Peculiarity of reassortment of current wild type influenza viruses with master donor viruses for live influenza vaccine

Full Text

Введение Современные живые гриппозные реассортантные вакцины (ЖГВ) представляют собой реассортанты, полученные при скрещивании актуального циркулирующего вируса гриппа с аттенуированным холодоадаптированным (ХА) донором аттенуации. Два ХА донора аттенуации - А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и В/СССР/60/69 - применяются в России для подготовки вакцинных штаммов ЖГВ. Вакцинный 6:2 реассортант содержит 2 поверхностных антигена - гемагглютинин (HA) и нейра-минидазу (NA) от актуального вируса гриппа и 6 генов, кодирующих внутренние белки, от донора аттенуации. Отдел вирусологии ФГБУ НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург) является единственным в России структурным подразделением, на которое Министерством здравоохранения России возложена обязанность ежегодной подготовки вакцинных штаммов ЖГВ. В настоящем исследовании проведен анализ сложностей в подготовке вакцинных штаммов ЖГВ, связанных с постоянно меняющимися биологическими свойствами циркулирующих вирусов гриппа. Работа выполнена на основе анализа 860 реассортантов с различной формулой генома, полученных при скрещивании вирусов дикого типа (wt) с ХА донорами аттенуации. Материалы и методы Вирусы. В работе использованы 37 диких вирусов гриппа А и В, полученных в Центре по контролю за заболеваемостью (CDC, США), 5 реассортантных вакцинных штаммов для инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ), подготовленных на основе различных штаммов вируса гриппа А (в том числе высокопатогенных), и донора высокой урожайности - вируса A/PR/8/34 (H1N1) (PR8): IRV-148 (H1N1) (Д/Брисбен/59/2007 * PR8), NIB-64 (H3N2) (Д/Перт/16/2009 * PR8), NIBRG-23 (H5N1) (Л/индюк/Турция/1/05 * PR8), INDO/05 (H5N1) (A/Индонезия/05/2005 * PR8), VN1203 (H5N1) (A/Вьетнам/1203/2004 * PR8), полученных из коллекции NIBSC (Великобритания) и CDC (США), а также 2 ХА донора аттенуации отечественной ЖГВ - A/ Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Л17) и В/СССР/60/69 из коллекции Отдела вирусологии ФГБУ НИИЭМ СЗО РАМН. Вирусы поддерживали путем пассажей в 10дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Получение реассортантов осуществляли в РКЭ по стандартной методике [1]. Анализ генома реассортантных штаммов проводили с помощью метода микс-ПЦР, основанного на различиях в размерах соответствующих амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации или дикого вируса [2]. Оценку ингибиторочувствительности вирусов гриппа к гамма-ингибиторам нормальной сыворотки крови производили в стандартной реакции торможения гемагглю-тинации (РТГА) [3] с 1% эритроцитами человека группы крови 0(I) Rh+, используя в качестве источника ингибиторов нормальную лошадиную сыворотку производства ООО "Биолот" (Санкт-Петербург), разведенную 1:10 и прогретую при 100°С в течение 5 мин. Вирусы считали ингибитороустойчивыми (ИУ) при титре лошадиной сыворотки в РТГА < 1:40 и ингибиторочувствительными (ИЧ) при титре > 1:80. Результаты и обсуждение Классический метод получения реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ с формулой генома 6:2 включает скрещивание в РКЭ при 32°C родительских вирусов (донора аттенуации и эпидемического вируса, взятых в равных инфекционых дозах), селективные пассажи в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной