Interaction of influenza A and B viruses with nanodiamond-based

Full Text

В борьбе с вирусными инфекциями важное место занимает разработка профилактических мер для создания препятствий к их распространению. Для вирусов гриппа птиц, энтеровирусов, вируса гепатита A и др. водный путь передачи является одним из основных. Создание материалов, имеющих различную природу и обладающих сорбционными по отношению к вирусам свойствам, предполагает этап изучения их взаимодействия с патогенными микроорганизмами. Данная работа входит в серию работ по исследованию взаимодействия с вирусами современных углеродсодержащих наноматериалов. Ранее нами было показано, что модифицированный графит, углеродные нанотрубки взаимодействуют с вирусами гриппа A (с гемагглютининами Н1, Н3, Н5, Н7) и В, полиомиелита, бактериофагами и способны удалять их из раствора [2, 3]. Данная работа посвящена исследованию взаимодействия вирусов гриппа A и B с материалами, содержащими наноалмазы. Материалы и методы Вирусы: пандемические штаммы вирусов гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)sw1, А/Калифорния/4/09, антигенно родственные вирусу гриппа свиней [5]; эталонные штаммы А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), А/Перт/06/09 (H3N2); В/Сычуань/379/99, В/Флорида/04/06 эволюционной линии В/Ямагата/16/88; эпидемические штаммы Б/Москва/03/10, В/Москва/06/11 эволюционной линии В/Виктория/2/87. Вирусы получены из коллекции вирусов Центра экологии и эпидемиологии гриппа (ЦЭЭГ), лабораторий НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Культивирование вирусов гриппа проводили на 10-11-дневных развивающихся куриных эмбрионах (КЭ) и культуре клеток MDCK. Гемагглютини-рующую активность вирусов определяли в реакции гемагглютинации (РГА) по общепринятой методике, рекомендованной ВОЗ, с использованием 0,75% взвеси эритроцитов группы крови человека 0(I). Для определения инфекционного титра использовали заражение КЭ 10-кратными разведениями вируссодержащей жидкости. Титр вирусспецифических антител в растворах определяли в реакции торможения гемагглютинации Титр вируса, ГА-ед. Система культивирования/степень очистки/десорбция, время, T-титр, ГА-ед. Сорбент Вирус Антигенная формула до сорбции ГА после сорбции ГА Наноалмаз А/Новая Каледония/20/99 A (H1N1) 128 000 256 КЭ/очищ., конц. А/Перт/16/09 A (H3N2) 128 000 16 КЭ/конц. В/Сычуань/379/99 Линия В/Ямагата 128 < 2 КЭ/очищ., конц. В/Флорида/04/06 Линия В/Ямагата 128 2 КЭ/конц./десорбция, 48 ч, T < 2 А/Калифорния/4/09 A (H1N1)v 32 2 КЭ/аллантоисный/десорбция, 48 ч, T < 1 В/Флорида/04/06 Линия В/Ямагата 32 8 КЭ/аллантоисный В/Москва/03/2010 Линия В/Виктория 128 < 2 MDCK Наноалмаз Т А/Перт/06/09 A (H3N2) 128 000 8 КЭ/конц. В/Флорида/04/06 Линия В/Ямагата 128 2 КЭ/конц./десорбция, 48 ч, T < 2 В/Москва/03/2010 Линия В/Виктория 128 < 2 MDCK Шихта А/Новая Каледония/20/99 A (H1N1) 2000 2 КЭ/очищ., конц. В/Флорида/04/06 Линия В/Ямагата 2000 16 КЭ/конц. А/Перт/16/09 A (H3N2) 64 2 КЭ/аллантоисный В/Флорида/04/06 Линия В/Ямагата 128 32 КЭ/аллантоисный В/Москва/06/11 Линия В/Виктория 64 < 2 MDCK Примечание. Очищ. - очищенный в градиенте сахарозы препарат вируса; конц. - концентрированный препарат вируса, полученный при ультрацентрифугировании при 25 000 об/мин. (РТГА). В работе использовали иммунные крысиные сыворотки к эталонным штаммам вирусов A и B, приготовленные в ЦЭЭГ. Ампликоны - фрагменты кДНК генов современных штаммов вирусов гриппа А и В - получены в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием диагностических тест-систем “ДНК-технология”: “Пан H1N1”, “Influenza A virus”, “Influenza B virus”. Электрофорез фрагментов кДНК выполняли в 2% агарозном геле в течение 1,5 ч при напряжении 80 B, в качестве положительного контроля использовали контрольные образцы, входящие в тест-системы. Гели фотографировали и анализировали на трансиллюминаторе с ультрафиолетовым светом с длиной волны 1 = 254 нм. Использованы следующие сорбенты в виде порошков: наноалмазы Т, прошедшие термообработку при 490oC, наноалмазы без термообработки, шихта - первичный продукт детонационного синтеза наноструктурных алмазов. Сорбцию вирусов проводили из физиологического раствора (ФР), водопроводной автокла-вированной воды, аллантоисной жидкости КЭ, питательной