Genetic characteristics of the first human adenovirus genotype 55 isolate (Adenoviridae, Mastadenovirus) from Moscow.

Daniil A. Shein; Шеин Даниил Алексеевич; Natalia N. Ryzhova; Рыжова Наталья Николаевна; Maria S. Kunda; Кунда Мария Сергеевна; Ekaterina I. Ermolova; Ермолова Екатерина Ивановна; Tatyana A. Ozharovskaia; Ожаровская Татьяна Андреевна; Olga Popova; Попова Ольга; Natalia A. Nikitenko; Никитенко Наталья Анатольевна; Kirill G. Krasnoslobodtsev; Краснослободцев Кирилл Геннадьевич; Elena I. Burtseva; Бурцева Елена Ивановна; Olga V. Zubkova; Зубкова Ольга Вадимовна; Olga L. Voronina; Воронина Ольга Львовна; Alexander L. Gintsburg; Гинцбург Александр Леонидович

doi:10.36233/0507-4088-297

Genetic characteristics of the first human adenovirus genotype 55 isolate (Adenoviridae, Mastadenovirus) from Moscow.

Authors: Shein D.A.¹, Ryzhova N.N.¹, Kunda M.S.¹, Ermolova E.I.¹, Ozharovskaia T.A.¹, Popova O.¹, Nikitenko N.A.¹, Krasnoslobodtsev K.G.¹, Burtseva E.I.¹, Zubkova O.V.¹, Voronina O.L.¹, Gintsburg A.L.²
Affiliations:
1. National Research Centre of Epidemiology and Microbiology named after honorary academician N.F. Gamaleya of Ministry of Health
2. National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya
Section: ORIGINAL RESEARCH
URL: https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/16721
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-297
EDN: https://elibrary.ru/aatdbs
ID: 16721

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

The aim of this work was to identify HAdV isolated in Moscow in 2022 and conduct a comparative genomic study.

Material and methods. HAdV-55 was isolated from a sample of a patient hospitalized with pneumonia and analyzed using restriction fragment length polymorphism analysis and whole genome sequencing. Bioinformatic comparative analysis was performed on a sample of 83 isolates.

Results. The genome of HAdV-55 isolated for the first time in the Russian Federation (isolate SCV3008:Ad55) was deposited in GenBank (Accession Number PQ641625). Unique mutations in the SCV3008:Ad55 genome were identified, one of which resulted in a conservative T29A substitution in the penton that did not affect its functions. Phylogenetic analysis showed clustering of SCV3008:Ad55 with isolates of clade II, which included representatives of 7 countries on different continents, indicating a wide distribution of HAdV-55. Isolates from endemic regions of China and South Korea formed separate clades. The study of microsatellite length polymorphism in untranslated regions of the genome became an additional tool for distinguishing closely related genomes.

Conclusion. The obtained genomic information laid the foundation for further monitoring of HAdV-55 in Russia and demonstrated the informativeness and significance of whole-genome studies for monitoring adenoviruses.

Keywords

human adenovirus type 55, HAdV-55, whole-genome sequencing, phylogenetic analysis

Full Text

Введение

Аденовирусы (семейство Adenoviridae) - безоболочечные, содержащие двуцепочечную ДНК вирусы, подразделяют на шесть родов: Aviadenovirus, Barthadenovirus, Ichtadenovirus, Mastadenovirus, Siadenovirus и Testadenovirus. Аденовирусы млекопитающих входят в род Mastadenovirus, включающий более 50 видов. Аденовирусы человека (HAdV) относятся к семи видам: M. adami, M. blackbeardi, M. caesari, M. dominans, M. exoticum, M. faecale и M. russelli [1]. Различные виды HAdV обладают разным тканевым тропизмом, что зачастую коррелирует с конкретными клиническими симптомами инфекции [2]. HAdV вызывают, в основном, острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), но могут также поражать органы зрения, кишечник, мочевыводящие пути и нервную систему. Тяжесть заболевания зависит от типа вируса и иммунного статуса хозяина [2-6]. Наиболее серьезные респираторные инфекции вызывают HAdV восьми генотипов из 10, принадлежащих виду M. blackbeardi: 3, 7, 11, 14, 16, 21, 50, 55 [7].