до 25-26°C температуре с последующим клонированием предельными разведениями [1]. Теоретически при скрещивании двух штаммов вируса гриппа возможно формирование 256 различных комбинаций генов. Использование двух мощных селектирующих факторов (антисыворотки к донору аттенуации и пониженной температуры инкубации) приводит к существенному снижению количества нежелательных комбинаций, однако в ряде случаев их число остается достаточно большим. До конца 1990-х - начала 2000-х годов на основе циркулирующих в те годы вирусов гриппа А и В удавалось регулярно получать вакцинные штаммы с желаемой формулой генома 6:2. При этом HA и NA практически Контактная информация: Киселева Ирина Васильевна, д-р биол. наук; e-mail: irina.v.kiseleva@mail.ru 27 всегда переходили в геном вакцинного реассортанта от эпидемического родителя, а гены, кодирующие белки нуклеопротеидного комплекса (PB2, PB1, PA и NP) - от ХА донора аттенуации. Процент "холодных" M- и NS-генов был также достаточно высок (см. рисунок, а, в). Однако в последние годы появляется все больше случаев разобщения генов, кодирующих HA и NA. Снизилось также число реассортантов, наследующих внутренние гены от доноров аттенуации (см. рисунок, б, г). На эффективность подготовки вакцинных штаммов могут оказывать существенное влияние фенотипические свойства эпидемического вируса. В частности существуют природно холодоустойчивые вирусы гриппа [4]. При стандартной процедуре их реассортации с ХА донорами теряется один из двух селектирующих факторов - пони- 100-1 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 РВ2РВ1 РА НА NP NA М NS 100-1 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 РВ2РВ1 РА НА NP NA М NS 100-, 9080706050403020100 РВ2РВ1 РА НА NP NA М NS 100-1 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 РВ2РВ1 РА НА NP NA М NS Наследование реассортантными штаммами генов от донора аттенуации или от вируса гриппа дикого типа. По оси абсцисс - гены вируса гриппа; по оси ординат - наследование реассортантными штаммами генов от того или иного родительского вируса (в %); светлые столбики - гены от донора аттенуации; черные столбики - гены от вируса гриппа дикого типа. а - реассортанты между донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и дикими вирусами, циркулировавшими до 2000 г.; б - реассортанты между донором аттенуации А/ Ленинград/134/17/57 (H2N2) и дикими вирусами, циркулировавшими после 2000 г.; в - реассортанты между донором аттенуации В/СССР/60/69 и дикими вирусами, циркулировавшими до 2000 г.; г - реассортанты между донором аттенуации В/СССР/60/69 и дикими вирусами, циркулировавшими после 2000 г. Проанализированы реассортанты, подготовленные на основе следующих диких вирусов гриппа А и В: А/Пекин/262/95 (H1N1), А/Перт/13/95 (H1N1), А/Нанчанг/933/95 (H3N2), А/ Иоганнесбург/82/96 (H1N1), А/Сидней/5/97 (H3N2), А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), А/ Панама/2007/99 (H3N2), А/Гонконг/1186/03 (H3N2), А/Вайоминг/3/03 (H3N2), А/Малайзия/01/04 (H3N2), А/Калифорния/07/04 (H3N2), А/Веллингтон/01/04 (H3N2), А/Висконсин/67/05 (H3N2), А/Соломоновы острова/3/06 (H1N1), А/Брисбен/59/07 (H1N1), А/Брисбен/10/07 (H3N2), А/ Калифорния/07/09 (H1N1), А/Виктория/361/11 (H3N2), В/Харбин/07/94, В/Санкт-Петербург/92/95, В/Шангдонг/7/97, В/Иоганнесбург/05/99, В/Гонконг/330/01, В/Джилин/20/03, В/Янгсу/10/03, В/ Флорида/7/04, В/Малайзия/2506/04, В/Огайо/01/05, В/Флорида/4/06, В/Брисбен/3/07, В/Техас/26/08, B/Брисбен/60/08, В/Бангладеш/1994/10, В/Висконсин/1/10, B/Техас/6/11. женная температура инкубации. Температурочувствительные вирусы гриппа, получившие в последнее время широкое распространение [5], не позволяют использовать ts-маркер (маркер температурочувствительности) при первичном скрининге реассортантов. В настоящем исследовании мы уделили внимание еще одному свойству вируса гриппа - его чувствительности к неспецифическим термостабильным гамма-ингибиторам сыворотки крови, поскольку эпидемические вирусы, рекомендуемые в последние годы Всемирной организацией здравоохранения для подготовки актуальных вакцинных штаммов, все чаще обладают этим признаком. Таков в частности целый ряд современных вирусов гриппа A (H3N2) и подавляющее большинство вирусов гриппа В линии Ямагата [6]. Был проведен анализ эпидемических родительских вирусов по признаку их чувствительности к термостабильным гамма-ингибиторам. Вне зависимости от принадлежности дикого родителя к определенному серотипу/сероподтипу, NA ИУ вирусов встраивалась в геном реассортантных вирусов значительно чаще, чем NA ИЧ вирусов (табл. 1). Геномный анализ реассортантов, подготовленных на основе 20 ИЧ вирусов, показал, что только 1/3 от общего числа клонов (143 из 545) унаследовала NA дикого типа, притом что некоторые ре-ассортанты ИЧ вирусов, таких как А/ Нанчанг/933/95 (H3N2) и А/Токио/3/67 (H2N2), наследовали NA исключительно от дикого родителя. Наоборот, среди 315 ИУ реассортантов всего 20 приобрели NA от донора аттенуации (табл. 2). Известно, что ингибиторочувствитель-ность или устойчивость вируса гриппа к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови определяется свойствами его НА [7]. Указанный признак наследуется реассортантными вирусами вместе с геном, кодирующим этот поверхностный белок. Некоторые авторы отводят определенную роль в формировании ингибиторочувствительности не только HA, но и NA. В частности установлено, что ингибиторы сыворотки препятствуют проникновению ИЧ вируса в клетку в результате конкуренции за SA-альфа-2,6-Gal-рецептор HA. Ингибирование NA природно-устойчивых к ингибиторам вирусов гриппа приводило к тому, что эти вирусы становились ИЧ [8]. Возможно, наследование реассортантным штаммом НА от дикого, а NA от ХА родителя (см. рисунок, б, г) может быть связано с особенностями НА и NA дикого вируса. Реассортанты, несущие НА ИЧ донора аттенуации, в процессе реас-сортации нейтрализуются антисывороткой к донору, а его NA, вероятно, имеет определенные преимущества перед NA ИЧ дикого вируса и каким-то образом конкурирует с ней при встраивании в геном реассортантного вируса. Возможно, такие конкурентные отношения могут быть объяснены определенной, еще не установленной ролью NA в формировании ИЧ фенотипа вируса гриппа. 28 Т аблица 1 Частота наследования NA реассортантными штаммами, полученными при скрещивании доноров аттенуации с вирусами гриппа, обладающими разной степенью чувствительности к неспецифическим термостабильным гамма-ингибиторам Дикий родительский вирус Реассортанты* чувствитель из них унаследовали название вируса ность к гамма-ингибиторам всего wt NA cа NA Вирусы гриппа В В/Шангдонг/7/97 Устойчивый 8 8 0 В/Гонконг/330/01 " 6 6 0 В/Малайзия/2506/04 " 29 27 2 В/Огайо/01/05 " 17 17 0 В/Брисбен/60/08 " 16 14 2 В/Техас/26/08 " 12 5 7 В/Харбин/07/94 Чувствительный 