Significance of modern methods for laboratory detection of rabies agents and identification of the zoonose immunological survey

Abstract

Analytical review of modern methods of the laboratory detection of rabies and findings of our research indicate high sensitivity and specificity of methods for rapid identification of rabies agents, such as ELISA, reverse-transcriptase PCR for identification of the rabies virus genome, and rabies virus isolation in rat Gasserian ganglion neurinoma, as well as their potential to be included into the State Quality Standard for early detection of rabies in animals to reduce the infection risk among humans and animals.

Full Text

Бешенство, наносящее во всем мире наибольший экономический ущерб, занимает исключительно важное место в инфекционной патологии человека и животных. Заболевание регистрируют на всех континентах Земного шара, кроме Австралии, оно является объектом постоянного повышенного внимания международных организаций медицинского и ветеринарного профиля (WHO/ВОЗ, OIE/МЭБ). Ситуация по уровню заболеваемости бешенством в России остается крайне неблагополучной [1-3]. На протяжении 20 лет в России регистрируется самая высокая смертность среди развитых стран [4]. За 2008-2012 гг. зарегистрирован 61 летальный исход заболеваний людей бешенством [5]. Ежегодно в России антирабическую помощь получают от 250 до 450 тыс. человек, пострадавших от укусов животных, из которых около 25% составляют дети. Ситуация по гидрофобии в стране складывается на фоне неблагополучия по бешенству среди животных. По данным ФГБУ «Центр ветеринарии» лаборатории эпизоотологии ГНУ ВИЭВ им. Я.Р Коваленко, в 2012 г. и за 10 мес в 2013 г. в России зарегистрировано 5817 случаев бешенства среди животных. При проведении противоэпизоотических мероприя тий, а также назначении курса антирабических прививок пострадавшим от укусов животными немаловажное значение имеет своевременная и точная диагностика [6]. Необходимость постоянного контроля за состоянием природных очагов бешенства и расширение работ за последние годы по оральной вакцинации диких животных требуют совершенствования экспресс-методов выделения и индикации вируса. Диагностику бешенства проводят на основании комплекса эпизоотологических, клинических данных и лабораторных методов исследования. Окончательный диагноз может быть поставлен только лабораторным методом. Методы лабораторной диагностики бешенства основаны либо на обнаружении цитоплазматических включений или специфического антигена (световая и люминесцентная микроскопия, реакция диффузионной преципитации, иммуноферментный анализ (ИФА) и др.), либо на выделении рабического вируса (биопроба на лабораторных животных или в культуре клеток), а также на обнаружении генома возбудителя бешенства [7]. Диагноз на бешенство ставят при получении положительных результатов хотя бы по одному из методов лабораторного исследования. Для корреспонденции: Гулюкин Алексей Михайлович, канд. мед. наук, plych@mail.ru 5 Методы обнаружения специфического антигена вируса бешенства Световая микроскопия. Сущность метода заключается в выявлении в клетках нервной ткани специфических цитоплазматических включений - телец Бабеша-Негри. Лабораторная диагностика с помощью обнаружения телец Бабеша-Негри описана во многих обзорах и руководствах по бешенству [8-14 и др.] Общепризнанно, что тельца Бабеша-Негри специфичны для бешенства, и их присутствие является достоверным диагностическим признаком. Выявление телец Бабеша-Негри проводят методом световой микроскопии с применением мазков-отпечатков ткани мозга на предметном стекле и окрашивания с помощью красок по Селлерсу, Гимзе и Манну в соответствии с ГОСТом 26075-84 [10]. Одним из преимуществ метода является его экспрессность (45-60 мин). Вместе с тем, по данным ряда исследователей [11], тельца Бабеша-Негри чаще обнаруживают в стадии выраженной клинической картины болезни, поэтому у вынужденно убитых животных они могут отсутствовать или присутствовать в виде единичных мелких включений. Кроме того, метод световой микроскопии обладает низкой чувствительностью. Так, по данным некоторых авторов [13], тельца Бабеша-Негри выявляют лишь в 65-85% случаев бешенства, по данным других [6], -лишь в 40%. Частота выявления телец Бабеша-Негри зависит от продолжительности инкубационного периода, вида микроорганизмов и свойств штамма вируса бешенства, поэтому их отсутствие не является отрицательным ответом, и материал исследуют в других тестах (МФА; РДП; биопроба). Реакция диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП) разработана и используется для лабораторной диагностики бешенства [10]. В нашей стране выпускается «Набор компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации (РДП)» (производитель - ФгбУ ВНИИТиБП, г. Щелково). Этим методом допускается исследовать несвежий патологический материал, контаминированный бактериальной микрофлорой. Одним из преимуществ метода