Значимость современных методов лабораторной диагностики и идентификации возбудителя бешенства для иммунологического мониторинга данного зооноза

Полный текст

Бешенство, наносящее во всем мире наибольший экономический ущерб, занимает исключительно важное место в инфекционной патологии человека и животных. Заболевание регистрируют на всех континентах Земного шара, кроме Австралии, оно является объектом постоянного повышенного внимания международных организаций медицинского и ветеринарного профиля (WHO/ВОЗ, OIE/МЭБ). Ситуация по уровню заболеваемости бешенством в России остается крайне неблагополучной [1-3]. На протяжении 20 лет в России регистрируется самая высокая смертность среди развитых стран [4]. За 2008-2012 гг. зарегистрирован 61 летальный исход заболеваний людей бешенством [5]. Ежегодно в России антирабическую помощь получают от 250 до 450 тыс. человек, пострадавших от укусов животных, из которых около 25% составляют дети. Ситуация по гидрофобии в стране складывается на фоне неблагополучия по бешенству среди животных. По данным ФГБУ «Центр ветеринарии» лаборатории эпизоотологии ГНУ ВИЭВ им. Я.Р Коваленко, в 2012 г. и за 10 мес в 2013 г. в России зарегистрировано 5817 случаев бешенства среди животных. При проведении противоэпизоотических мероприя тий, а также назначении курса антирабических прививок пострадавшим от укусов животными немаловажное значение имеет своевременная и точная диагностика [6]. Необходимость постоянного контроля за состоянием природных очагов бешенства и расширение работ за последние годы по оральной вакцинации диких животных требуют совершенствования экспресс-методов выделения и индикации вируса. Диагностику бешенства проводят на основании комплекса эпизоотологических, клинических данных и лабораторных методов исследования. Окончательный диагноз может быть поставлен только лабораторным методом. Методы лабораторной диагностики бешенства основаны либо на обнаружении цитоплазматических включений или специфического антигена (световая и люминесцентная микроскопия, реакция диффузионной преципитации, иммуноферментный анализ (ИФА) и др.), либо на выделении рабического вируса (биопроба на лабораторных животных или в культуре клеток), а также на обнаружении генома возбудителя бешенства [7]. Диагноз на бешенство ставят при получении положительных результатов хотя бы по одному из методов лабораторного исследования. Для корреспонденции: Гулюкин Алексей Михайлович, канд. мед. наук, plych@mail.ru 5 Методы обнаружения специфического антигена вируса бешенства Световая микроскопия. Сущность метода заключается в выявлении в клетках нервной ткани специфических цитоплазматических включений - телец Бабеша-Негри. Лабораторная диагностика с помощью обнаружения телец Бабеша-Негри описана во многих обзорах и руководствах по бешенству [8-14 и др.] Общепризнанно, что тельца Бабеша-Негри специфичны для бешенства, и их присутствие является достоверным диагностическим признаком. Выявление телец Бабеша-Негри проводят методом световой микроскопии с применением мазков-отпечатков ткани мозга на предметном стекле и окрашивания с помощью красок по Селлерсу, Гимзе и Манну в соответствии с ГОСТом 26075-84 [10]. Одним из преимуществ метода является его экспрессность (45-60 мин). Вместе с тем, по данным ряда исследователей [11], тельца Бабеша-Негри чаще обнаруживают в стадии выраженной клинической картины болезни, поэтому у вынужденно убитых животных они могут отсутствовать или присутствовать в виде единичных мелких включений. Кроме того, метод световой микроскопии обладает низкой чувствительностью. Так, по данным некоторых авторов [13], тельца Бабеша-Негри выявляют лишь в 65-85% случаев бешенства, по данным других [6], -лишь в 40%. Частота выявления телец Бабеша-Негри зависит от продолжительности инкубационного периода, вида микроорганизмов и свойств штамма вируса бешенства, поэтому их отсутствие не является отрицательным ответом, и материал исследуют в других тестах (МФА; РДП; биопроба). Реакция диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП) разработана и используется для лабораторной диагностики бешенства [10]. В нашей стране выпускается «Набор компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации (РДП)» (производитель - ФгбУ ВНИИТиБП, г. Щелково). Этим методом допускается исследовать несвежий патологический материал, контаминированный бактериальной микрофлорой. Одним из преимуществ метода является его экспрессность (45-60 мин). Вместе с тем результаты РДП учитывают через 6, 24, 48 ч после ее постановки. Следует отметить, что, по данным ряда авторов [8, 15], РДП является низкочувствительным тестом, выявление вирусного антигена в исследуемом материале составляет от 45 до 70%. Реакция положительна лишь при достаточной концентрации вирусного антигена, составляющей не менее 4,5 lg