4 3 1 В/Санкт-Петербург/92/95 " 8 3 5 В/Иоганнесбург/05/99 " 14 5 9 В/Джилин/20/03 " 10 4 6 В/Янгсу/10/03 " 23 9 14 В/Флорида/7/04 " 14 5 9 В/Флорида/4/06 " 31 3 28 В/Брисбен/3/07 " 13 1 12 В/Висконсин/1/10 " 140 4 136 В/Бангладеш/1994/10 " 57 19 38 B/Техас/6/11 " 12 7 5 Вирусы гриппа А (H3N2) А/Гонконг/1186/03 Устойчивый 8 8 0 А/Вайоминг/3/03 " 4 4 0 А/Калифорния/07/04 " 27 26 1 А/Висконсин/67/05 " 19 17 2 А/Виктория/361/11 " 16 16 0 А/Нанчанг/933/95 Чувствительный 20 20 0 А/Сидней/5/97 " 58 2 56 А/Панама/2007/99 " 7 1 6 А/Веллингтон/01/04 " 30 9 21 А/Малайзия/01/04 " 8 2 6 А/Брисбен/10/07 " 14 3 11 Вирусы гриппа А (H1N1) А/Пекин/262/95 Устойчивый 18 15 3 А/Перт/13/95 П 7 7 0 А/Иоганнесбург/82/96 П 6 6 0 А/Брисбен/59/07 П 13 11 2 А/Новая Каледония/20/99 П 50 50 0 А/Соломоновы острова/03/06 П 8 8 0 A/Калифорния/07/09 П 34 33 1 Вирусы гриппа А (H2N2) А/Калифорния/1/66 Устойчивый 5 5 0 А/Токио/3/67 Чувствительный 29 29 0 Вирусы гриппа A (H5N1) NIBRG-23 Устойчивый 12 12 0 VN1203 Чувствительный 42 14 28 INDO/05 " 11 0 11 Примечание. *Все реассортанты унаследовали HA от дикого родительского вируса. Анализ эффективности получения штаммов с вакцинной формулой генома показал, что ряд использованных нами вирусов легко вступал в реассортацию с донорами аттенуации с формированием значительного числа клонов с формулой генома 6:2 (например, ИУ вирусы гриппа H1N1). При скрещивании с донорами других вирусов мы столкнулись с определенными трудностями. В частности из 29 реассор-тантов на основе ИЧ вируса гриппа H2N2 только 4 обладали формулой генома 5:3 и ни один - вакцинной формулой 6:2. При попытке получения вакцинного штамма ЖГВ против двух ИУ высокопатогенных вирусов гриппа птиц H5N1 скрещиванием H5N1-PR8 реассортантов с ХА донором аттенуации Л17 оказалось, что 73,6 % изолированных клонов унаследовали от родителей VN1203 и INDO/05 только HA (формула генома 7:1). Гены PB2 от вируса PR8 и NA вирусов гриппа птиц всегда наследовались ре-ассортантами вместе, и наоборот, если в геном реассортантного вируса включался ген РВ2 от донора аттенуации, NA также наследовалась от донорского штамма (табл. 3). Невозможность получения 6:2 реассортантов при скрещивании ХА донора аттенуации с H5N1-PR8-штаммами для ИГВ отмечена и в работе [9]. Таким образом, H5N1-PR8 вакцинные штаммы ИГВ дают пример жесткой констелляции генов. Что же касается ИЧ H5N1-PR8 реассор-танта - NIBRG-23, - то он в реассортацию не вступал вообще (см. табл. 2). Вероятно, связь генов H5N1-PR8 в геноме вируса NIBRG-23 настолько прочна, что ее практически невозможно нарушить, используя классический метод реассортации с донором аттенуации. В литературе описаны вирусы, с трудом поддающиеся скрещиванию. В ряде случаев авторам не удалось получить реассортанты 6:2 [10]. Так, при использовании в качестве донора внутренних генов вируса гриппа чаек, несмотря на многочисленные попытки, авторы не получили реассортанты 6:2 на основе эпидемических вирусов А/Кавасаки/1/86 (H1N1) или A/Техас/36/91 (H1N1). В геноме полученных реассортантов постоянно присутствовали гены PB2, NP и NS только от эпидемических родительских вирусов. Авторы предполагают некую функциональную несовместимость генов вирусов, использованных ими для скрещивания. Существуют определенные методы повышения эффективности процесса реассортации. В частности прибегали к инактивации дикого родителя нагреванием [11] или ультрафиолетовым