-41, LN2012-42 и AHL – обнаружена реассортация в S-сегменте. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что для ВД наличие реассортантных вариантов является частым событием [24].

A. Li с соавт., проанализировав 72 полногеномных последовательностей РНК, 292 последовательности L-сегмента, 302 последовательности М-сегмента и 502 – S-сегмента, выявили 37 предполагаемых последствий генетической рекомбинации. Наибольшая частота рекомбинации (5,1%) установлена для L-сегмента; для М- и S-сегментов этот показатель составил 3,6 и 0,8% соответственно. Выявлено также 12 реассортантов ВД, 6 из которых представляют вновь идентифицированные формы. Кроме того, мутационный анализ установил наличие 7 сайтов мутаций, которые потенциально могут быть использованы для классификации генотипов. Явления рекомбинации и реассортации геномной РНК ВД продемонстрированы в пробах из клещей [16].

Изучение особенностей эволюции вируса Даби

Относительно времени появления ВД в литературе приводятся различные временны́е интервалы. Согласно результатам байесовского анализа, базирующегося на данных по отдельным сегментам генома, этот возбудитель возник 50–225 лет назад, впервые появившись, вероятно, в провинции Хуаянгшан (КНР) [13]. По мнению же других исследователей, ВД появился 50–150 лет назад [2]. В соответствии с данными A. Li и соавт., полученными с помощью коалесцентного анализа, вирус возник в начале XVIII в. на территории китайской провинции Чжэцзян, при этом генотип F был наиболее ранним [16].

Скорость эволюции генома ВД оценена как 2,28 × 10^-4, 2,42 × 10^-4 и 1,19 × 10^-4 нуклеотидных замен/сайт/год для S-, M- и L-сегментов генома соответственно. Следовательно, скорость эволюции сегментов генома РНК ВД различна, будучи максимальной для сегмента M и минимальной – для L [24].

L. Liu и соавт. при анализе этого параметра ВД установили, что общий предок для его различных генотипов возник ~182–194 года назад. Данный инфекционный агент появился 42 (95% доверительный интервал, I₉₅ 20–87) года назад в горной местности Даби (Центральный Китай), где располагаются провинции Хэнань, Хубэй, Аньхой, Цзянсу. Около 37 (I₉₅ 8–77) лет назад вирус проник в провинцию Шаньдун из Хэнань и 33 (I₉₅ 16–67) года назад – из Цзянсу в провинцию Ляонин на Северо-Востоке Китая. Затем ВД распространился на архипелаг Чжоушань в Восточно-Китайском море, о. Чеджудо (Южная Корея) и Японию приблизительно 31 (I₉₅ 13–61) год назад, став эндемичным для данных областей [13].

Начало расхождения от общего предка для всех 5 линий относится к 1972 г. (I₉₅ 1927–1992 гг.): для линии А – 1987 г. (I95 1962–2003 гг.), для линии В – 1977 г. (I₉₅ 1937–1996 гг.), для D – 1981 г. (I₉₅ 1947–1998 гг.) и для линии Е – 1983 г. (I₉₅ 1953–2001 гг.).

Линии А и С дивергировали друг от друга в 1978 г. (I₉₅ 1940–1996 гг.). В 1976 г. (I₉₅ 1930–1995 гг.) линия D, в свою очередь, дивергировала от линий А и С. Разделение линий В и Е произошло в 1974 г. (I₉₅ 1932–1994 гг.). Время расхождения генотипов ВД от общего предка составляет по результатам анализа S-сегмента 191 (I₉₅ 51–381) год назад; по данным изучения М-сегмента 182 (I₉₅ 73–353) года назад; по результатам анализа L-сегмента – значительно ранее, 294 (I₉₅ 82–681) года назад [20]. Данные по дивергенции для каждого генотипа представлены в таблице.

Аналогичные показатели для этих 6 генотипов получены с помощью байесовского коалесцентного анализа. Установлено, что L- и S-сегменты генотипов B и F старше, чем соответствующие сегменты других генотипов, однако результаты анализа M-сегмента показывают, что генотипы D и F ранее произошли от общего предка [13]. Относительно генотипа С данные, основанные на анализе L-, M- и S-сегментов ВД, свидетельствуют о его недавнем возникновении, возможно, во втором десятилетии XXI в. [13].