История выделения HAdV-55 в отдельный генотип показывает роль и развитие методической базы вирусологии, способствующей более точной классификации вирусов. Впервые атипичный вирус HAdV-11, как возбудитель ОРВИ, был выявлен с помощью иммунохимических методов в 1974 г. [8]. В 1991 г. сравнение полиморфизма длин фрагментов рестрикции ДНК изолятов позволило выделить генотип HAdV-11a и показать, что вирусы этого генотипа ассоциированы с инфекцией верхних дыхательных путей и бронхопневмонией [9]. В 2009 г. был опубликован первый полный геном HAdV-11a изолята HAdV11-QS (Accession Number FJ643676), полученный сборкой перекрывающихся ампликонов, секвенированных по Сэнгеру [10]. Сравнение данных секвенирования способствовало доказательству происхождения HAdV-11a посредством рекомбинации: геном HAdV-11a имеет в основе геном HAdV-14 и часть гена гексона HAdV-11 [10]. В 2011 г. рабочая группа по аденовирусам человека (Human Adenovirus Working Group) рекомендовала использовать сиквенсы полных геномов для типирования и характеристики HAdV и классифицировать рекомбинанты в новые генотипы при отличии нуклеотидной последовательности и биологических свойств [11]. На основании этих рекомендаций в 2013 г. рекомбинант HAdV-11a был назван HAdV-55 с типовым изолятом HAdV11-QS [12]. Ретроспективные исследования коллекционных изолятов показали, что HAdV-55 является эндемичным для Китая и Южной Кореи и доминировал среди вирусов, выделенных при ОРВИ в Пекине с 1965 по 1985 гг. [9]. Вспышки HAdV-55-ОРВИ в организованных коллективах фиксируют с 1969 г. среди воинского контингента в Испании [8], в центре профессиональной подготовки в США [13], среди детей в Аргентине, Чили и Уругвае [14], в психиатрических институтах Израиля [15], в семейных коллективах в Китае [16]. HAdV-55 по сравнению с респираторными аденовирусами других генотипов вызывает более тяжелые заболевания и представляет значительную угрозу здоровью населения [7]. В России, по данным Центра экологии и эпидемиологии гриппа Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России в сотрудничестве с 10 опорными базами, в эпидемическом сезоне 2021-2022 гг. на исследованных территориях частота положительных проб на аденовирусы составила 7,7% (1793 образца) из числа тестированных на ОРВИ [17]. HAdV, выделенный из одного из 1793 образцов, стал объектом подробного исследования.

Целью данной работы была идентификация HAdV, выделенного в Москве в 2022 г., и проведение сравнительного геномного исследования.

Материалы и методы

Материалы. Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) от госпитализированного мужчины 34 лет с диагнозом пневмония неуточненная.

Методы. Идентификацию вирусов проводили посредством экстракции РНК/ДНК из клинического материала набором «РИБО-ПРЕП» (Интерлабсервис, Россия) с последующей детекцией РНК/ДНК возбудителей респираторных инфекций в ОТ-ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием коммерческих тест-систем "АмплиСенс ® ОРВИ-скрин-FL" (Интерлабсервис, Россия) согласно инструкции производителя на детектирующем амплификаторе «Bio-Rad CFX-96» (Bio-Rad, США).

Выделение HAdV. Вирус накапливали в клетках НЕК293 (эмбриональной почки человека), очистку выполняли методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия.

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Геномную ДНК очищенного вируса выделяли набором Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, США). ДНК (1 мкг) гидролизовали рестриктазами Cfr41I, XagI и XhoI (Thermo, США) и анализировали методом электрофореза в агарозном геле, используя более длительную выдержку для детектирования низкомолекулярных фрагментов. Анализ ПДРФ in silico проводили с помощью программы «Geneious Prime» (Biomatters, Новая Зеландия).

Секвенирование и сборка генома. Приготовление библиотеки выполняли с набором KAPA HyperPlus Kit (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Швейцария) согласно протоколам производителя, проверку качества и размера библиотек проводили с помощью электрофореза на чипах High Sensitivity DNA Chips 2100 Bioanalyzer System (Agilent, США), секвенировали на приборе NextSeq 500/550 (Illumina, San Diego, CA, США), используя картриджи Mid Output 300 cycles. Для сборки прочтений de novo и по референсным последовательностям использовали пакет программ CLC Genomic Workbench v.21 (Qiagen, США).