является его экспрессность (45-60 мин). Вместе с тем результаты РДП учитывают через 6, 24, 48 ч после ее постановки. Следует отметить, что, по данным ряда авторов [8, 15], РДП является низкочувствительным тестом, выявление вирусного антигена в исследуемом материале составляет от 45 до 70%. Реакция положительна лишь при достаточной концентрации вирусного антигена, составляющей не менее 4,5 lg LD50 [13], и при отрицательных результатах РДП нельзя исключить бешенство. Кроме того, материал, консервированный глицерином, формалином и другими средствами, для данной реакции не пригоден. Таким образом, РДП нельзя считать абсолютно надежным методом. Метод флюоресцирующих антител (МФА) является наиболее точным из всех существующих методов микроскопической диагностики бешенства и признан высокочувствительным, специфичным и экспрессным методом. Наиболее широкое распространение получил прямой вариант МФА [6-9]. Порог чувствительности МФА 3,8 lg LD/мл, время анализа 5-6 ч [6]. Сообщается о возможности прижизненного выявления антигена вируса бешенства по МФА в эпителиальных клетках роговицы (корнеальная проба) и биоптатах кожи больных бешенством [16-18]. В частности, Н.А. Ковалевым и А.С. Шашенько (1970) [17] в опытах на экспериментально зараженных овцах и кроликах поставили положительный диагноз за 3-5 дней до появления характерных признаков болезни; Н.А. Хисматуллина и соавт. (2003) [18] при исследовании отпечатков роговицы у больной Б. по МФА положительный диагноз поставили за 6 сут до смерти пострадавшей. Полученные результаты подтвердили клинически поставленный диагноз гидрофобии. С помощью МФА окончательный диагноз на бешенство может быть поставлен уже на 4-8-е сутки после заражения мышей исследуемым материалом [13]. Вместе с тем для исследований по МФА пригоден только свежий или свежезамороженный материал. Кроме того, нельзя исключить неспецифическое свечение при исследовании материала, консервированного в глицерине [6, 13]. Многие ученые считают, что МФА является высокочувствительным методом, и при высококвалифицированном выполнении полученные результаты совпадают с данными биологической пробы до 98,7% [6, 8, 13, 15]. В литературе имеются сообщения о применении МФА на основе моноклональных антител (МКА) к нуклео-протеину вируса бешенства [19, 20], что повышает результативность МФА. В РФ МФА является одним из основных тестов при диагностике бешенства и выполняется с использованием коммерческих наборов «Флюоресцирующий антира-бический глобулин» на основе поликлональных антител производства ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ (г. Казань) [6] и ФГБУ ВНИТИБП (г. Щелково) [21]. Методы выделения вируса бешенства биологическая проба - одна из наиболее чувствительных и достоверных методов лабораторной диагностики бешенства [10]. Биопробу считают положительной, если в препаратах из мозга зараженных мышей обнаруживают тельца Бабеша-Негри или выявляют рабический антиген по МФА или в РДП. Недостатками биопробы являются продолжительность исследования (в отрицательных случаях до 30 дней), потенциальная опасность выноса возбудителя, а также невозможность использования разложившегося материала. Кроме того, постановка биопробы неэкономична, требует особого виварного помещения и обслуживающего персонала [6]. Выделение вируса бешенства в культуре клеток. Реальная возможность использования систем культур тканей для диагностики бешенства появилась после установления высокой чувствительности клеток нейро-бластомы мыши, в частности клона N 18, а также клеток CER, BHK-21 к уличному вирусу бешенства [22, 23]. Установлена перспективность использования перевиваемой культуры клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1) для выделения уличного вируса бешенства из патматериала с его последующей идентификацией с помощью МФА [6, 24, 25]. Время анализа 2-3 сут после заражения культуры клеток НГУК-1. Антиген вируса бешенства выявляют в цитоплазме клеток НГУК-1 в виде ярких желто-зеленых гранул, разной формы и величины - от едва заметных до имеющих 15-20 мкм в диаметре, иногда отмечают большое количество мелких желто-зеленых частиц (размером до 5 мкм) округлой и овальной формы. Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток НГУК-1 авторы рассматривают как возможную замену биопробы на белых мышах, которая требует наличия вивария, обслуживающего персонала и продолжительного наблюдения за подопытными животными (до 30 сут согласно ГОСТа 26 075). Метод иммуноферментного анализа (ИФА) имеет ряд преимуществ перед другими серологическими тестами: высокую чувствительность, стабильность соединений, меченных ферментами; кроме того, оборудование для измерения продукта иммуноферментной реакции отличается простотой и невысокой стоимостью, анализ 6 может быть легко автоматизирован, что позволяет применять его для проведения массовых обследований [81]. Порог чувствительности ИФА составляет 3,3 Ig LD^/мл. а время анализа 5-6 