Подавление рекомбинантным альфа-2-интерфероном репродукции вируса карельской лихорадки в клетках крови человека

Аннотация

Впервые показана активная репликация вируса карельской лихорадки (ВКЛ) в клетках крови человека и профилактическое защитное действие отечественного препарата реаферон. ВКЛ обладал высокой чувствительностью к альфа-иФн. В контрольных (незараженных клетках) реаферон вызывал низкие уровни экспрессии генов иФн-зависимых ферментов дсРнК-зависимой протеинкиназы (дсПК) и 2’5’-олигоаденилатсинтетазы (ОАС), мало влияя на активность генов своего семейства. ВКЛ подавлял индуцированную реафероном экспрессию генов иФн-зависимых ферментов, но в обработанных реафероном зараженных клетках транскрипция генов альфа-иФн возрастала.

Полный текст

Отечественный рекомбинантный альфа-2-интер-ферон (реаферон) является доступным антивирусным препаратом [1]. В настоящее время на его основе российские фирмы производят различные фармацевтические средства (виферона свечи и мазь, альфарон для в/м-инъекций, реаферон ЕС-липинт для перорально-го применения, герпферон и гиаферон). Препараты реаферона имеют широкое применение в лечении герпесвирусных инфекций, гепатитов В и С, гриппа и ряда респираторных заболеваний. Направленные исследования действия реаферона на альфа-вирусную инфекцию в клетках крови человека не проводили. Механизмы регуляции системы ИФН альфа-вирусами остаются во многом неизвестными [13]. В организме экспериментальных животных препараты ИФН снижают тяжесть альфа-вирусной инфекции, вызванной вирулентными штаммами вируса Синдбис и западного энцефаломиелита лошадей (ЗЭЛ) [7]. Получены положительные результаты лечения больных гепатитом C и раком усовершенствованными препаратами альфа-ИФН пегасис (оказывает длительное действие) и альфакон (консенсус нескольких видов альфа-ИФН) [14]. На территории России имеются сезонные очаги альфа-вирусной инфекции Синдбис [3]. Вирусы выделяются в Карелии, Прибалтике, Астраханской области, на Алтае, в Татарии и др. Эпидемические вспышки заболеваемости наблюдаются в Скандинавских странах (Швеция, Норвегия, Финляндия) и Китае [16, 17]. Миграция птиц с Африканского на Европейский континент, а также внутри Азиатского континента приводит к широкому распространению геовариантов вирусов Синдбис. Подъем заболеваемости во многом связан с ростом численности комаров в местах гнездования птиц. Лихорадка Синдбис протекает как гриппоподобное заболевание с сыпью и поражением суставов (частое осложнение - полиартриты). Диагноз ставят по клинической картине и появлению антител к вирусу Синдбис. Отечественные тест-системы ОТ-ПЦР на вирусы серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ в нашей стране не производятся. Вирус карельской лихорадки (ВКЛ) выделен из пула комаров Aedes communis [2]. Вирус изучен нами по генному и антигенному составу [4, 8, 10]. Предпринимались единичные попытки зарубежных исследователей обнаружить генетический материал ВКЛ в пробах крови больных методом ОТ-ПЦР. РНК вируса лучше выявлялась в материале везикулярной сыпи больных, чем в пробах крови [15]. Перед нами стояли задачи: 1) показать репродукцию ВКЛ в клетках крови человека и определить уровни накопления в них инфекционного и генетического материала вируса; 2) оценить профилактический защитный эффект препарата реаферон при Синдбис-вирусной инфекции; 3) связать антивирусное действие препарата с транскрипционной активностью ИФН-зависимых генов. Были взяты образцы венозной крови 8 здоровых доноров. В культивируемых клетках крови каждого донора в динамике инфекции тестировали продукцию внеклеточного инфекционного вируса и содержание внутриклеточной вирусной РНК. Использовали методы биологического титрования и количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Анализировали действие реаферона на экспрессию трех ключевых генов системы ИФН-альфа-ИФН, двуспиральной РНК-зависимой (дсРНК-зависимой) протеинкиназы (дсПК) и 2’,5’-олигоаденилатсинтетазы (ОАС) на фоне вирусной инфекции и в незараженных клетках. Материалы и методы Пробы венозной крови получены на станции переливания крови. В группе доноров были 3 женщины и 5 мужчин разного возраста (от 18 до 49 лет). Кровь доноров в количестве 1 мл разводили в питательной среде RPMI 1640 с глутамином, антибиотиками и 10% сыворотки телят в соотношении 1:5. Суспензионные культуры инкубировали в объеме 5 мл в микропробирках. Через 24 и 48 ч отбирали аликвоты (0,4 мл) для исследования инфекционного вируса и через 5, 24 и 48 ч - вирусных и клеточных РНК. Препарат реаферон (аптечный, ампула 1 000 000 МЕ) разводили в 10 мл среды и добавляли в дозе 1000 ед/мл к суспензии клеток крови. Для заражения использовали вирус, полученный в клеточной культуре куриных фибро-бластов, с инфекционным титром 8 lg/мл. Количество вносимого вируса составило 0,1 мл на 5 мл суспензии клеток крови в питательной среде. Через 5 ч клетки крови отмывали от внесенного вируса и продолжали культивирование 24 и 48 ч. Инфекционный титр вируса, секретируемый клетками крови, определяли микрометодом по цитопатогенному действию (ЦПД) на клетки. Вируссодержащую надосадочную жидкость, полученную после осаждения клеток крови при 1500 об/мин, 10 мин, разводили (готовили 10-кратные разведения образцов в среде 199 с 2% сыворотки коров и антибиотиками) и добавляли на монослой клеток Vero (ФГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского). Результат ЦПД вируса учитывали в световом микроскопе через 72 ч. Поставлено 3 варианта опытов: 1) динамика накопления ВКЛ; 2) профилактическое действие реаферона на вирусную инфекцию; 3) влияние реаферона и вируса на экспрессию ИФН-зависимых генов в зараженных и контрольных (неза-раженных) клетках крови. Вирусные и клеточные РНК-транскрипты определяли количественным методом ОТ-ПЦР на приборе CFX-96 фирмы “Bio-Rad” (США). Пороговые циклы (Cq) логарифмической фазы синтеза регистрировали в реальном времени по накоплению сигнала флюоресцентного, интеркалирующего в ДНК красителя EvaGreen. Специфичность полученных ДНК-продуктов оценивали по температурам пиков плавления (программа Date analysis CFX-96) и размерам ДНК-амплификатов (электрофорез в агарозном геле). Уровни мРНК в исследуемых пробах сравнивали по Cq. Рассчитывали изменения (ACq) в контроле и опыте по формуле 2 в степени ACq. Калибратором являлась одна из проб суммарной кДНК в разведениях. По калибровочной кривой оценивали эффективность (Е) амплификации кДНК с парами праймеров. Е колебалась от 90 до 100%, что считается допустимым в сравнительном анализе. РНК выделяли из клеток крови реагентом Trizol (“Invitrogen”) по прилагаемой инструкции. Суммарную кДНК получали в реакции ОТ на поли(А)РНК с праймером олиго(дТ)15. Для количественной ПЦР в реальном времени использовали аликвоты кДНК и ее разведения 1/2 и 1/10. Смешивали пары праймеров, кДНК и готовую смесь EvaGreen Supermix (“Bio- 7-1 а 6-|s Я I- о ° ?Ef 4 II- 3-1 О О) «■ о с.- Жш # Н s О а н IIо аз Jcr ■0-' т LCD 12 3 4 5 6 7 8 3 4 5 Доноры □ ВКЛ 24ч ЕЭ ВКЛ 48ч Доноры Щ ВКЛ Ш ИФН+ВКЛ б Амплификация Циклы Рис. 1. Репродукция ВКЛ в клетках крови человека. Продукция инфекционного вируса через 24 и 48 ч в lg ЦПД (а) и амплификация вирусной РНК с праймерами гена Е1 (б) в количественной ПЦР. По оси абсцисс (а) - номера доноров крови. Rad”). Структура использованных в работе праймеров на РНК ВКЛ (участки генов С, Е2 и Е1 (структурные белки), консервативные праймеры на мРНК альфа-ИФН (подвиды 4, 7, 8 и 21) и мРНК ферментов ОАС1 и дсПК приведены в опубликованных ранее работах [6-9]. Пики плавления Рис. 2. Подавление реафероном репродукции ВКЛ. Продукция инфекционного вируса (а) через 24 ч в клетках крови, не обработанных реафероном (светлые столбики) и предобработанных реафероном (темные столбики). По оси абсцисс - номера доноров крови. Пики плавления (б) ДНК-амплификатов гена Е1 в конечной точке количественной ПЦР. Клетки крови, обработанные реафероном за 24 ч до заражения ВКЛ (1), и необработанные (2). Высота пиков характеризует уровень накопления вирусных РНК через 48 ч. Температура плавления 85° С Результаты Инфекционные титры накопления ВКЛ через 24 и 48 ч культивирования клеток крови 8 доноров представлены на рис. 1, а. Индивидуальные показатели широко варьировали от 1 до 7 lg. У 5 доноров прирост вируса продолжался до 48 ч, но у 2 человек после 24 ч, наоборот, происходило снижение. По данным количественной ОТ-ПЦР (см. рис. 1, б), в клетках крови 8 доноров происходило быстрое накопление вирусных РНК. Синтез вирусных РНК оценивали по 3 участкам генов С, Е2 и Е1. Выявляемость с праймерами Е1 была наилучшей. На рисунке приведены кривые амплификации с праймерами к участку гена Е1 через 24 ч. Наблюдалась положительная корреляция между количеством внеклеточного вируса и внутриклеточным синтезом вирусных РНК. Исключением оказалась донор 2 (молодая женщина), у которой был высокий инфекционный титр ВКЛ 6 lg, но низкий пороговый цикл амплификации РНК (кривая обозначена * на рис. 1, б). Реаферон в дозе 1000 ед/мл эффективно подавлял репродукцию вируса и синтез вирусных РНК во всех пробах (рис. 2, а, б). Время инкубации клеток крови с ИФН до заражения составляло 24 ч. За это время в клетках крови развивалось антивирусное состояние. Защитный эффект ИФН в отношении инфекционного вируса варьировал от 2 до 5 lg ТЦД50/мл. Уровни снижения вирусных РНК составляли от 0,92 до 6,87 ACq. Ингибирующее действие реаферона на инфекционный вирус и вирусные РНК у большей части доноров хорошо коррелировало. ДНК-амплификаты гена Е1 ВКЛ были гомогенными по температуре плавления (см. рис. 2, б) и имели расчетный размер 506 п. н. по данным электрофореза (не приводятся). Количество специфического продукта в конечной точке (40-й цикл амплификации) прямо зависело от значения Cq. ПЦР-анализ вирусных РНК по другим участкам генома ВКЛ (С-Е2) подтвердил описанную выше динамику размножения ВКЛ в клетках крови человека. Влияние реаферона на конститутивные уровни экспрессии генов альфа-ИФН и ИФН-зависимых ферментов в пробах крови человека Доноры, № и Пороговые циклы экспрессии генов Cq возраст, годы альфа-ИФН дсПК ОАС 1 - Женщина, 43 22,50 (20,03)| 32,15 (32,09) 33,09 (34,85) 2 - Женщина, 27 23,63 (21,65)| 34,06 (32,32)| 34,73 (32,75)! 3 - Женщина, 31 22,74 (22,79) 31,31 (32,35) 33,33 (35,24) 4 - Мужчина, 49 20,14 (22,09) 34,37 (32,88)! 36,34 (37,27) 5 - Мужчина, 18 22,09 (23,04) 35,72 (31,03)! 35,69 (33,77)! 6 - Мужчина, 26 21,21 (22,32) 33,79 (32,78)! 35,44 (35,35) 7 - Мужчина, 23 20,98 (21,66) 35,07 (27,31)! 35,41 (30,68)! 8 - Мужчина, 20 20,73 (22,32) 34,06 (33,62)! 36,40 (34,50)! Среднее 21,75 (21,98)* 33,82 (31,80)!* 35,05 (34,30)!* SD 1,18 (0,87) 1,45 (1,96) 1,26 (1,96) Примечание. * - достоверные различия между альфа-ИФН и ферментами дсПК и ОАС по уровням экспрессии генов. Без скобок Пики плавления б Пики плавления - значения Cq в контрольных клетках, в скобках - в клетках через 24 ч после добавления реаферона. Альфа-ИФН кДНК 1/10; дсПК и ОАС кДНК без разведения. Т аблица 2 Действие реаферона на экспрессию генов ИФН-зависимых ферментов в зараженных вирусом клетках Доноры, № и Пороговые циклы экспрессии генов Cq возраст, годы альфа-ИФН дсПК ОАС 1 - Женщина, 43 26,25 (26,69) 28,15 (32,06)! 30,66 (36,13) 2 - Женщина, 27 27,59 (28,31) 30,19 (31,13)! 34,73 (34,49) 3 - Женщина, 31 28,13 (26,80)! 28,65 (29,56)! 34,28 (32,85) 4 - Мужчина, 49 28,33 (26,11)! 30,68 (29,47) 33,64 (32,74) 5 - Мужчина, 18 28,12 (26,38)! 29,82 (30,11)! 34,30 (32,35) 6 - Мужчина, 26 27,54 (26,80)! 29,60 (29,55) 34,85 (33,23) 7 - Мужчина, 23 28,52 (26,81)! 28,28 (30,02)! 34,77 (32,20) 8 - Мужчина, 20 28,62 (27,39)! 28,75 (30,48)! 32,67 (33,27) Среднее 27,89 (26,90)! 29,27 (30,30)! 33,74 (33,41) SD 0,77 (0,68) 0,94 (0,90) 1,44 (1,31) Примечание. Без скобок - значения Cq в зараженных ВКЛ клетках без реаферона, в скобках - с реафероном через 24 ч после заражения. Уровни генной активности ИФН-зависимых генов в клетках крови доноров суммированы в табл. 1. Конститутивная экспрессия альфа-ИФН в клетках крови здоровых людей была высокой (среднее значение Cq 21,75). Ранее мы об этом уже сообщали [6]. На этом основании гены семейства альфа-ИФН подобны ак-тиновым, и их можно отнести к “генам домашнего хозяйства”. Вариации уровней экспрессии альфа-ИФН-гена у разных доноров были незначительными и составляли в среднем 1-2 Cq. Уровни экспрессии генов ферментов ОАС и дсПК в клетках крови человека по сравнению с генами альфа-ИФН очень низкие (средние значения пороговых циклов амплификации генов CqOAC = 35,05 и CqдсПК = 33,82). Добавление реа-ферона мало изменяло конститутивную активность ИФН-генов своего семейства в контрольных клетках (см. табл. 1; рис. 3, а). У 4 доноров-мужчин наблюдалось двукратное снижение и у 2 доноров-женщин - двукратное увеличение. Вместе с тем у большей части доноров реаферон оказывал стимулирующее дей- Рис. 3. Действие реаферона на экспрессию генов альфа-ИФН и дсПК в незараженных ВКЛ-клетках. Пики плавления ДНК-амплификатов альфа-ИФН (а) и дсПК (б). Клетки крови, обработанные через 24 ч реафероном (1) и необработанные (2). ствие на гены ИФН-зависимых ферментов (см. табл. 1). Влияние реаферона на транскрипцию гена дсПК в клетках крови было сильнее, чем на ген ОАС (см. рис. 3, б). В зараженных клетках влияние реаферона на гены альфа-ИФН и ИФН-зависимых ферментов было различным (табл. 2). Обнаружено, что стимулирующее действие реаферона на ген дсПК, наблюдаемое в контрольных клетках, не проявляется в зараженных клетках. Ингибирующий эффект ВКЛ на ген дсПК обнаружен в ранний срок 5 ч и сохранялся в процессе вирусной репликации до 48 ч (табл. 3). Вирусом также устраняется стимуляция реаферо-ном гена ОАС. Ингибирующий эффект вируса преобладает над стимулирующим действием реаферо-на. Однако в зараженных клетках у большинства Регуляция экспрессии гена дсРНК-зависимой протеинкиназы реафероном и ВЕЛ в клетках крови человека Пороговые циклы экспрессии генов Cq Доноры, № и возраст, годы контроль, 5 ч реаферон, 5 ч ВКЛ, 5 ч (48 ч) 1 - Женщина, 43 30,03 25,384 34,414 (30,02) 2 - Женщина, 27 32,44 29,524 30,85| (31,72)| 3 - Женщина, 31 30,22 25,404 31,214 (29,01) 4 - Мужчина, 49 28,31 25,044 29,044 (29,20)4 5 - Мужчина, 18 30,30 28,26| 28,254 (32,48)4 6 - Мужчина, 26 29,03 29,07 33,374 (30,42)4 7 - Мужчина, 23 29,08 25,904 31,644 (30,21)4 8 - Мужчина, 20 29,62 27,834 28,354 (31,83)4 Среднее 29,88 27,054 30,894 (30,61)4 SD 1,24 1,7 2,27 (1,27) Примечание. Значения Cq через ферона и заражения вирусом; в скобках -заражения; кДНК без разведения. 5 ч после добавления реа-ВКЛ Cq через 48 ч после доноров наблюдается активация реафероном генов альфа-ИФН. Обсуждение Впервые показана активная репликация ВКЛ в клетках крови человека и профилактическое защитное действие отечественного препарата реаферон. Исследования проведены на модели клеток крови человека, максимально приближенной к естественному пути передачи вируса кровососущими комарами в природе. Быстрое накопление внеклеточного инфекционного вируса сопровождалось активным синтезом вирусных РНК, которые хорошо выявлялись в клетках крови при количественной ОТ-ПЦР. Эти данные имеют важное значение для разработки современных методов генодиагностики лихорадки Синдбис. Чувствительность клеток крови разных людей к ВКЛ имеет индивидуальный характер. В клетках крови разных доноров титры инфекционного вируса значительно варьировали от 4 до 7 lg по ЦПД. Реаферон не оказывал выраженное влияние на транскрипцию генов своего семейства, но стимулировал низкие уровни экспрессии генов ИФН-зависимых ферментов дсПК и ОАС, которые являются ключевыми в реализации антивирусного действия [19]. По данным литературы [11, 18], препараты ИФН и его индукторов оказывают профилактическое и лечебное действие на ряд арбовирусных инфекций, передаваемых комарами (Крымская геморрагическая лихорадка, лихорадка Западного Нила и лихорадка денге). Вирус ВКЛ обладает высокой чувствительностью к альфа-ИФН. Об этом свидетельствуют данные о снижении реафероном продукции инфекционного вируса ВКЛ и синтеза вирусных РНК. В сезонных очагах в период подъема заболеваемости лихорадкой Синдбис целесообразно применение лекарственных форм альфа-ИФН как профилактического средства. ВКЛ подавляет активность генов ферментов дсПК и ОАС в клетках крови и фибробластах человека [5], обеспечивая приоритет для собственных синтезов. Такой вирусный механизм в первую очередь направлен на устранение клеточных регуляторов трансляции и транскрипции. Полимеразный белок Nsp2 вируса Синдбис, обладающий сигналами ядерной транслокации и протеазной активностью, рассматривается как наиболее вероятный ингибитор транскрипции клеточных генов [12].