LD50 [13], и при отрицательных результатах РДП нельзя исключить бешенство. Кроме того, материал, консервированный глицерином, формалином и другими средствами, для данной реакции не пригоден. Таким образом, РДП нельзя считать абсолютно надежным методом. Метод флюоресцирующих антител (МФА) является наиболее точным из всех существующих методов микроскопической диагностики бешенства и признан высокочувствительным, специфичным и экспрессным методом. Наиболее широкое распространение получил прямой вариант МФА [6-9]. Порог чувствительности МФА 3,8 lg LD/мл, время анализа 5-6 ч [6]. Сообщается о возможности прижизненного выявления антигена вируса бешенства по МФА в эпителиальных клетках роговицы (корнеальная проба) и биоптатах кожи больных бешенством [16-18]. В частности, Н.А. Ковалевым и А.С. Шашенько (1970) [17] в опытах на экспериментально зараженных овцах и кроликах поставили положительный диагноз за 3-5 дней до появления характерных признаков болезни; Н.А. Хисматуллина и соавт. (2003) [18] при исследовании отпечатков роговицы у больной Б. по МФА положительный диагноз поставили за 6 сут до смерти пострадавшей. Полученные результаты подтвердили клинически поставленный диагноз гидрофобии. С помощью МФА окончательный диагноз на бешенство может быть поставлен уже на 4-8-е сутки после заражения мышей исследуемым материалом [13]. Вместе с тем для исследований по МФА пригоден только свежий или свежезамороженный материал. Кроме того, нельзя исключить неспецифическое свечение при исследовании материала, консервированного в глицерине [6, 13]. Многие ученые считают, что МФА является высокочувствительным методом, и при высококвалифицированном выполнении полученные результаты совпадают с данными биологической пробы до 98,7% [6, 8, 13, 15]. В литературе имеются сообщения о применении МФА на основе моноклональных антител (МКА) к нуклео-протеину вируса бешенства [19, 20], что повышает результативность МФА. В РФ МФА является одним из основных тестов при диагностике бешенства и выполняется с использованием коммерческих наборов «Флюоресцирующий антира-бический глобулин» на основе поликлональных антител производства ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ (г. Казань) [6] и ФГБУ ВНИТИБП (г. Щелково) [21]. Методы выделения вируса бешенства биологическая проба - одна из наиболее чувствительных и достоверных методов лабораторной диагностики бешенства [10]. Биопробу считают положительной, если в препаратах из мозга зараженных мышей обнаруживают тельца Бабеша-Негри или выявляют рабический антиген по МФА или в РДП. Недостатками биопробы являются продолжительность исследования (в отрицательных случаях до 30 дней), потенциальная опасность выноса возбудителя, а также невозможность использования разложившегося материала. Кроме того, постановка биопробы неэкономична, требует особого виварного помещения и обслуживающего персонала [6]. Выделение вируса бешенства в культуре клеток. Реальная возможность использования систем культур тканей для диагностики бешенства появилась после установления высокой чувствительности клеток нейро-бластомы мыши, в частности клона N 18, а также клеток CER, BHK-21 к уличному вирусу бешенства [22, 23]. Установлена перспективность использования перевиваемой культуры клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1) для выделения уличного вируса бешенства из патматериала с его последующей идентификацией с помощью МФА [6, 24, 25]. Время анализа 2-3 сут после заражения культуры клеток НГУК-1. Антиген вируса бешенства выявляют в цитоплазме клеток НГУК-1 в виде ярких желто-зеленых гранул, разной формы и величины - от едва заметных до имеющих 15-20 мкм в диаметре, иногда отмечают большое количество мелких желто-зеленых частиц (размером до 5 мкм) округлой и овальной формы. Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток НГУК-1 авторы рассматривают как возможную замену биопробы на белых мышах, которая требует наличия вивария, обслуживающего персонала и продолжительного наблюдения за подопытными животными (до 30 сут согласно ГОСТа 26 075). Метод иммуноферментного анализа (ИФА) имеет ряд преимуществ перед другими серологическими тестами: высокую чувствительность, стабильность соединений, меченных ферментами; кроме того, оборудование для измерения продукта иммуноферментной реакции отличается простотой и невысокой стоимостью, анализ 6 может быть легко автоматизирован, что позволяет применять его для проведения массовых обследований [81]. Порог чувствительности ИФА составляет 3,3 Ig LD^/мл. а время анализа 5-6 ч [6, 25]. В литературе имеются сообщения о применении ИФА для индикации вируса бешенства в культуральной жидкости или мозге экспериментально и спонтанно зараженных животных [25, 26]. Авторы показали, что ИФА может быть использован и как экспресс-способ для постановки предварительного диагноза, и в сочетании с МФА и биопробой, что расширяет возможности лабораторной диагностики бешенства. В практике часто применяют так называемый сэндвич-вариант ИФА, преимуществом которого перед конкурентным методом являются большая чувствительность и возможность использования неочищенных антигенов [25]. Одновременное применение двух экспресс-методов - ИФА и МФА обеспечивает более надежный диагноз. При этом визуальный учет результатов ИФА не требует специальной аппаратуры, что позволяет использовать его в полевых условиях и лабораториях, не оснащенных люминесцентными микроскопами [6]. Итак, можно утверждать, что метод ИФА перспективен для диагностики бешенства. В регионах РФ применяют «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства методом иммуноферментного анализа (ИФА)», разработанный и выпускаемый ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», утвержденный Россельхознадзором 03.03.2008 г. и сертифицированный в ФГБУ «ВГнКи» (Москва) (6, 9). Идентификация штаммов рабического вируса с помощью МкА. Перспективным в диагностике бешенства является и применение МКА, обладающих по сравнению с поликлональными антисыворотками моноспецифичностью и позволяющими проводить идентификацию штаммов рабического вируса, в частности дифференцировать серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11 и 12 вирусов группы бешенства [27-32]. В настоящее время МКА успешно применяют для диагностики, антигенного анализа лиссавирусов, селекции аттенуированных и высокоиммуногенных мутантов вакцинного вируса, картирования антигенной структуры рабического гликопротеина, идентификации эпизоотических вариантов полевых штаммов, а также для дифференциации полевых и вакцинных вирусов при широких опытах оральной иммунизации [32-36]. Использование МКА позволяет проводить также оценку антирабических вакцин по выявлению тех эпитопов гликопротеина (и других структурных белков) вируса бешенства, которые участвуют в формировании иммунного ответа организма [15]. В литературе имеются данные о применении МКА в качестве терапевтического средства при экспериментальном бешенстве [37]. В нашей стране изучению антигенных особенностей вирусов бешенства, циркулирующих на территории России, занимались М.А. Селимов [14], М.А. Селимов и со-авт. [31, 38-41], А.Д. Ботвинкин [34], А.Д. Ботвинкин и соавт. [33, 35], С.В. Грибенча [37], И.В. Кузьмин и соавт. [42]. Впервые в стране авторы использовали МКА к ну-клеопротеиду панелей института Wistar (Филадельфия, США) [27], Центральной ветеринарной лаборатории Великобритании (CVL, Уэйбридж, Великобритания) [30] и Центра вирусных болезней животных (Тюбенген, Германия) [28]. А.Д. Ботвинкин и соавт. [33, 35] установили, что на территории России среди наземных млекопитающих распространены штаммы вирусов только серотипа 1. Эти же авторы на территории страны обнаружили среди летучих мышей (рукокрылых) циркуляцияю вирусов се-ротипов 1 и 5. Серотип 5 в настоящее время соответствует виду European bat lyssavirus-1 (EBLV-1, лиссавирус европейских летучих мышей 1-го типа). В России вирус этого генотипа был впервые выделен в 1985 г. от девочки, укушенной летучей мышью, в Белгороде [41]. В 2003 г. среди рукокрылых России была установлена циркуляция двух новых вирусов с оригинальными генотипами -“Иркут” (Irkut virus), выделенный А.Д. Ботвинкиным от трубконоса сибирского Murina leucogaster в Восточной Сибири (Иркутск), и в Западной Сибири - Кавказский лиссавирус летучих мышей (West Caucasian bat virus), обнаруженный Е.А. Полещук и соавт. и А.Д. Ботвинкиным и соавт. [32]. В 2007 г. в Приморском крае от погибшей женщины, укушенной летучей мышью, выделен штамм “Озерное”, аналогичный вирусу Irkut [43]. Это второй случай гибели людей от бешенства после укуса летучими мышами в стране и третий случай выделения лиссавирусов не серотипа 1 на территории России. Среди представителей вирусов серотипа 1, циркулирующих среди наземных млекопитающих в России, выявлены девять антигенных вариантов [33-35]. При этом связь с каким-либо специфическим хозяином генетическое подтверждение не получила. Методы обнаружения генома вируса бешенства. Для обнаружения генома вируса бешенства используют два метода: дот-гибридизацию и обратно-траскриптазную полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР). Дот-гибридизация. Сущность метода дот-гибридизации заключается в выявлении и идентификации РНК вируса с использованием специфических ДНК-зондов, в качестве которых используют меченный Р32 фаг М несущий вставки размером 200-400 п.