The taxonomy of the Baku virus (BAKV; Reoviridae, Orbivirus) isolated from the birds obligate parasites Argasidae ticks in Azerbaijan, Turkmenistan, and Uzbekistan

Full Text

Таблица 1 Изоляция штаммов вируса Баку (BAKV) из аргасовых клещей (Acari: Argasidae) в гнездовых колониях птиц [10] Регион изоляции Экосистема Источник изоляции* Количество штаммов Азербайджан, о. Глинянный Бакинского архипелага в Каспийском море 49°30' в.д. 39°50' с.ш. Гнездовья серебристых чаек Larus argentatus; сухие субтропики, полупустынный ландшафт Клещи Ornithodoros capensis Neumann, 1901; зараженность клещей 1:120 14 (1970 г.) 20 (1971 г.) 25 (1973 г.) Всего 59 Гнездовья серебристых чаек Larus argentatus, речных крачек Sterna hirundo; сухие субтропики, полупустынный ландшафт Клещи O. coniceps Canestrini, 1980; зараженность клещей 1:1500 Туркменистан, острова в заливе Кара-Богаз-Гол 53° в.д. 35° с.ш. 1 (1972 г.) 2 (1973 г.) Всего 3 Клещи O. coniceps Canestrini, 1980; зараженность клещей 1:130 Узбекистан, окр. г. Паркент, Ташкентская обл.; предгорья Чаткальского хребта, Западный Тянь-Шань 69°45' в.д. 40°40' с.ш. Примечание. * - 1 штамм был изолирован от клещей Hyalomma marginatum, снятых с коров в Исмаилинском районе Азербайджана в 1973 г. Гнездовья Туркменского скалистого голубя Columba livia neglecta; сухие субтропики, полупустынный ландшафт 1 (1972 г.) 2 (1973 г.) 1 (1974 г.) 2 (1975 г. Всего 6 Введение Вирус Баку (Baku virus, BAKV) был выделен из клещей Ornithodoros capensis Neumann, 1901 (Acari: Argasidae), собранных весной и летом 1970 г. в гнездовье серебристых чаек Larus argentatus на островах Бакинского архипелага в Каспийском море (2,5 км от берега в районе г. Алат, Азербайджан) при выполнении программы зондирования территории государства для определения вирусного биологического фона [1-3]. АТ к BAKV у гнездящихся птиц выявлены в 15,6%. BAKV был выделен также во время эпизоотии в фазанарии (Бардинский район, Азербайджан) из органов фазанят, среди которых наблюдалась высокая смертность. Один штамм BAKV изолирован в Исмаилинском районе Азербайджана из снятых с коров клещей Hyalomma marginatum [4]. Позднее BAKV многократно изолировали из клещей O. coniceps Canestrini, 1980, собранных в гнездовьях чаек L. argentatus и крачек Sterna hirundo на островах в заливе Кара-Богаз-Гол в Туркмении и норовых гнездовьях голубей Columba livia neglecta в предгорьях Чаткальско-го хребта Западного Тянь-Шаня (Ташкентский район, Узбекистан) [5-8]. Данные по изоляции 69 штаммов BAKV приведены в табл. 1. На основании биологических свойств и морфологических данных (структура вириона по данным электронной микроскопии) BAKV был отнесен к комплексу вируса Кемерово (KEMV), который позднее был включен в род Orbi-virus сем. Reoviridae [1, 9-12]. Семейство Reoviridae включает 15 родов безоболочечных вирусов животных, насекомых и растений с сегментированным геномом, представленным 10-12 молекулами двухцепочечной РНК. К роду Orbivirus отнесены более 160 вирусов (штаммов), которые объединены в 22 серотипа (вида). 13 орбивирусов имеют статус неклассифицированных. Орбивирусы являются арбовирусами, т.е. передаются позвоночным с укусом членистоногого переносчика. Филогенетически и антигенно орбивирусы формируют три группы (клайда), которые соответствуют их членистоногим переносчикам. К группе орбивирусов, передаваемых мокрецами (Culiciodes spp. ), относятся вирусы Синего языка (Bluetongue virus, BTV) и Африканской лихорадки лошадей (AHSV) - важные патогены домашних животных. Орби-вирусы Юннань (YUOV) и Перуанской болезни лошадей (PHSV) связаны с комарами рода Culex. Клещевые орбивирусы, связанные преимущественно с иксодидными (Ixodidae) клещами и птицами, объединены в группу Грейт айленд (Great Island virus, GIV). Значение в инфекционной патологии человека имеют клещевые орбивирусы комплекса Кемерово (KEMV; Трибеч (TRBV) и Липовник (LIPV)), широко распространенные в Северной Евразии, вызывающие поражения ЦНС в виде менингита и менингоэнцефалита [13, 14]. В настоящей