Сравнительный анализ. В сравнительный анализ включили 83 полных генома HAdV-55 (табл. 1) и геном HAdV-14 (MF062484). Выравнивание геномных последовательностей выборки изолятов, построение филогенетического древа Neighbor-Joining, расчет ANI (average nucleotide identity, средней нуклеотидной идентичности) выполняли с помощью модуля Whole Genome Alignment пакета программ CLC Genomic Workbench v.21 (Qiagen, США). Для визуализации древа использовали программу MEGA11 [18]. Трансляцию рамок считывания и выравнивание аминокислотных последовательностей выполняли в программе MEGA11 [18].

Результаты

Выборку респираторных образцов, содержащих HAdV по данным ПЦР-РВ, проанализировали по значениям вирусной нагрузки и множественности инфекции. Один из образцов (БАЛ пациента, госпитализированного с пневмонией), отличавшийся высоким показателем нагрузки ДНК HAdV (значение порогового цикла, Ct=12.3) и отсутствием сопутствующей инфекции другими респираторными вирусами, использовали для изоляции HAdV.

Выделенный аденовирус идентифицировали как HAdV-55 на основании данных секвенирования, депонировали в Государственной Коллекции Вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под номером SCV3008:Ad55, геномные данные зарегистрировали в GenBank: Accession Number PQ641625.

Анализ ПДРФ ДНК изолята выявил следующие фрагменты: Cfr41I (12894, 8674, 7768, 2664, 1194, 1181 и 403 п.н.), XhoI (10335, 8005, 6544, 5761, 2628, 1355 и 150 п.н.) и XagI (20615, 5219, 3789, 2944, 1359 и 852 п.н.). На рисунке 1А представлены наиболее яркие из них. Сопоставление с данными in silico для изолятов HAdV-55 (MG905110), HAdV-11 (AY163756) и HAdV-14 (MF062484) (рис. 1B) подтверждает сходство рестрикционных фрагментов изолятов SCV3008:Ad55 и HAdV-55 (MG905110) и подчеркивает, что в рекомбинанте HAdV-55 основу генома составляют гены HAdV-14.

Сходство с HAdV-14 показал и расчет ANI между геномами HAdV-55 выборки, представленными в таблице 1, SCV3008:Ad55 и HAdV-14 (MF062484). Значение ANI между HAdV-55 и HAdV-14 составило 98.7478 – 98.9411, а между геномами HAdV-55 – 99.6546 - 100.

В филогенетический анализ включили изоляты HAdV-55 1969-2022 гг., выделенные в восьми странах (табл. 1). Древо гомологии представлено на рисунке 2. Как видно из рисунка, геномы сформировали 4 клады. В «0» базовую кладу вошли наиболее ранние изоляты MG905110 (Испания, 1969), MN654394 (США, 1976) и изолят 2020 г. MN654395 (США). Кладу «I» образовали 13 изолятов Южной Кореи и два изолята Китая 2011 и 2015 гг. Клада «II», основу которой составили изоляты из Египта (12 изолятов), наиболее разнообразна по представленности стран. В нее вошли изоляты Сингапура (MN654388 и MN654389, 2005), Японии (MN654393, 2012), США (MN654392, 1997; MT513753, 2006), Китая (JX123027, 2010) и выделенный нами изолят SCV3008:Ad55. Самую многочисленную кладу «III» образовали изоляты Китая 2006-2021 гг.

В кладе «II» максимально близким изоляту SCV3008:Ad55 по значению ANI (99,9396) был изолят из Японии (MN654393). Отличия между геномами SCV3008:Ad55 и MN654393 выявили как в нетранслируемых областях генома, так и в генах структурных и неструктурных белков (табл. 2). Выявленные замены сопоставили с последовательностями других геномов выборки. Отметим, что сравнение областей ITR и ближайших к ним было возможно не для всех геномов. Из выявленных замен 4 были характерны для большинства изолятов клады «II», 4 были уникальными для генома японского изолята, 12 замен отличали изолят SCV3008:Ad55.