о., комплементарные различным генам вакцинного штамма вируса бешенства (штамм Р"У), или рекомбинантную плазмиду, содержащую 96% кодирующей последовательности гена нуклеопротеина вируса бешенства (штамм ERA). Гибридизация in situ может применяться для ретроспективной диагностики в тех случаях, когда выявление специфического антигена не всегда дает четкие результаты и невозможно выделить вирус в культуре клеток или на лабораторных животных [9]. Полимеразная цепная реакция. Одним из широко используемых методов детекции РНК вируса бешенства является ОТ-ПЦР [44-51]. С помощью ПЦР диагноз можно поставить до 5 ч. Кроме того, применение автоматического секвенирования позволяет получить характеристику изолятов в течение 16 ч. В большинстве случаев ПЦР применяют для штам-мовой дифференциации вируса бешенства [45, 47-49] и для идентификации полевых изолятов вируса бешенства [44-46]. Авторы отмечают высокую чувствительность этой реакции, которая составила 1-10 LD^/мл. Установлено применение ОТ-ПЦР для прижизненного обнаружения вирусной РНК в слюне, спинномозговой жидкости инфицированных животных [50] и биоптате слюнной железы [51]. С помощью молекулярно-генетических исследований [52-54] показано, что на территории России в популяциях наземных млекопитающих циркулируют две основные группы вирусов группы бешенства. Первая - это группа арктических вирусов, в которой выделяют две подгруппы: собственно арктических А и арктически подобных Б. Ко второй группе относят широко распространенные вирусы-космополиты, описанные H. Bourhy и соавт. [48]. На территории России эта группа представлена четырьмя подгруппами (цит. и далее [32]). Описаны филогенетические подгруппы вирусов бешенства, соответствующие определенным географическим террито 7 риям [49, 52-54]. При этом связь с каким-либо одним специфическим хозяином генетическое подтверждение не получила. Реакция нейтрализации. Для идентификации возбудителя бешенства, а также для количественной оценки и определения активности антирабической сыворотки и иммуноглобулина используют реакцию нейтрализации (РН). РН на белых мышах - достаточно трудоемкий и длительный по времени метод [55]. Для контроля уровня поствакцинальных антирабических антител ВОЗ рекомендует применять РН в культуре клеток [56]. Заключение Применяемые в ветеринарной практике традиционные методы и средства лабораторной диагностики бешенства согласно существующему ГОСТу 26 075-84 имеют определенные недостатки: низкую чувствительность и недостаточную специфичность (световая микроскопия), длительность получения результатов экспертиз и трудоемкость (биопроба на белых мышах). В связи с этим, перспективно включение в государственный стандарт эффективных экспресс-методов лабораторной диагностики бешенства, таких как ИФА и выделение возбудителя бешенства в перевиваемых культурах клеток нейробла-стомы и НГУК-1, которые отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, а также сокращением времени на проведение исследований экспертизного материала. Так, порог чувствительности метода ИФА составляет 3,3 lg LD/мл, время анализа проб - 5-6 ч. Время анализа проб методом выделения возбудителя бешенства в культуре клеток НГУК-1 составляет 24-72 ч против 28-30 сут при постановке биопробы согласно действующему ГОСТу при совпадении результатов анализа с последней в 100% случаев, по МФА и ИФА - в 97,4 и 98,4% соответственно. При этом одновременное проведение исследований патологического материала по МФА и ИФА позволят получить более достоверный результат. Выделение возбудителя бешенства в культуре клеток НГУК-1 можно рассматривать как возможную замену биопробы на белых мышах. Кроме того, по данным многих авторов [6, 26], методом ИФА можно исследовать гнилостный патологический материал и консервированный глицерином, т. е. в тех случаях, когда исследования по МФА не представляются возможными. Вместе с тем научно-практический интерес представляет метод обнаружения генома вируса бешенства - ОТ-ПЦР, с помощью которого диагноз можно поставить до 5 ч, а применение автоматического секвенирования позволяет получить характеристику изолятов в течение 16 ч [44-51]. Авторы отмечают высокую чувствительность этой реакции, составляющую 1-10 LD/мл. Необходимо отметить также перспективность применения ОТ-ПЦР для штаммовой дифференциации [65, 68], в том числе для дифференциации вакцинных штаммов от эпизоотических изолятов вируса бешенства, выделенных на территориях проведения оральной антирабической вакцинации дикой фауны, а также для прижизненной диагностики данного зооноза. Таким образом, данные литературы, а также результаты собственных исследований свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности таких экспресс-методов идентификации возбудителя бешенства, как ИФА, обнаружение генома вируса бешенства - ОТ-ПЦР, выделение рабического вируса в культуре клеток нейро-бластомы или НГУК-1, а также об их перспективности для включения в государственный стандарт, что обеспечит раннюю диагностику бешенства у животных и снизит риск заболевания животных и людей.

Список литературы

Дополнительные файлы