работе геном прототипного штамма BAKV LEIV-Azn46 был секвенирован de novo с использованием технологии полногеномного секвенирования (next-generation sequencing). На основании проведенного молекулярно-генетического и филогенетического анализа установили, что BAKV является новым видом в составе рода Orbivirus, близким к серогруппе GIV. Материалы и методы Использованные вирусы и выделение РНК. Вирус Баку (штамм LEIV-Azn46Р) был получен из Государственной коллекции вирусов РФ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава РФ в виде ли-офилизованной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4-е сут- Таблица 2 Уровень (в %) идентичности белков вируса Баку (BAKV) с орбивирусами Вирус Вирусные белки BAKV VP1 (Pol) T2* VP2* NS1 VP4 VP5 NS2 VP7 (Т13) VP6 NS3 Kemerovo 48,6 64,8 23,2 40 58 - 45 64 33 44 Tribec 48,6 64,3 26,1 40 52 - 48 64 32 43 Great Island 47,0 63,0 22,5 40 60 - 46 64 34 28 Yunnan 44,5 46,5 9,7 26 42 54 30 38 29 н.д. EHDV 42,3 37,4 14,2 23 46 39 27 34 28 31 African horse sickness 42,1 36,8 ,8 8, 23 41 34 30 36 32 29 Bluetongue 43,7 36,8 11,4 24 46 35 25 30 26 44 Примечание. * - белок внутреннего слоя нуклеокапсида Т2 у орбивирусов, связанных с мокрецами, кодируется сегментом 3 и обозначается VP3. Таблица 3 Уровень (в %) идентичности белка Т2 орбивирусов Вирус 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Baku 1 64,8 64,1 64,3 63,0 47,3 45,4 42,4 37,4 36,8 36,9 36,8 34,0 23,7 Kemerovo 2 91,0 91,1 82,8 45,5 45,7 44,3 37,3 35,2 36,3 35,7 32,0 24,5 Lipovnik 3 99,4 82,5 46,7 45,5 44,4 37,1 34,6 36,0 35,3 31,6 25,0 Tribec 4 82,6 46,7 45,6 44,4 37,0 34,8 36,2 35,3 31,7 25,0 3nat Island 5 45,6 45,7 43,8 37,4 35,5 37,7 35,1 33,5 23,8 Peruvian horse sickness 6 65,8 43,5 36,5 35,8 36,2 36,9 34,7 23,5 Yunnan 7 41,9 37,5 37,3 37,7 38,2 35,5 23,8 Umatilla 8 35,7 35,7 36,3 35,2 32,9 22,7 EHDV 9 58,7 69,7 77,5 49,9 22,7 African horse sickness 10 62,4 57,3 56,8 22,5 Eubenangee 11 68,5 52,1 22,0 Bluetongue 12 50,8 22,4 Equine encephalosis 13 21,2 St Croix River 14 Примечание. Серым цветом выделены вирусы группы GIV. ки) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных, одобренных комиссией института по этике экспериментов с животными. Фрагменты мозга (около 50 мг) помещали в 350 мкл лизирующего буфера RLT (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделяли набором «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit (Invitrogen, США). Подготовка библиотек и секвенирование. 100 нг тотальной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы (50 мМ трис-HCl (pH 8,3, температура 25°C), 50 мМ KCl, 4 мМ MgCl 10 мМ DTT, dNTp (1 мМ каждого) и гексапраймер (0,2 мкг)) при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с использованием набора «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illumina, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили с использованием программы «CLC Genomics Workbench 5.5» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей осуществляли с помощью сервиса BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, Дендрограммы, построенные на основе филогенетического анализа белков T2 (а) и Pol (б) орбивирусов. США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли, используя программу MEGA5. Поиск сайтов гликозилирования, сайтов нарезания сигнального пептида и трансмембранных доменов проводили с помощью on-line ресурсов NetNG-lyc1.0, SignalP и TMHMM2.0 соответственно (сайт CBS Prediction Servers http://www.cb.sdtu.dk/services). Результаты и обсуждение В результате проведенного секвенирования определили практически полные последовательности большинства сегментов генома BAKV (табл. 2). Геном ор-бивирусов состоит из 10 сегментов двухцепочечной РНК, большинство из которых имеют 1 открытую рамку считывания. Прототипный орбивирус BTV кодирует 7 структурных белков и 4 неструктурных (сегмент 10 кодирует 2 белка). Наиболее консервативными белками у орбивирусов являются 2 самых крупных белка: РНК-полимераза (Pol, VP1) и белки внутреннего слоя