Установление положительной селекции вируса Даби

Данные относительно скорости эволюции и время расхождения генотипов ВД от общего предка указывают на то, что основным фактором природного селективного давления является естественный отбор [7][17]. Показатель селективного давления на этот вирус определяли по соотношению dN/dS (отношение количества несинонимических замен к синонимическим) с помощью программного пакета HyPhy на базе сервера Datamonkey (http://www.datamonkey.org/). В случае М-сегмента эта величина (0,14) была относительно выше, чем для L-сегмента и генов NP и NSs, кодируемых S-сегментом. У гена белка NP значение показателя dN/dS (0,089) оказалось бо́льшим, чем у гена белка NSs (0,0371). Величина dN/dS для гена белка L была равной 0,048 [13].

Выявление положительной и отрицательной селекции проведено методами FEL (fixed effects likelihood), IFEL (internal branch fixed-effects likelihood), FUBAR (fast unconstrained Bayesian approximation) и МЕМЕ (mixed-effects model of evolution; multiple EM for motif elicitation) из пакета программ HyPhy [13]. При помощи метода IFEL определено, что позиции 243 и 1353 L-сегмента, а также участки 36 и 500 М-сегмента являются результатом положительной селекции. С помощью метода FEL показана положительная селекция позиции 322 сегмента М. Наряду с этим с применением обоих методов не установлена положительная селекция в генах белков NC или NSs [13].

При использовании метода FUBAR продемонстрировано, что в генах белков L, M, NSs, NP содержится от 26 до 56% позиций, представляющих результат отрицательной селекции. Этот показатель был выше для L-сегмента (56%) и ниже – для M-сегмента и гена N (47 и 39% соответственно). Для гена белка NSs установлено наименьшее значение среди сравниваемых генов – 26%. Положительная позиция в селекции идентифицирована лишь у М-сегмента (позиции 322 и 641).

В целях выявления фиксированных и более случайных положительных позиций селекции использован метод МЕМЕ. С его помощью обнаружены 5 позиций в L-сегменте (20, 243, 1653, 1656 и 1749) и 9 – в М-сегменте (позиции 323, 384, 553, 638, 641, 650, 925 и 1032). Только 1 аналогичная позиция положительной селекции (228) зарегистрирована в гене белка NSs. Анализ селективного давления на ВД демонстрирует, что позитивная селекция по геномным сегментам L, M и гену белка NSs выявлена у 4 генотипов (А, С, D, Е) из 6 изученных [13].

При определении скорости эволюции ВД и времени происхождения генотипов данного возбудителя от общего предка установлено, что эволюция рассматриваемого вируса происходит в 2–4 раза медленнее по сравнению с ВЛДР. Этот факт подтверждает точку зрения, согласно которой РНК-содержащие вирусы, векторами передачи которых являются комары (Culicidae), эволюционируют более быстро в сравнении с вирусами того же семейства, для которых векторами передачи служат клещи [13].

Заключение

Таким образом, для определения эпидемиологических характеристик SFTS и прогноза возможных эпидемических вспышек ключевое значение имеет понимание филогенетических факторов, определяющих трансмиссию возбудителя инфекции. С момента идентификации ВД вызванные им эпидемии произошли в нескольких странах Восточной Азии. Быстрый рост заболеваемости SFTS указывает на то, что рассматриваемый патоген имеет эпидемический потенциал и представляет собой реальную опасность для общественного здравоохранения [36–38].

Анализ эволюции генома ВД позволил установить вероятное время происхождения от общего предка, выявить феномены реассортации и положительной селекции. Имеющиеся данные позволяют предположить, что этот инфекционный агент потенциально способен использовать множественные механизмы для повышения уровня изменчивости.

Об авторах

Т. Е. Сизикова

ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1817-0126

141306, Сергиев Посад-6, Россия

Россия

В. Н. Лебедев

ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6552-4599

141306, Сергиев Посад-6, Россия

Россия

С. В. Борисевич

ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-6742-3919

Борисевич Сергей Владимирович, д-р биол. наук, профессор, член-корр. РАН, начальник института

141306, Сергиев Посад-6, Россия

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы