Recombinant interferon-a suppression of Karelian fever virus replication in human 27 blood cells

Abstract

The active replication of Karelian fever virus (KFV) in human blood vessels and the protective activity of the Russian agent reaferon were first shown. KFL was highly susceptible to interferon (IFN)-α. In control (uninfected) cells, reaferon caused low gene expressions of the IFN-dependent enzymes dsRNA-dependent protein kinase and 2’5’-oligoadenylate synthetase, by exerting a little effect on the activity of its family genes. KFV suppressed the reaferon-induced gene expression of IFN-dependent enzymes, but IFN-α gene transcription was increased in the reaferon-treated infected cells.

Full Text

Отечественный рекомбинантный альфа-2-интер-ферон (реаферон) является доступным антивирусным препаратом [1]. В настоящее время на его основе российские фирмы производят различные фармацевтические средства (виферона свечи и мазь, альфарон для в/м-инъекций, реаферон ЕС-липинт для перорально-го применения, герпферон и гиаферон). Препараты реаферона имеют широкое применение в лечении герпесвирусных инфекций, гепатитов В и С, гриппа и ряда респираторных заболеваний. Направленные исследования действия реаферона на альфа-вирусную инфекцию в клетках крови человека не проводили. Механизмы регуляции системы ИФН альфа-вирусами остаются во многом неизвестными [13]. В организме экспериментальных животных препараты ИФН снижают тяжесть альфа-вирусной инфекции, вызванной вирулентными штаммами вируса Синдбис и западного энцефаломиелита лошадей (ЗЭЛ) [7]. Получены положительные результаты лечения больных гепатитом C и раком усовершенствованными препаратами альфа-ИФН пегасис (оказывает длительное действие) и альфакон (консенсус нескольких видов альфа-ИФН) [14]. На территории России имеются сезонные очаги альфа-вирусной инфекции Синдбис [3]. Вирусы выделяются в Карелии, Прибалтике, Астраханской области, на Алтае, в Татарии и др. Эпидемические вспышки заболеваемости наблюдаются в Скандинавских странах (Швеция, Норвегия, Финляндия) и Китае [16, 17]. Миграция птиц с Африканского на Европейский континент, а также внутри Азиатского континента приводит к широкому распространению геовариантов вирусов Синдбис. Подъем заболеваемости во многом связан с ростом численности комаров в местах гнездования птиц. Лихорадка Синдбис протекает как гриппоподобное заболевание с сыпью и поражением суставов (частое осложнение - полиартриты). Диагноз ставят по клинической картине и появлению антител к вирусу Синдбис. Отечественные тест-системы ОТ-ПЦР на вирусы серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ в нашей стране не производятся. Вирус карельской лихорадки (ВКЛ) выделен из пула комаров Aedes communis [2]. Вирус изучен нами по генному и антигенному составу [4, 8, 10]. Предпринимались единичные попытки зарубежных исследователей обнаружить генетический материал ВКЛ в пробах крови больных методом ОТ-ПЦР. РНК вируса лучше выявлялась в материале везикулярной сыпи больных, чем в пробах крови [15]. Перед нами стояли задачи: 1) показать репродукцию ВКЛ в клетках крови человека и определить уровни накопления в них инфекционного и генетического материала вируса; 2) оценить профилактический защитный эффект препарата реаферон при Синдбис-вирусной инфекции; 3) связать антивирусное действие препарата с транскрипционной активностью ИФН-зависимых генов. Были взяты образцы венозной крови 8 здоровых доноров. В культивируемых клетках крови каждого донора в динамике инфекции тестировали продукцию внеклеточного инфекционного вируса и содержание внутриклеточной вирусной РНК. Использовали методы биологического титрования и количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Анализировали действие реаферона на экспрессию трех ключевых генов системы ИФН-альфа-ИФН, двуспиральной РНК-зависимой (дсРНК-зависимой) протеинкиназы (дсПК) и 2’,5’-олигоаденилатсинтетазы (ОАС) на фоне вирусной инфекции и в незараженных клетках. Материалы и методы Пробы венозной крови получены на станции переливания крови. В группе доноров были 3 женщины и 5 мужчин разного возраста (от 18 до 49 лет). Кровь доноров в количестве 1 мл разводили в питательной среде RPMI 1640 с глутамином, антибиотиками и 10% сыворотки телят в соотношении 1:5. Суспензионные культуры инкубировали в объеме 5 мл в микропробирках. Через 24 и 48 ч отбирали аликвоты (0,4 мл) для исследования инфекционного вируса и через 5, 24 и 48 ч - вирусных и клеточных РНК. Препарат реаферон (аптечный, ампула 1 000 000 МЕ) разводили в 10 мл среды и добавляли в дозе 1000 ед/мл к суспензии клеток крови. Для заражения использовали вирус, полученный в клеточной культуре куриных фибро-бластов, с инфекционным титром 8 lg/мл. Количество вносимого вируса составило 0,1 мл на 5 мл суспензии клеток крови в питательной среде. Через 5 ч клетки крови отмывали от внесенного вируса и продолжали культивирование 24 и 48 ч. Инфекционный титр вируса, секретируемый клетками крови, определяли микрометодом по цитопатогенному действию (ЦПД) на клетки. Вируссодержащую надосадочную жидкость, полученную после осаждения клеток крови при 1500 об/мин, 10 мин, разводили (готовили 10-кратные разведения образцов в среде 199 с 2% сыворотки коров и антибиотиками) и добавляли на монослой клеток Vero (ФГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского). Результат ЦПД вируса учитывали в световом микроскопе через 72 ч. Поставлено 3 варианта опытов: 1) динамика накопления ВКЛ; 2) профилактическое действие реаферона на вирусную инфекцию; 3) влияние реаферона и вируса на экспрессию ИФН-зависимых генов в зараженных и контрольных (неза-раженных) клетках крови. Вирусные и клеточные РНК-транскрипты определяли количественным методом ОТ-ПЦР на приборе CFX-96 фирмы “Bio-Rad” (США). Пороговые циклы (Cq) логарифмической фазы синтеза регистрировали в реальном времени по накоплению сигнала флюоресцентного, интеркалирующего в ДНК красителя EvaGreen. Специфичность полученных ДНК-продуктов оценивали по температурам пиков плавления (программа Date analysis CFX-96) и размерам ДНК-амплификатов (электрофорез в агарозном геле). Уровни мРНК в исследуемых пробах сравнивали по Cq. Рассчитывали изменения (ACq) в контроле и опыте по формуле 2 в степени ACq. Калибратором являлась одна из проб суммарной кДНК в разведениях. По калибровочной кривой оценивали эффективность (Е) амплификации кДНК с парами праймеров. Е колебалась от 90 до 100%, что считается допустимым в сравнительном анализе. РНК выделяли из клеток крови реагентом Trizol (“Invitrogen”) по прилагаемой инструкции. Суммарную кДНК получали в реакции ОТ на поли(А)РНК с праймером олиго(дТ)15. Для количественной ПЦР в реальном времени использовали аликвоты кДНК и ее разведения 1/2 и 1/10. Смешивали пары праймеров, кДНК и готовую смесь EvaGreen Supermix (“Bio- 7-1 а 6-|s Я I- о ° ?Ef 4 II- 3-1 О О) «■ о с.- Жш # Н s О а н IIо аз Jcr ■0-' т LCD 12 3 4 5 6 7 8 3 4 5 Доноры □ ВКЛ 24ч ЕЭ ВКЛ 48ч Доноры Щ ВКЛ Ш ИФН+ВКЛ б Амплификация Циклы Рис. 1. Репродукция ВКЛ в клетках крови человека. Продукция инфекционного вируса через 24 и 48 ч в lg ЦПД (а) и амплификация вирусной РНК с праймерами гена Е1 (б) в количественной ПЦР. По оси абсцисс (а) - номера доноров крови. Rad”). Структура использованных в работе праймеров на РНК ВКЛ (участки генов С, Е2 и Е1 (структурные белки), консервативные праймеры на мРНК альфа-ИФН (подвиды 4, 7, 8 и 21) и мРНК ферментов ОАС1 и дсПК приведены в опубликованных ранее работах [6-9]. Пики плавления Рис. 2. Подавление реафероном репродукции ВКЛ. Продукция инфекционного вируса (а) через 24 ч в клетках крови, не обработанных реафероном (светлые столбики) и предобработанных реафероном (темные столбики). По оси абсцисс - номера доноров крови. Пики плавления (б) ДНК-амплификатов гена Е1 в конечной точке количественной ПЦР. Клетки крови, обработанные реафероном за 24 ч до заражения ВКЛ (1), и необработанные (2). Высота пиков характеризует уровень накопления вирусных РНК через 48 ч. Температура плавления 85° С Результаты Инфекционные титры накопления ВКЛ через 24 и 48 ч культивирования клеток крови 8 доноров представлены на рис. 1, а. Индивидуальные показатели широко варьировали от 1 до 7 lg. У 5 доноров прирост вируса продолжался до 48 ч, но у 2 человек после 24 ч, наоборот, происходило снижение. По данным количественной ОТ-ПЦР (см. рис. 1, б), в клетках крови 8 доноров происходило быстрое накопление вирусных РНК. Синтез вирусных РНК оценивали по 3 участкам генов С, Е2 и Е1. Выявляемость с праймерами Е1 была наилучшей. На рисунке приведены кривые амплификации с праймерами к участку гена Е1 через 24 ч. Наблюдалась положительная корреляция между количеством внеклеточного вируса и внутриклеточным синтезом вирусных РНК. Исключением оказалась донор 2 (молодая женщина), у которой был высокий инфекционный титр ВКЛ 6 lg, но низкий пороговый цикл амплификации РНК (кривая обозначена * на рис. 1, б). Реаферон в дозе 1000 ед/мл эффективно подавлял репродукцию вируса и синтез вирусных РНК во всех пробах (рис. 2, а, б). Время инкубации клеток крови с ИФН до заражения составляло 24 ч. За это время в клетках крови развивалось антивирусное состояние. Защитный эффект ИФН в отношении инфекционного вируса варьировал от 2 до 5 lg ТЦД50/мл. Уровни снижения вирусных РНК составляли от 0,92 до 6,87 ACq. Ингибирующее действие реаферона на инфекционный вирус и вирусные РНК у большей части доноров хорошо коррелировало. ДНК-амплификаты гена Е1 ВКЛ были гомогенными по температуре плавления (см. рис. 2, б) и имели расчетный размер 506 п. н. по данным электрофореза (не приводятся). Количество специфического продукта в конечной точке (40-й цикл амплификации) прямо зависело от значения Cq. ПЦР-анализ вирусных РНК по другим участкам генома ВКЛ (С-Е2) подтвердил описанную выше динамику размножения ВКЛ в клетках крови человека. Влияние реаферона на конститутивные уровни экспрессии генов альфа-ИФН и ИФН-зависимых ферментов в пробах крови человека Доноры, № и Пороговые циклы экспрессии генов Cq возраст, годы альфа-ИФН дсПК ОАС 1 - Женщина, 43 22,50 (20,03)| 32,15 (32,09) 33,09 (34,85) 2 - Женщина, 27 23,63 (21,65)| 34,06 (32,32)| 34,73 (32,75)! 3 - Женщина, 31 22,74 (22,79) 31,31 (32,35) 33,33 (35,24) 4 - Мужчина, 49 20,14 (22,09) 34,37 (32,88)! 36,34 (37,27) 5 - Мужчина, 18 22,09 (23,04) 35,72 (31,03)! 35,69 (33,77)! 6 - Мужчина, 26 21,21 (22,32) 33,79 (32,78)! 35,44 (35,35) 7 - Мужчина, 23 20,98 (21,66) 35,07 (27,31)! 35,41 (30,68)! 8 - Мужчина, 20 20,73 (22,32) 34,06 (33,62)! 36,40 (34,50)! Среднее 21,75 (21,98)* 33,82 (31,80)!* 35,05 (34,30)!* SD 1,18 (0,87) 1,45 (1,96) 1,26 (1,96) Примечание. * - достоверные различия между альфа-ИФН и ферментами дсПК и ОАС по уровням экспрессии генов. Без скобок Пики плавления б Пики плавления - значения Cq в контрольных клетках, в скобках - в клетках через 24 ч после добавления реаферона. Альфа-ИФН кДНК 1/10; дсПК и ОАС кДНК без разведения. Т аблица 2 Действие реаферона на экспрессию генов ИФН-зависимых ферментов в зараженных вирусом клетках Доноры, № и Пороговые циклы экспрессии генов Cq возраст, годы альфа-ИФН дсПК ОАС 1 - Женщина, 43 26,25 (26,69) 28,15 (32,06)! 30,66 (36,13) 2 - Женщина, 27 27,59 (28,31) 30,19 (31,13)! 34,73 (34,49) 3 - Женщина, 31 28,13 (26,80)! 28,65 (29,56)! 34,28 (32,85) 4 - Мужчина, 49 28,33 (26,11)! 30,68 (29,47) 33,64 (32,74) 5 - Мужчина, 18 28,12 (26,38)! 29,82 (30,11)! 34,30 (32,35) 6 - Мужчина, 26 27,54 (26,80)! 29,60 (29,55) 34,85 (33,23) 7 - Мужчина, 23 28,52 (26,81)! 28,28 (30,02)! 34,77 (32,20) 8 - Мужчина, 20 28,62 (27,39)! 28,75 (30,48)! 32,67 (33,27) Среднее 27,89 (26,90)! 29,27 (30,30)! 33,74 (33,41) SD 0,77 (0,68) 0,94 (0,90) 1,44 (1,31) Примечание. Без скобок - значения Cq в зараженных ВКЛ клетках без реаферона, в скобках - с реафероном через 24 ч после заражения. Уровни генной активности ИФН-зависимых генов в клетках крови доноров суммированы в табл. 1. Конститутивная экспрессия альфа-ИФН в клетках крови здоровых людей была высокой (среднее значение Cq 21,75). Ранее мы об этом уже сообщали [6]. На этом основании гены семейства альфа-ИФН подобны ак-тиновым, и их можно отнести к “генам домашнего хозяйства”. Вариации уровней экспрессии альфа-ИФН-гена у разных доноров были незначительными и составляли в среднем 1-2 Cq. Уровни экспрессии генов ферментов ОАС и дсПК в клетках крови человека по сравнению с генами альфа-ИФН очень низкие (средние значения пороговых циклов амплификации генов CqOAC = 35,05 и CqдсПК = 33,82). Добавление реа-ферона мало изменяло конститутивную активность ИФН-генов своего семейства в контрольных клетках (см. табл. 1; рис. 3, а). У 4 доноров-мужчин наблюдалось двукратное снижение и у 2 доноров-женщин - двукратное увеличение. Вместе с тем у большей части доноров реаферон оказывал стимулирующее дей- Рис. 3. Действие реаферона на экспрессию генов альфа-ИФН и дсПК в незараженных ВКЛ-клетках. Пики плавления ДНК-амплификатов альфа-ИФН (а) и дсПК (б). Клетки крови, обработанные через 24 ч реафероном (1) и необработанные (2). ствие на гены ИФН-зависимых ферментов (см. табл. 1). Влияние реаферона на транскрипцию гена дсПК в клетках крови было сильнее, чем на ген ОАС (см. рис. 3, б). В зараженных клетках влияние реаферона на гены альфа-ИФН и ИФН-зависимых ферментов было различным (табл. 2). Обнаружено, что стимулирующее действие реаферона на ген дсПК, наблюдаемое в контрольных клетках, не проявляется в зараженных клетках. Ингибирующий эффект ВКЛ на ген дсПК обнаружен в ранний срок 5 ч и сохранялся в процессе вирусной репликации до 48 ч (табл. 3). Вирусом также устраняется стимуляция реаферо-ном гена ОАС. Ингибирующий эффект вируса преобладает над стимулирующим действием реаферо-на. Однако в зараженных клетках у большинства Регуляция экспрессии гена дсРНК-зависимой протеинкиназы реафероном и ВЕЛ в клетках крови человека Пороговые циклы экспрессии генов Cq Доноры, № и возраст, годы контроль, 5 ч реаферон, 5 ч ВКЛ, 5 ч (48 ч) 1 - Женщина, 43 30,03 25,384 34,414 (30,02) 2 - Женщина, 27 32,44 29,524 30,85| (31,72)| 3 - Женщина, 31 30,22 25,404 31,214 (29,01) 4 - Мужчина, 49 28,31 25,044 29,044 (29,20)4 5 - Мужчина, 18 30,30 28,26| 28,254 (32,48)4 6 - Мужчина, 26 29,03 29,07 33,374 (30,42)4 7 - Мужчина, 23 29,08 25,904 31,644 (30,21)4 8 - Мужчина, 20 29,62 27,834 28,354 (31,83)4 Среднее 29,88 27,054 30,894 (30,61)4 SD 1,24 1,7 2,27 (1,27) Примечание. Значения Cq через ферона и заражения вирусом; в скобках -заражения; кДНК без разведения. 5 ч после добавления реа-ВКЛ Cq через 48 ч после доноров наблюдается активация реафероном генов альфа-ИФН. Обсуждение Впервые показана активная репликация ВКЛ в клетках крови человека и профилактическое защитное действие отечественного препарата реаферон. Исследования проведены на модели клеток крови человека, максимально приближенной к естественному пути передачи вируса кровососущими комарами в природе. Быстрое накопление внеклеточного инфекционного вируса сопровождалось активным синтезом вирусных РНК, которые хорошо выявлялись в клетках крови при количественной ОТ-ПЦР. Эти данные имеют важное значение для разработки современных методов генодиагностики лихорадки Синдбис. Чувствительность клеток крови разных людей к ВКЛ имеет индивидуальный характер. В клетках крови разных доноров титры инфекционного вируса значительно варьировали от 4 до 7 lg по ЦПД. Реаферон не оказывал выраженное влияние на транскрипцию генов своего семейства, но стимулировал низкие уровни экспрессии генов ИФН-зависимых ферментов дсПК и ОАС, которые являются ключевыми в реализации антивирусного действия [19]. По данным литературы [11, 18], препараты ИФН и его индукторов оказывают профилактическое и лечебное действие на ряд арбовирусных инфекций, передаваемых комарами (Крымская геморрагическая лихорадка, лихорадка Западного Нила и лихорадка денге). Вирус ВКЛ обладает высокой чувствительностью к альфа-ИФН. Об этом свидетельствуют данные о снижении реафероном продукции инфекционного вируса ВКЛ и синтеза вирусных РНК. В сезонных очагах в период подъема заболеваемости лихорадкой Синдбис целесообразно применение лекарственных форм альфа-ИФН как профилактического средства. ВКЛ подавляет активность генов ферментов дсПК и ОАС в клетках крови и фибробластах человека [5], обеспечивая приоритет для собственных синтезов. Такой вирусный механизм в первую очередь направлен на устранение клеточных регуляторов трансляции и транскрипции. Полимеразный белок Nsp2 вируса Синдбис, обладающий сигналами ядерной транслокации и протеазной активностью, рассматривается как наиболее вероятный ингибитор транскрипции клеточных генов [12].