ч [6, 25]. В литературе имеются сообщения о применении ИФА для индикации вируса бешенства в культуральной жидкости или мозге экспериментально и спонтанно зараженных животных [25, 26]. Авторы показали, что ИФА может быть использован и как экспресс-способ для постановки предварительного диагноза, и в сочетании с МФА и биопробой, что расширяет возможности лабораторной диагностики бешенства. В практике часто применяют так называемый сэндвич-вариант ИФА, преимуществом которого перед конкурентным методом являются большая чувствительность и возможность использования неочищенных антигенов [25]. Одновременное применение двух экспресс-методов - ИФА и МФА обеспечивает более надежный диагноз. При этом визуальный учет результатов ИФА не требует специальной аппаратуры, что позволяет использовать его в полевых условиях и лабораториях, не оснащенных люминесцентными микроскопами [6]. Итак, можно утверждать, что метод ИФА перспективен для диагностики бешенства. В регионах РФ применяют «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства методом иммуноферментного анализа (ИФА)», разработанный и выпускаемый ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», утвержденный Россельхознадзором 03.03.2008 г. и сертифицированный в ФГБУ «ВГнКи» (Москва) (6, 9). Идентификация штаммов рабического вируса с помощью МкА. Перспективным в диагностике бешенства является и применение МКА, обладающих по сравнению с поликлональными антисыворотками моноспецифичностью и позволяющими проводить идентификацию штаммов рабического вируса, в частности дифференцировать серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11 и 12 вирусов группы бешенства [27-32]. В настоящее время МКА успешно применяют для диагностики, антигенного анализа лиссавирусов, селекции аттенуированных и высокоиммуногенных мутантов вакцинного вируса, картирования антигенной структуры рабического гликопротеина, идентификации эпизоотических вариантов полевых штаммов, а также для дифференциации полевых и вакцинных вирусов при широких опытах оральной иммунизации [32-36]. Использование МКА позволяет проводить также оценку антирабических вакцин по выявлению тех эпитопов гликопротеина (и других структурных белков) вируса бешенства, которые участвуют в формировании иммунного ответа организма [15]. В литературе имеются данные о применении МКА в качестве терапевтического средства при экспериментальном бешенстве [37]. В нашей стране изучению антигенных особенностей вирусов бешенства, циркулирующих на территории России, занимались М.А. Селимов [14], М.А. Селимов и со-авт. [31, 38-41], А.Д. Ботвинкин [34], А.Д. Ботвинкин и соавт. [33, 35], С.В. Грибенча [37], И.В. Кузьмин и соавт. [42]. Впервые в стране авторы использовали МКА к ну-клеопротеиду панелей института Wistar (Филадельфия, США) [27], Центральной ветеринарной лаборатории Великобритании (CVL, Уэйбридж, Великобритания) [30] и Центра вирусных болезней животных (Тюбенген, Германия) [28]. А.Д. Ботвинкин и соавт. [33, 35] установили, что на территории России среди наземных млекопитающих распространены штаммы вирусов только серотипа 1. Эти же авторы на территории страны обнаружили среди летучих мышей (рукокрылых) циркуляцияю вирусов се-ротипов 1 и 5. Серотип 5 в настоящее время соответствует виду European bat lyssavirus-1 (EBLV-1, лиссавирус европейских летучих мышей 1-го типа). В России вирус этого генотипа был впервые выделен в 1985 г. от девочки, укушенной летучей мышью, в Белгороде [41]. В 2003 г. среди рукокрылых России была установлена циркуляция двух новых вирусов с оригинальными генотипами -“Иркут” (Irkut virus), выделенный А.Д. Ботвинкиным от трубконоса сибирского Murina leucogaster в Восточной Сибири (Иркутск), и в Западной Сибири - Кавказский лиссавирус летучих мышей (West Caucasian bat virus), обнаруженный Е.А. Полещук и соавт. и А.Д. Ботвинкиным и соавт. [32]. В 2007 г. в Приморском крае от погибшей женщины, укушенной летучей мышью, выделен штамм “Озерное”, аналогичный вирусу Irkut [43]. Это второй случай гибели людей от бешенства после укуса летучими мышами в стране и третий случай выделения лиссавирусов не серотипа 1 на территории России. Среди представителей вирусов серотипа 1, циркулирующих среди наземных млекопитающих в России, выявлены девять антигенных вариантов [33-35]. При этом связь с каким-либо специфическим хозяином генетическое подтверждение не получила. Методы обнаружения генома вируса бешенства. Для обнаружения генома вируса бешенства используют два метода: дот-гибридизацию и обратно-траскриптазную полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР). Дот-гибридизация. Сущность метода дот-гибридизации заключается в выявлении и идентификации РНК вируса с использованием специфических ДНК-зондов, в качестве которых используют меченный Р32 фаг М несущий вставки размером 200-400 п.