облучением (УФО) [12]. В наших опытах предварительная инактивация УФО вируса NIBRG-23 (H5N1) не привела к формированию реассортантов 6:2 или 5:3, однако удалось получить 2 клона с формулой генома 7:1 (см. табл. 2). Чтобы понять, является ли прочная связь гена NA вирусов гриппа птиц с геном РВ2 от вируса PR8 свойством именно реассортантов H5N1-PR8 или любых реассортантов, подготовленных на основе вируса PR8, была произведена попытка заместить внутренними генами ХА донора аттенуации Л17 внутренние PR8-гены реассортантных штаммов для сезонной ИГВ. 29 Таблица 2 Структура генома реассортантов, полученных при скрещивании доноров аттенуации с вирусами гриппа, обладающими разной степенью чувствительности к неспецифическим термостабильным гамма-ингибиторам Дикий родительский вирус* Реассортанты** количество вирусов чувствительность к гамма-ингибиторам всего wt NA cа NA из них с формулой генома** * 6:2 5:3 7:1 другие комбинации Вирусы гриппа В 6 Устойчивые 88 77 (87,5%) 11 (12,5%) 21 (23,9%) 30 (34,1%) 1 (1,1%) 36 (40,9%) 11 Чувствительные 326 63 (19,3%) 263 (80,7%) 12 (3,7%) 13 (4,0%) 91 (27,9%) 210 (64,4%) Вирусы гриппа А (H3N2) 5 Устойчивые 74 71 (95,9%) 3 (4,1%) 7 (9,5%) 25 (33,8%) 1 (1,4%) 41 (55,3%) 6 Чувствительные 137 37 (27,0%) 100 (73,0%) 24 (17,5%) 15 (10,9%) 9 (6,6%) 89 (65,0%) Вирусы гриппа А (H1N1)# 7 Устойчивые 136 130 (95,6%) 6 (4,4%) 71 (52,2%) 37 (27,2 %) 0 28 (20,6 %) Вирусы гриппа А (H2N2) 1 Устойчивые 5 5 (100%) 0 4 (80,0%) 1 (20,0%) 0 0 1 Чувствительные 29 29 (100%) 0 0 4 (13,8%) 0 25 (86,2%) Вирусы гриппа A (H5N1) 1 Устойчивые 12 12 (100%) 0 0 0 0 12 (100 %) 25## 8 (32,0%) 17 (68,0%) 0 0 2 (8,0 %) 23 (92,0 %) 2 Чувствительные 53 14 (26,4%) 39 (73,6%) 0 0 39 (73,6 %) 14 (26,4 %) Всего### Устойчивых (20) 315 295 (93,7%) 20 (6,3%) 103 (32,7%) 93 (29,5%) 2 (0,6%) 117 (37,1%) Чувствительных (20) 545 143 (26,2%) 402 (73,8%) 36 (6,6%) 32 (5,9%) 139 (25,5%) 334 (63,1%) Примечание. * - полный перечень использованных вирусов представлен в табл. 1; ** - HA реассортантов всегда наследовался от дикого родительского вируса, принадлежность остальных генов варьировала; *** - формулы генома: 6:2 - HA и NA унаследованы от дикого родителя, 6 внутренних генов - от донора аттенуации; 5:3 - HA, NA и один из внутренних генов унаследованы от дикого родителя, 5 остальных внутренних генов - от донора аттенуации; 7:1 - HA унаследован от дикого родителя, все внутренние гены и NA - от донора аттенуации; # - среди проанализированных эпидемических штаммов вируса гриппа A (H1N1) не были выявлены ИЧ-варианты; ## - при реассортации использована предварительная инактивация дикого родителя ультрафиолетовым облучением; ### - без учета результатов реассортации донора аттенуации с предварительно инактиванным диким родителем. В качестве таких реассортантов были использованы штаммы, предоставляемые NIBSC в качестве компонентов сезонной ИГВ - реассортант IRV-148 на основе вируса A/Брисбен/59/2007 (H1N1) и реассортант NIB-64 на основе вируса A/Перт/l6/2009 (H3N2). При скрещивании IRV-148 и NIB-64 с донором аттенуации Л17 было получено соответственно 28 и 9 реассортантов (см. табл. 3). Было показано, что все 28 реассортантных штаммов, полученных на основе вируса IRV-148, унаследовали ген РВ2 от донора аттенуации, а HA и NA - от дикого родительского штамма. Из 9 реассортантов вируса NIB-64 5 унаследовали ген РВ2 от донора Л17, а HA и NA - от дикого