Особенности реассортации современных штаммов вируса гриппа с донорами аттенуации живой гриппозной вакцины

Полный текст

Введение Современные живые гриппозные реассортантные вакцины (ЖГВ) представляют собой реассортанты, полученные при скрещивании актуального циркулирующего вируса гриппа с аттенуированным холодоадаптированным (ХА) донором аттенуации. Два ХА донора аттенуации - А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и В/СССР/60/69 - применяются в России для подготовки вакцинных штаммов ЖГВ. Вакцинный 6:2 реассортант содержит 2 поверхностных антигена - гемагглютинин (HA) и нейра-минидазу (NA) от актуального вируса гриппа и 6 генов, кодирующих внутренние белки, от донора аттенуации. Отдел вирусологии ФГБУ НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург) является единственным в России структурным подразделением, на которое Министерством здравоохранения России возложена обязанность ежегодной подготовки вакцинных штаммов ЖГВ. В настоящем исследовании проведен анализ сложностей в подготовке вакцинных штаммов ЖГВ, связанных с постоянно меняющимися биологическими свойствами циркулирующих вирусов гриппа. Работа выполнена на основе анализа 860 реассортантов с различной формулой генома, полученных при скрещивании вирусов дикого типа (wt) с ХА донорами аттенуации. Материалы и методы Вирусы. В работе использованы 37 диких вирусов гриппа А и В, полученных в Центре по контролю за заболеваемостью (CDC, США), 5 реассортантных вакцинных штаммов для инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ), подготовленных на основе различных штаммов вируса гриппа А (в том числе высокопатогенных), и донора высокой урожайности - вируса A/PR/8/34 (H1N1) (PR8): IRV-148 (H1N1) (Д/Брисбен/59/2007 * PR8), NIB-64 (H3N2) (Д/Перт/16/2009 * PR8), NIBRG-23 (H5N1) (Л/индюк/Турция/1/05 * PR8), INDO/05 (H5N1) (A/Индонезия/05/2005 * PR8), VN1203 (H5N1) (A/Вьетнам/1203/2004 * PR8), полученных из коллекции NIBSC (Великобритания) и CDC (США), а также 2 ХА донора аттенуации отечественной ЖГВ - A/ Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Л17) и В/СССР/60/69 из коллекции Отдела вирусологии ФГБУ НИИЭМ СЗО РАМН. Вирусы поддерживали путем пассажей в 10дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Получение реассортантов осуществляли в РКЭ по стандартной методике [1]. Анализ генома реассортантных штаммов проводили с помощью метода микс-ПЦР, основанного на различиях в размерах соответствующих амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации или дикого вируса [2]. Оценку ингибиторочувствительности вирусов гриппа к гамма-ингибиторам нормальной сыворотки крови производили в стандартной реакции торможения гемагглю-тинации (РТГА) [3] с 1% эритроцитами человека группы крови 0(I) Rh+, используя в качестве источника ингибиторов нормальную лошадиную сыворотку производства ООО "Биолот" (Санкт-Петербург), разведенную 1:10 и прогретую при 100°С в течение 5 мин. Вирусы считали ингибитороустойчивыми (ИУ) при титре лошадиной сыворотки в РТГА < 1:40 и ингибиторочувствительными (ИЧ) при титре > 1:80. Результаты и обсуждение Классический метод получения реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ с формулой генома 6:2 включает скрещивание в РКЭ при 32°C родительских вирусов (донора аттенуации и эпидемического вируса, взятых в равных инфекционых дозах), селективные пассажи в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной до 25-26°C температуре с последующим клонированием предельными разведениями [1]. Теоретически при скрещивании двух штаммов вируса гриппа возможно формирование 256 различных комбинаций генов. Использование двух мощных селектирующих факторов (антисыворотки к донору аттенуации и пониженной температуры инкубации) приводит к существенному снижению количества нежелательных комбинаций, однако в ряде случаев их число остается достаточно большим. До конца 1990-х - начала 2000-х годов на основе циркулирующих в те годы вирусов гриппа А и В удавалось регулярно получать вакцинные штаммы с желаемой формулой генома 6:2. При этом HA и NA практически Контактная информация: Киселева Ирина Васильевна, д-р биол. наук; e-mail: irina.v.kiseleva@mail.ru 27 всегда переходили в геном вакцинного реассортанта от эпидемического родителя, а гены, кодирующие белки нуклеопротеидного комплекса (PB2, PB1, PA и NP) - от ХА донора аттенуации. Процент "холодных" M- и NS-генов был также достаточно высок (см. рисунок, а, в). Однако в последние годы появляется все больше случаев разобщения генов, кодирующих HA и NA. Снизилось также число реассортантов, наследующих внутренние гены от доноров аттенуации (см. рисунок, б, г). На эффективность подготовки вакцинных штаммов могут оказывать существенное влияние фенотипические свойства эпидемического вируса. В частности существуют природно холодоустойчивые вирусы гриппа [4]. При стандартной процедуре их реассортации с ХА донорами теряется один из двух селектирующих факторов - пони- 100-1 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 РВ2РВ1 РА НА NP NA М NS 100-1 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 РВ2РВ1 РА НА NP NA М NS 100-, 9080706050403020100 РВ2РВ1 РА НА NP NA М NS 100-1 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 РВ2РВ1 РА НА NP NA М NS Наследование реассортантными штаммами генов от донора аттенуации или от вируса гриппа дикого типа. По оси абсцисс - гены вируса гриппа; по оси ординат - наследование реассортантными штаммами генов от того или иного родительского вируса (в %); светлые столбики - гены от донора аттенуации; черные столбики - гены от вируса гриппа дикого типа. а - реассортанты между донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и дикими вирусами, циркулировавшими до 2000 г.; б - реассортанты между донором аттенуации А/ Ленинград/134/17/57 (H2N2) и дикими вирусами, циркулировавшими после 2000 г.; в - реассортанты между донором аттенуации В/СССР/60/69 и дикими вирусами, циркулировавшими до 2000 г.; г - реассортанты между донором аттенуации В/СССР/60/69 и дикими вирусами, циркулировавшими после 2000 г. Проанализированы реассортанты, подготовленные на основе следующих диких вирусов гриппа А и В: А/Пекин/262/95 (H1N1), А/Перт/13/95 (H1N1), А/Нанчанг/933/95 (H3N2), А/ Иоганнесбург/82/96 (H1N1), А/Сидней/5/97 (H3N2), А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), А/ Панама/2007/99 (H3N2), А/Гонконг/1186/03 (H3N2), А/Вайоминг/3/03 (H3N2), А/Малайзия/01/04 (H3N2), А/Калифорния/07/04 (H3N2), А/Веллингтон/01/04 (H3N2), А/Висконсин/67/05 (H3N2), А/Соломоновы острова/3/06 (H1N1), А/Брисбен/59/07 (H1N1), А/Брисбен/10/07 (H3N2), А/ Калифорния/07/09 (H1N1), А/Виктория/361/11 (H3N2), В/Харбин/07/94, В/Санкт-Петербург/92/95, В/Шангдонг/7/97, В/Иоганнесбург/05/99, В/Гонконг/330/01, В/Джилин/20/03, В/Янгсу/10/03, В/ Флорида/7/04, В/Малайзия/2506/04, В/Огайо/01/05, В/Флорида/4/06, В/Брисбен/3/07, В/Техас/26/08, B/Брисбен/60/08, В/Бангладеш/1994/10, В/Висконсин/1/10, B/Техас/6/11. женная температура инкубации. Температурочувствительные вирусы гриппа, получившие в последнее время широкое распространение [5], не позволяют использовать ts-маркер (маркер температурочувствительности) при первичном скрининге реассортантов. В настоящем исследовании мы уделили внимание еще одному свойству вируса гриппа - его чувствительности к неспецифическим термостабильным гамма-ингибиторам сыворотки крови, поскольку эпидемические вирусы, рекомендуемые в последние годы Всемирной организацией здравоохранения для подготовки актуальных вакцинных штаммов, все чаще обладают этим признаком. Таков в частности целый ряд современных вирусов гриппа A (H3N2) и подавляющее большинство вирусов гриппа В линии Ямагата [6]. Был проведен анализ эпидемических родительских вирусов по признаку их чувствительности к термостабильным гамма-ингибиторам. Вне зависимости от принадлежности дикого родителя к определенному серотипу/сероподтипу, NA ИУ вирусов встраивалась в геном реассортантных вирусов значительно чаще, чем NA ИЧ вирусов (табл. 1). Геномный анализ реассортантов, подготовленных на основе 20 ИЧ вирусов, показал, что только 1/3 от общего числа клонов (143 из 545) унаследовала NA дикого типа, притом что некоторые ре-ассортанты ИЧ вирусов, таких как А/ Нанчанг/933/95 (H3N2) и А/Токио/3/67 (H2N2), наследовали NA исключительно от дикого родителя. Наоборот, среди 315 ИУ реассортантов всего 20 приобрели NA от донора аттенуации (табл. 2). Известно, что ингибиторочувствитель-ность или устойчивость вируса гриппа к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови определяется свойствами его НА [7]. Указанный признак наследуется реассортантными вирусами вместе с геном, кодирующим этот поверхностный белок. Некоторые авторы отводят определенную роль в формировании ингибиторочувствительности не только HA, но и NA. В частности установлено, что ингибиторы сыворотки препятствуют проникновению ИЧ вируса в клетку в результате конкуренции за SA-альфа-2,6-Gal-рецептор HA. Ингибирование NA природно-устойчивых к ингибиторам вирусов гриппа приводило к тому, что эти вирусы становились ИЧ [8]. Возможно, наследование реассортантным штаммом НА от дикого, а NA от ХА родителя (см. рисунок, б, г) может быть связано с особенностями НА и NA дикого вируса. Реассортанты, несущие НА ИЧ донора аттенуации, в процессе реас-сортации нейтрализуются антисывороткой к донору, а его NA, вероятно, имеет определенные преимущества перед NA ИЧ дикого вируса и каким-то образом конкурирует с ней при встраивании в геном реассортантного вируса. Возможно, такие конкурентные отношения могут быть объяснены определенной, еще не установленной ролью NA в формировании ИЧ фенотипа вируса гриппа. 28 Т аблица 1 Частота наследования NA реассортантными штаммами, полученными при скрещивании доноров аттенуации с вирусами гриппа, обладающими разной степенью чувствительности к неспецифическим термостабильным гамма-ингибиторам Дикий родительский вирус Реассортанты* чувствитель из них унаследовали название вируса ность к гамма-ингибиторам всего wt NA cа NA Вирусы гриппа В В/Шангдонг/7/97 Устойчивый 8 8 0 В/Гонконг/330/01 " 6 6 0 В/Малайзия/2506/04 " 29 27 2 В/Огайо/01/05 " 17 17 0 В/Брисбен/60/08 " 16 14 2 В/Техас/26/08 " 12 5 7 В/Харбин/07/94 Чувствительный 4 3 1 