нуклео-капсида (белки Т2 и Т13). Дивергенция аминокислотной последовательности белков Т2 и Т13 соответствует антигенным различиям между отдельными серотипами (видами) и может использоваться вместе с Pol для классификации новых видов орбивирусов. Белки внешнего слоя нуклеокапсида (VP2 и VP5), которые взаимодействуют с клеточными рецепторами и находятся под давлением иммунного ответа, напротив, демонстрируют высокий уровень вариабельности среди орбивирусов [13, 15, 16]. Уровень гомологии аминокислотной последовательности белка Pol у орбивирусов разных групп составляет от 34,5 до 64%. У клещевых орбивирусов группы GIV уровень идентичности Pol превышает 70%. Так, вирусы комплекса KEMV обладают с GIV 72-73% идентичности. При этом вирусы LIPV и TRBV являются практически идентичными (98,7%). Белок Pol BAKV имеет 48,6% идентичности с вирусами группы GIV и в среднем 41% с неклещевыми орбивирусами (см. табл. 2). Идентичность белка Т2 BAKV с орбивирусами составляет от 23,7 до 64,8% (табл. 3). Наибольший уровень (64,8%) идентичности по белку Т2 BAKV имеет с клещевыми вирусами группы GIV (KEMV). C орбиви-русами, связанными с москитами и мокрецами, идентичность Т2 BAKV составляет 42,4-47,3 и 34-37,7% соответственно. Минимальный уровень идентичности Т2 BAKV имеет с вирусом Сент Круа Ривер (St Croix River - SCRV), который является наиболее дивергентным ор-бивирусом (см. рисунок). SCRV был выделен из клещей Ixodes scapularis, однако он обладает наиболее низкой гомологией (антигенно и генетически) и с клещевыми, и с москитными орбивирусами (21-25%). На основе сравнения белков Pol и Т2 орбивирусов провели филогенетический анализ. На рисунке представлены дендрограммы, на которых видно, что орбивирусы можно разделить на три филогенетические группы, каждая из которых объединяет вирусы, связанные с определенным переносчиком - клещами, москитами и мокрецами соответственно. BAKV по анализируемым белкам (Pol и Т2) наиболее близко группируется с клещевыми вирусами группы GIV. При этом из дендрограммы, построенной на основе Pol, следует, что BAKV формирует новую, отдельную филогенетическую группу, практически равноудаленную от клещевых и москитных орбиви-русов. В группу TBV входят 35 вирусов (серотипов), среди которых GIV, Бродхэвен (Broadhaven, BRDV), Сэнди бэй (Sandy bay, SBaV), Вад Медани (Wad Medani; WMV), Ченуда (Chenuda; CHUV), а также вирусы комплекса Кемерово (KEMV, TRBV, LIPV и Карагыш (Karagysh). Геномные данные известны только для небольшого количества клещевых орбивирусов, что ограничивает возможности филогенетического анализа. Нужно отметить, что комплекс KEMV является достаточно обособленной группой, поскольку возможность реассортации их генома с другими вирусами группы GIV ограничена. Кроме того, вирусы KEMV способны эффективно инфицировать грызунов и людей, тогда как вирусы GIV связаны в основном с птицами. Основное значение в определении рецепторной специфичности орбивирусов принадлежит белку внешней оболочки капсида VP2. По белку VP2 KEMV и TRBV между собой имеют 82% идентичности и только 38% с GIV. Уровень идентичности VP2 BAKV, который так же, как и GIV, связан с птицами, составляет 22,5-26,1% с клещевыми орбивирусами и 8-14% с остальными вирусами соответственно (см. табл. 1). Вирусы группы GIV в основном связаны с иксодид-ными клещами (Ixodidae). Их многократно изолировали от клещей Ixodes spp., Hyalomma spp., Amblyoma spp. и Phipicephalus spp., а CHUV был изолирован от аргазид (Argasidae) - клещей Argas reflexus hermanni в Египте. Напротив, большинство штаммов BAKV были изолированы из аргасовых клещей O. capensis и O. coniceps. Таким образом, высокий уровень генетической дивергенции BAKV с другими клещевыми вирусами связан с экологическими особенностями его эволюции. На основе проведенного филогенетического анализа и с учетом особенностей экологии BAKV можно заключить, что BAKV является новым видом орбивирусов, который формирует отдельную филогенетическую группу, близкую к группе GIV.

References

Supplementary files