вируса. Таким образом, была продемонстрирована возможность разрыва связки генов РВ2+NA у PR8-реассортантов, несущих HA и NA сезонных штаммов вируса гриппа. Вероятно, невозможность переноса в реассортантный штамм РВ2-гена от донора аттенуации, а NA - от вируса гриппа птиц H5N1 является уникальной особенностью H5N1-PR8-вирусов. Неудачная попытка получения ХА вакцинных штаммов H5N1 с формулой генома 6:2 методом классической реассортации не должна обескураживать. Возможно, формула генома 7:1 вакцинного штамма ЖГВ против высокопатогенных, пандемически опасных вирусов гриппа птиц сероподтипа A(H5N1) имеет свои преимущества: присутствие в вакцинном штамме еще одного гена от донора аттенуации (NA) является дополнительной гарантией его безопасности. Кроме того, согласно общепризнанным представлениям [13-15], Таблица 3 Принадлежность генов, кодирующих NA и РВ2-белки реассортантов, полученных при скрещивании с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) вакцинных штаммов для ИГВ Реассортантный вирус**, несущий HA и NA от дикого Реассортанты, полученные при скрещивании донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) с PR8-реассортантами* число (%) реассортантов, унаследовавших указанный ген от того или иного родительского вируса** ние гены - от вируса PR8 всего принадлежность гена РВ2 принадлежность гена NA PR8 Л17*** дикий вирус Л17 NIBRG-23 (H5N1)# 17 0 17 (100) 0 17(100) 20 20 (100) 0 20 (100) 0 INDO/05 (H5N1) 11 0 11(100) 0 11 (100) VN1203 (H5N1) 28 0 28 (100) 0 28 (100) 14 14 (100) 0 14 (100) 0 IRV-148 (H1N1) 28 0 28 (100) 28 (100) 0 NIB-64 (H3N2) 9 4 (44,4) 5 (55,6) 9(100) 0 Примечание. * - HA реассортантов всегда наследовался от дикого родительского вируса, принадлежность генов PB1, PA, NP, M и NS варьировала; ** -вакцинный штамм для ИГВ, подготовленный на основе различных штаммов вируса гриппа А и донора высокой урожайности PR8; *** - А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), донор аттенуации; # - в таблице суммированы результаты, полученные при скрещивании с донором аттенуации нативного и инактивированного УФО вируса. 30 именно антитела к HA вируса гриппа являются одним из важных компонентов протекции от вирусов гриппа человека и в значительно меньшей степени - к NA. Вирусы гриппа птиц H5N1 в этом отношении не являются исключением [16]. Так, вакцинация кур против высокопатогенного вируса гриппа птиц H5N1 с помощью одного HA или в сочетании с NA вызывала в обоих случаях 100% защиту от челлендж-инфекции. Более того, включение NA в состав вакцинного препарата не усиливало высокий защитный эффект, обусловленный HA [17]. Выводы 1. Показано, что наиболее высокий процент получения реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ достигается при скрещивании доноров аттенуации с эпидемическими вирусами, устойчивыми к неспецифическим гамма-ингибиторам. 2. Методами классического скрещивания вирусов H5N1-PR8 с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) не удалось получить реассортанты 6:2, содержащие HA и NA вирусов гриппа птичьего происхождения. Это может объясняться особенностями жесткой констелляции генов указанных вирусов. 3. Была выявлена прочная связь между генами PB2/ PR8 и птичьей NA, которые всегда наследовались ре-ассортантами вместе. Если же в геном реассортантного вируса включался ген РВ2 донора аттенуации, NA также наследовалась от него.

References

Supplementary files