В/Санкт-Петербург/92/95 " 8 3 5 В/Иоганнесбург/05/99 " 14 5 9 В/Джилин/20/03 " 10 4 6 В/Янгсу/10/03 " 23 9 14 В/Флорида/7/04 " 14 5 9 В/Флорида/4/06 " 31 3 28 В/Брисбен/3/07 " 13 1 12 В/Висконсин/1/10 " 140 4 136 В/Бангладеш/1994/10 " 57 19 38 B/Техас/6/11 " 12 7 5 Вирусы гриппа А (H3N2) А/Гонконг/1186/03 Устойчивый 8 8 0 А/Вайоминг/3/03 " 4 4 0 А/Калифорния/07/04 " 27 26 1 А/Висконсин/67/05 " 19 17 2 А/Виктория/361/11 " 16 16 0 А/Нанчанг/933/95 Чувствительный 20 20 0 А/Сидней/5/97 " 58 2 56 А/Панама/2007/99 " 7 1 6 А/Веллингтон/01/04 " 30 9 21 А/Малайзия/01/04 " 8 2 6 А/Брисбен/10/07 " 14 3 11 Вирусы гриппа А (H1N1) А/Пекин/262/95 Устойчивый 18 15 3 А/Перт/13/95 П 7 7 0 А/Иоганнесбург/82/96 П 6 6 0 А/Брисбен/59/07 П 13 11 2 А/Новая Каледония/20/99 П 50 50 0 А/Соломоновы острова/03/06 П 8 8 0 A/Калифорния/07/09 П 34 33 1 Вирусы гриппа А (H2N2) А/Калифорния/1/66 Устойчивый 5 5 0 А/Токио/3/67 Чувствительный 29 29 0 Вирусы гриппа A (H5N1) NIBRG-23 Устойчивый 12 12 0 VN1203 Чувствительный 42 14 28 INDO/05 " 11 0 11 Примечание. *Все реассортанты унаследовали HA от дикого родительского вируса. Анализ эффективности получения штаммов с вакцинной формулой генома показал, что ряд использованных нами вирусов легко вступал в реассортацию с донорами аттенуации с формированием значительного числа клонов с формулой генома 6:2 (например, ИУ вирусы гриппа H1N1). При скрещивании с донорами других вирусов мы столкнулись с определенными трудностями. В частности из 29 реассор-тантов на основе ИЧ вируса гриппа H2N2 только 4 обладали формулой генома 5:3 и ни один - вакцинной формулой 6:2. При попытке получения вакцинного штамма ЖГВ против двух ИУ высокопатогенных вирусов гриппа птиц H5N1 скрещиванием H5N1-PR8 реассортантов с ХА донором аттенуации Л17 оказалось, что 73,6 % изолированных клонов унаследовали от родителей VN1203 и INDO/05 только HA (формула генома 7:1). Гены PB2 от вируса PR8 и NA вирусов гриппа птиц всегда наследовались ре-ассортантами вместе, и наоборот, если в геном реассортантного вируса включался ген РВ2 от донора аттенуации, NA также наследовалась от донорского штамма (табл. 3). Невозможность получения 6:2 реассортантов при скрещивании ХА донора аттенуации с H5N1-PR8-штаммами для ИГВ отмечена и в работе [9]. Таким образом, H5N1-PR8 вакцинные штаммы ИГВ дают пример жесткой констелляции генов. Что же касается ИЧ H5N1-PR8 реассор-танта - NIBRG-23, - то он в реассортацию не вступал вообще (см. табл. 2). Вероятно, связь генов H5N1-PR8 в геноме вируса NIBRG-23 настолько прочна, что ее практически невозможно нарушить, используя классический метод реассортации с донором аттенуации. В литературе описаны вирусы, с трудом поддающиеся скрещиванию. В ряде случаев авторам не удалось получить реассортанты 6:2 [10]. Так, при использовании в качестве донора внутренних генов вируса гриппа чаек, несмотря на многочисленные попытки, авторы не получили реассортанты 6:2 на основе эпидемических вирусов А/Кавасаки/1/86 (H1N1) или A/Техас/36/91 (H1N1). В геноме полученных реассортантов постоянно присутствовали гены PB2, NP и NS только от эпидемических родительских вирусов. Авторы предполагают некую функциональную несовместимость генов вирусов, использованных ими для скрещивания. Существуют определенные методы повышения эффективности процесса реассортации. В частности прибегали к инактивации дикого родителя нагреванием [11] или ультрафиолетовым облучением (УФО) [12]. В наших опытах предварительная инактивация УФО вируса NIBRG-23 (H5N1) не привела к формированию реассортантов 6:2 или 5:3, однако удалось получить 2 клона с формулой генома 7:1 (см. табл. 2). Чтобы понять, является ли прочная связь гена NA вирусов гриппа птиц с геном РВ2 от вируса PR8 свойством именно реассортантов H5N1-PR8 или любых реассортантов, подготовленных на основе вируса PR8, была произведена попытка заместить внутренними генами ХА донора аттенуации Л17 внутренние PR8-гены реассортантных штаммов для сезонной ИГВ. 29 Таблица 2 Структура генома реассортантов, полученных при скрещивании доноров аттенуации с вирусами гриппа, обладающими разной степенью чувствительности к неспецифическим термостабильным гамма-ингибиторам Дикий родительский вирус* Реассортанты** количество вирусов чувствительность к гамма-ингибиторам всего wt NA cа NA из них с формулой генома** * 6:2 5:3 7:1 другие комбинации Вирусы гриппа В 6 Устойчивые 88 77 (87,5%) 11 (12,5%) 21 (23,9%) 30 (34,1%) 1 (1,1%) 36 (40,9%) 11 Чувствительные 326 63 (19,3%) 263 (80,7%) 12 (3,7%) 13 (4,0%) 91 (27,9%) 210 (64,4%) Вирусы гриппа А (H3N2) 5 Устойчивые 74 71 (95,9%) 3 (4,1%) 7 (9,5%) 25 (33,8%) 1 (1,4%) 41 (55,3%) 6 Чувствительные 137 37 (27,0%) 100 (73,0%) 24 (17,5%) 15 (10,9%) 9 (6,6%) 89 (65,0%) Вирусы гриппа А (H1N1)# 7 Устойчивые 136 130 (95,6%) 6 (4,4%) 71 (52,2%) 37 (27,2 %) 0 28 (20,6 %) Вирусы гриппа А (H2N2) 1 Устойчивые 5 5 (100%) 0 4 (80,0%) 1 (20,0%) 0 0 1 Чувствительные 29 29 (100%) 0 0 4 (13,8%) 0 25 (86,2%) Вирусы гриппа A (H5N1) 1 Устойчивые 12 12 (100%) 0 0 0 0 12 (100 %) 25## 8 (32,0%) 17 (68,0%) 0 0 2 (8,0 %) 23 (92,0 %) 2 Чувствительные 53 14 (26,4%) 39 (73,6%) 0 0 39 (73,6 %) 14 (26,4 %) Всего### Устойчивых (20) 315 295 (93,7%) 20 (6,3%) 103 (32,7%) 93 (29,5%) 2 (0,6%) 117 (37,1%) Чувствительных (20) 545 143 (26,2%) 402 (73,8%) 36 (6,6%) 32 (5,9%) 139 (25,5%) 334 (63,1%) Примечание. * - полный перечень использованных вирусов представлен в табл. 1; ** - HA реассортантов всегда наследовался от дикого родительского вируса, принадлежность остальных генов варьировала; *** - формулы генома: 6:2 - HA и NA унаследованы от дикого родителя, 6 внутренних генов - от донора аттенуации; 5:3 - HA, NA и один из внутренних генов унаследованы от дикого родителя, 5 остальных внутренних генов - от донора аттенуации; 7:1 - HA унаследован от дикого родителя, все внутренние гены и NA - от донора аттенуации; # - среди проанализированных эпидемических штаммов вируса гриппа A (H1N1) не были выявлены ИЧ-варианты; ## - при реассортации использована предварительная инактивация дикого родителя ультрафиолетовым облучением; ### - без учета результатов реассортации донора аттенуации с предварительно инактиванным диким родителем. В качестве таких реассортантов были использованы штаммы, предоставляемые NIBSC в качестве компонентов сезонной ИГВ - реассортант IRV-148 на основе вируса A/Брисбен/59/2007 (H1N1) и реассортант NIB-64 на основе вируса A/Перт/l6/2009 (H3N2). При скрещивании IRV-148 и NIB-64 с донором аттенуации Л17 было получено соответственно 28 и 9 реассортантов (см. табл. 3). Было показано, что все 28 реассортантных штаммов, полученных на основе вируса IRV-148, унаследовали ген РВ2 от донора аттенуации, а HA и NA - от дикого родительского штамма. Из 9 реассортантов вируса NIB-64 5 унаследовали ген РВ2 от донора Л17, а HA и NA - от дикого вируса. Таким образом, была продемонстрирована возможность разрыва связки генов РВ2+NA у PR8-реассортантов, несущих HA и NA сезонных штаммов вируса гриппа. Вероятно, невозможность переноса в реассортантный штамм РВ2-гена от донора аттенуации, а NA - от вируса гриппа птиц H5N1 является уникальной особенностью H5N1-PR8-вирусов. Неудачная попытка получения ХА вакцинных штаммов H5N1 с формулой генома 6:2 методом классической реассортации не должна обескураживать. Возможно, формула генома 7:1 вакцинного штамма ЖГВ против высокопатогенных, пандемически опасных вирусов гриппа птиц сероподтипа A(H5N1) имеет свои преимущества: присутствие в вакцинном штамме еще одного гена от донора аттенуации (NA) является дополнительной гарантией его безопасности. Кроме того, согласно общепризнанным представлениям [13-15], Таблица 3 Принадлежность генов, кодирующих NA и РВ2-белки реассортантов, полученных при скрещивании с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) вакцинных штаммов для ИГВ Реассортантный вирус**, несущий HA и NA от дикого Реассортанты, полученные при скрещивании донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) с PR8-реассортантами* число (%) реассортантов, унаследовавших указанный ген от того или иного родительского вируса** ние гены - от вируса PR8 всего принадлежность гена РВ2 принадлежность гена NA PR8 Л17*** дикий вирус Л17 NIBRG-23 (H5N1)# 17 0 17 (100) 0 17(100) 20 20 (100) 0 20 (100) 0 INDO/05 (H5N1) 11 0 11(100) 0 11 (100) VN1203 (H5N1) 28 0 28 (100) 0 28 (100) 14 14 (100) 0 14 (100) 0 IRV-148 (H1N1) 28 0 28 (100) 28 (100) 0 NIB-64 (H3N2) 9 4 (44,4) 5 (55,6) 9(100) 0 Примечание. * - HA реассортантов всегда наследовался от дикого родительского вируса, принадлежность генов PB1, PA, NP, M и NS варьировала; ** -вакцинный штамм для ИГВ, подготовленный на основе различных штаммов вируса гриппа А и донора высокой урожайности PR8; *** - А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), донор аттенуации; # - в таблице суммированы результаты, полученные при скрещивании с донором аттенуации нативного и инактивированного УФО вируса. 30 именно антитела к HA вируса гриппа являются одним из важных компонентов протекции от вирусов гриппа человека и в значительно меньшей степени - к NA. Вирусы гриппа птиц H5N1 в этом отношении не являются исключением [16]. Так, вакцинация кур против высокопатогенного вируса гриппа птиц H5N1 с помощью одного HA или в сочетании с NA вызывала в обоих случаях 100% защиту от челлендж-инфекции. Более того, включение NA в состав вакцинного препарата не усиливало высокий защитный эффект, обусловленный HA [17]. Выводы 1. Показано, что наиболее высокий процент получения реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ достигается при скрещивании доноров аттенуации с эпидемическими вирусами, устойчивыми к неспецифическим гамма-ингибиторам. 2. Методами классического скрещивания вирусов H5N1-PR8 с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) не удалось получить реассортанты 6:2, содержащие HA и NA вирусов гриппа птичьего происхождения. Это может объясняться особенностями жесткой констелляции генов указанных вирусов. 3. Была выявлена прочная связь между генами PB2/ PR8 и птичьей NA, которые всегда наследовались ре-ассортантами вместе. Если же в геном реассортантного вируса включался ген РВ2 донора аттенуации, NA также наследовалась от него.

Список литературы

Дополнительные файлы