Замены в 4 рамках считывания были несинонимичными. Мутация в пептоне (Thr29Ala) была уникальна для изолята SCV3008:Ad55. Замены в ДНК-полимеразе (Asp566Lys) и в белке pV (Leu105Glu) отличали японский изолят MN654393. Мутация в белке L4 22К (His162Tyr) встречалась у 14 изолятов клады «II», включая SCV3008:Ad55 (табл. 2).

При анализе геномов мы обратили внимание на неоднородность размеров поли-А/поли-Т последовательностей в межгенных областях (табл. 3). Размеры областей 2-6, отмеченные в геноме SCV3008:Ad55, были характерны для многих геномов выборки HAdV-55. Область 1 с заменой A6G была уникальной для SCV3008:Ad55. Последовательности гомополимеров в геномах аденовирусов, называемые также микросателлитами, обратили на себя внимание исследователей при расследовании вспышек аденовирусной инфекции со смертельными исходами в воинских коллективах США в 2006-2007 гг. Полиморфизм длин локусов микросателлитов стал маркером высокого разрешения для отнесения HAdV-14 к одной вспышке [19]. Мы провели сравнение локусов микросателлитов у изолятов клады II «Egypt», включившей 17 изолятов разных континентов. Из данных таблицы 4 следует, что большинство изолятов клады было сходно по размеру микросателлитов всех 6 локусов. Максимальное количество локусов (4) отличало геномы изолятов Японии (MN654393) и России (SCV3008:Ad55), по 3 локусам отличался геном единственного изолята из Китая в кладе II (JX123027), по двум разным локусам – изоляты США (MN654392, 1997; MT513753, 2006), по одному – изоляты Сингапура (MN654388 и MN654389). Из 10 изолятов Египта в кладе II три имели по одному локусу отличий. Таким образом, при высоком консерватизме геномов HAdV-55 локусы микросателлитов, действительно, позволяют различить геномы вирусов в пределах одной клады.

Обсуждение

В данной работе впервые описан геном изолята HAdV-55 SCV3008:Ad55, выделенного на территории РФ. Отметим, что молекулярно-эпидемиологические геномные исследования аденовирусов в РФ, выполненные ранее, являются единичными и посвящены изучению M. caesari HAdV, возбудителей респираторных инфекций у детей [20]. Сбор сравнительной информации для геномных исследований затруднен низкой степенью внедрения методов генотипирования в лабораторную диагностику аденовирусной инфекции.

В России молекулярно-генетический подход, одобренный с 2010 г., применяют для эпидемиологического мониторинга аденовирусной инфекции и идентификации возбудителя до семейства Adenoviridae в Референс-центре по диагностике гриппа и ОРВИ на базе НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева, в Центре экологии и эпидемиологии гриппа НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и в опорных базах Роспотребнадзора. На особом контроле находятся аденовирусные инфекции у детей, которые также подлежат молекулярной диагностике, согласно клиническим рекомендациям [21]. Однако генотипирование HAdV не входит в перечень методов лабораторной диагностики.

ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control) не проводит планового наблюдения аденовирусной инфекции и фиксирует только вспышки заболевания, тогда как CDC разработал рекомендации по идентификации HAdV на основе амплификации нуклеиновых кислот и создал Национальную систему отчетности по типам аденовирусов (The National Adenovirus Type Reporting System, NATRS). По сведениям NATRS за 2017-2023 гг. HAdV шести генотипов являлись наиболее распространенными в США, среди которых HAdV-7 и HAdV-14 вида M. blackbeardi составили 13.4% и 7.8%, соответственно (https://www.cdc.gov/adenovirus/hcp/outbreaks/index.html). Японская национальная система эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями также проводит генотипирование аденовирусов, отмечая среди преобладающих M. blackbeardi HAdV-3, 7, 11, 34, 35, а среди минорных 14, 16, 55, 66, 68, 79 [22]. CDC Китая контролирует грипп и ОРВИ, но не публикует в открытой печати отчетов по генотипированию вирусов [23]. Таким образом, из национальных систем контроля учет HAdV-55 проводит только система эпиднадзора Японии.

Анализ научных публикаций за 2012-2025 гг., размещенных в PubMed, показал, что из 48 статей, упоминающих в ключевых словах HAdV-55, 39 (81%) опубликовано исследователями Китая, 7 – Южной Кореи, по одной – США и Сенегала. Такое соотношение публикаций подтверждает эндемичность HAdV-55 для Китая и Южной Кореи. Следует отметить, что из публикаций Южной Кореи только две исследуют инфекции HAdV-55 среди гражданского населения, остальные описывают вспышки заболевания ОРВИ, вызванной HAdV-55, среди воинского контингента [24]. Тему HAdV-55-инфекции среди военных продолжает публикация из США [25], посвященная анализу изолята вируса MW053454, выделенного от американского военнослужащего, находившегося в Южной Корее в 2019 г. Изолят MW053454 отличался от южнокорейского изолята KX494979 2016 г. одной синонимичной заменой. В нашем исследовании оба изолята вошли в кладу I «South Korea». В Сенегале с 2012 по 2015 гг. у пациентов с ОРВИ M. blackbeardi HAdV выявили в 9 случаях, среди которых отмечены HAdV-7, HAdV-55 и HAdV-11 [26]. Приведенные данные свидетельствуют, что генотипирование HAdV постепенно входит в лабораторную практику.

Учитывая вышесказанное, для проведения сравнительного исследования генома изолята SCV3008:Ad55, мы воспользовались данными GenBank, собрав выборку из 83 изолятов 1969-2022 гг. из 7 стран. Анализ выборки показал высокое сходство геномов HAdV-55, достигающее по показателю ANI 99.7-100%, что согласуется с данными других авторов, выполненных на меньшем количестве изолятов [27]. Вместе с тем, филогенетический анализ позволил разделить геномы выборки на клады, что свидетельствует о наличии гетерогенности даже при высокой гомологии. Клады I и III соответствовали географической принадлежности изолятов и показали эпидемическую связь как между изолятами Китая, так и изолятами Южной Кореи. Изоляты Египта 2000-2009 гг., страны удаленной от эндемичных по HAdV-55 территорий, кластеризовались с изолятами из пяти государств, в том числе Китая, что свидетельствует о распространении HAdV-55, чему способствуют процессы глобализации. Следует отметить, что в кладу II вошли преимущественно изоляты от гражданского населения. Исключение составили изоляты из Сингапура и Японии, полученные из образцов военных, заболевших ОРВИ [27].

Сравнительный геномный анализ выявил отличия изолята SVC3008:Ad55, а именно 12 точковых мутаций, распределенных по всему геному, из которых несинонимичной была замена в рамке считывания пентона L2 62.5 kDa, приводящая к замене T29A в N-конце белковой последовательности. Поскольку замена консервативна, она не сказывается на амфипатических свойствах N-концевой спирали белка и на способности мотива PPRY (42-45 а.о.) взаимодействовать с доменами WW клеточных убиквитинлигаз, что обеспечивает проникновение вируса в эукариотическую клетку, определяющее его инфекционность [28].

Дополнительную информацию о разнообразии близкородственных геномов изолятов клады II дал анализ полиморфизма длин микросателлитов (гомополимеров) шести локусов в нетранслируемых областях. Из 17 изолятов клады 10 изолятов имели отличие хотя бы по одному локусу. Изоляты Японии и России отличались от других изолятов клады по 4 локусам микросателлитов. Такой подход позволил различить даже изоляты Египта внутри двух регионов: Александрии (2000-2002 гг.) и Каира (2005-2009 гг.).

Таким образом, сравнительное геномное исследование изолятов HAdV-55, появившегося в результате рекомбинации HAdV-14 и HAdV-11, показало стабильность геномов с 1969 г. и медленное накопление мутаций как в транслируемых, так и в нетранслируемых областях, позволило выявить уникальные замены нового изолята SVC3008:Ad55. Полученная геномная информация заложила основу для дальнейшего мониторинга HAdV-55 в РФ и продемонстрировала информативность и значимость полногеномных исследований для наблюдения за аденовирусами. Поскольку аденовирусы подвержены рекомбинационной изменчивости, а горячие точки рекомбинации множественны (гены пентона, гексона, филамента (фибера), E1, E3 и E4) [29], именно полногеномное секвенирование эффективно в мониторинге возбудителей аденовирусной инфекции.