о., комплементарные различным генам вакцинного штамма вируса бешенства (штамм Р"У), или рекомбинантную плазмиду, содержащую 96% кодирующей последовательности гена нуклеопротеина вируса бешенства (штамм ERA). Гибридизация in situ может применяться для ретроспективной диагностики в тех случаях, когда выявление специфического антигена не всегда дает четкие результаты и невозможно выделить вирус в культуре клеток или на лабораторных животных [9]. Полимеразная цепная реакция. Одним из широко используемых методов детекции РНК вируса бешенства является ОТ-ПЦР [44-51]. С помощью ПЦР диагноз можно поставить до 5 ч. Кроме того, применение автоматического секвенирования позволяет получить характеристику изолятов в течение 16 ч. В большинстве случаев ПЦР применяют для штам-мовой дифференциации вируса бешенства [45, 47-49] и для идентификации полевых изолятов вируса бешенства [44-46]. Авторы отмечают высокую чувствительность этой реакции, которая составила 1-10 LD^/мл. Установлено применение ОТ-ПЦР для прижизненного обнаружения вирусной РНК в слюне, спинномозговой жидкости инфицированных животных [50] и биоптате слюнной железы [51]. С помощью молекулярно-генетических исследований [52-54] показано, что на территории России в популяциях наземных млекопитающих циркулируют две основные группы вирусов группы бешенства. Первая - это группа арктических вирусов, в которой выделяют две подгруппы: собственно арктических А и арктически подобных Б. Ко второй группе относят широко распространенные вирусы-космополиты, описанные H. Bourhy и соавт. [48]. На территории России эта группа представлена четырьмя подгруппами (цит. и далее [32]). Описаны филогенетические подгруппы вирусов бешенства, соответствующие определенным географическим террито 7 риям [49, 52-54]. При этом связь с каким-либо одним специфическим хозяином генетическое подтверждение не получила. Реакция нейтрализации. Для идентификации возбудителя бешенства, а также для количественной оценки и определения активности антирабической сыворотки и иммуноглобулина используют реакцию нейтрализации (РН). РН на белых мышах - достаточно трудоемкий и длительный по времени метод [55]. Для контроля уровня поствакцинальных антирабических антител ВОЗ рекомендует применять РН в культуре клеток [56]. Заключение Применяемые в ветеринарной практике традиционные методы и средства лабораторной диагностики бешенства согласно существующему ГОСТу 26 075-84 имеют определенные недостатки: низкую чувствительность и недостаточную специфичность (световая микроскопия), длительность получения результатов экспертиз и трудоемкость (биопроба на белых мышах). В связи с этим, перспективно включение в государственный стандарт эффективных экспресс-методов лабораторной диагностики бешенства, таких как ИФА и выделение возбудителя бешенства в перевиваемых культурах клеток нейробла-стомы и НГУК-1, которые отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, а также сокращением времени на проведение исследований экспертизного материала. Так, порог чувствительности метода ИФА составляет 3,3 lg LD/мл, время анализа проб - 5-6 ч. Время анализа проб методом выделения возбудителя бешенства в культуре клеток НГУК-1 составляет 24-72 ч против 28-30 сут при постановке биопробы согласно действующему ГОСТу при совпадении результатов анализа с последней в 100% случаев, по МФА и ИФА - в 97,4 и 98,4% соответственно. При этом одновременное проведение исследований патологического материала по МФА и ИФА позволят получить более достоверный результат. Выделение возбудителя бешенства в культуре клеток НГУК-1 можно рассматривать как возможную замену биопробы на белых мышах. Кроме того, по данным многих авторов [6, 26], методом ИФА можно исследовать гнилостный патологический материал и консервированный глицерином, т. е. в тех случаях, когда исследования по МФА не представляются возможными. Вместе с тем научно-практический интерес представляет метод обнаружения генома вируса бешенства - ОТ-ПЦР, с помощью которого диагноз можно поставить до 5 ч, а применение автоматического секвенирования позволяет получить характеристику изолятов в течение 16 ч [44-51]. Авторы отмечают высокую чувствительность этой реакции, составляющую 1-10 LD/мл. Необходимо отметить также перспективность применения ОТ-ПЦР для штаммовой дифференциации [65, 68], в том числе для дифференциации вакцинных штаммов от эпизоотических изолятов вируса бешенства, выделенных на территориях проведения оральной антирабической вакцинации дикой фауны, а также для прижизненной диагностики данного зооноза. Таким образом, данные литературы, а также результаты собственных исследований свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности таких экспресс-методов идентификации возбудителя бешенства, как ИФА, обнаружение генома вируса бешенства - ОТ-ПЦР, выделение рабического вируса в культуре клеток нейро-бластомы или НГУК-1, а также об их перспективности для включения в государственный стандарт, что обеспечит раннюю диагностику бешенства у животных и снизит риск заболевания животных и людей.