среды Игла для культуры клеток MDCK по методу, описанному в работе [2]. Токсичность сорбентов, разведенных в ФР, исследовали на культуре клеток MDCK в микропланшете. В првую лунку вносили взвесь сорбента V = 20 мкл. Начальная концентрация сорбента в первой лунке составляла 1 мг/мл. Далее полученную суспензию разводили 1/10 и выдерживали в термостате (37oC, 18 ч). Клеточный монослой анализировали методом световой микроскопии. Электронномикроскопические исследования выполняли на препаратах, обработанных с помощью 2% водного раствора уранилацетата. Результаты и обсуждение Наноалмазы, или ультрадисперсные алмазы, можно рассматривать как специфические наноуглеродные материалы, входящие в обширное и приобретающее все большую популярность семейство наноуглерод-ных кластеров, состоящее из фуллеренов, нанотрубок, нанографита. Наноалмазы образуются в течение 0,3 мкс при детонации взрывчатых веществ тротила и гексогена при высоком давлении 16-23 гПа и температуре (Т) около 3000 К. При этом, кроме наноалмазов, образуется алмазная шихта, содержащая наряду с алмазной фазой неалмазные углероды и примеси метана [4, 7]. Выбор вирусов гриппа в качестве биологических объектов исследования обусловлен широким распространением этих вирусов в природе, поражением людей, птиц и животных, водным путем передачи инфекции в случае вирусов гриппа птиц и, возможно, пандемического штамма A(H1N1)v, интродукцией вирусов гриппа птиц в человеческую популяцию. В таблице представлены результаты взаимодействия с наноалмазами и шихтой вирусов гриппа A(H1N1), A((H3N2) и В эволюционных линий В/Виктория- и В/Ямагата-подобных. Как видно из представленных данных, при сорбции на наноалмазы падение гемаг-глютинирующих (ГА) титров в случае концентрированных вирусов достигало 4000 раз и зависело от начального титра вируса. Различия в сорбционных свойствах обоих образцов наноалмазов не выявлены, т. е. термообработка наноалмазов при 450oC не оказывала влияния на их сорбционные свойства. ФР или автоклавированная вода, в которых присутствовали вирусы, также не оказывали влияние на сорбцию (см. таблицу). Падения ГА-титров вирусов в вируссодер- 4000 -| 3500- 3000о. н 2500- S н 2000- < X 1500 - 1000 - 500- 0- ,биуил 22 37 сор' А0 Температура, С0 140-1 120- 100 - Q. Н S 80н < 60- X 40- 20- 0- До сорбции После Десорбция Десорбция сорбции 24ч 48ч 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000Н 500 0 д 1 I У7Л биуил сор1 д° Концентрация альбумина, мг/мл Шихта Щ Наноалмазы А/Калифорния/04/09(Н1 N1) |Щ] В/Флорида/04/06 Рис. 1. Сорбция вирусов гриппа А и В и кДНК на наноалмазы и шихту в зависимости от массы сорбентов (а), температуры среды (б), времени контакта вируса с сорбентами (в), концентрации альбумина (д); сорбция и десорбция вирусов в ФР (г); сорбция кДНК (е): дорожки 1 - плазмида PUC 19 (маркер размера фрагментов ДНК), 3 - кДНК до сорбции, 4, 5 - кДНК после сорбции на наноалмазы, 6, 7 - на шихту. жащей аллантоисной жидкости, разведенной ФР, варьировали от 2 до 8 раз. Далее проведено исследование зависимости сорбции концентрированных вирусов гриппа А/Перт/16/09 (H3N2) от следующих параметров эксперимента -массы сорбента, времени контакта с сорбентом Тмин и температурного режима. Исследование влияния массы (m) сорбентов (шихты и наноалмазов) на эффективности сорбции проводили в диапазоне m от 1 до 10 мг при других постоянных параметрах: времени контакта вируса с сорбентами Тмин = 20 мин и температуре 22oC (рис. 1, а). Начальные ГА-титры были одинаковы для всех растворов, в которые вносили сорбенты. Исследования показали, что титр вирусов < 2 ГА-единиц регистрировали для 4 мг шихты, полное удаление вирусов наноалмазами наступало при их массе 10 мг, т. е. активность шихты превышала активность алмазов при прочих равных условиях в 2,5 раза. Существенные различия поверхностных свойств могут быть обусловлены как различием в величинах удельной поверхности, так и природой этих материалов. Удельная поверхность (S) шихты составляет 450 м2/г, что существенно больше, чем S = 300 м2/г для наноалмазов. Кроме того, шихта имеет и некоторые отличия в свойствах поверхностных углеродов. В шихте содержится больше аморфного углерода. При исследовании влияния температуры окружающей среды на взаимодействие вирусов с сорбентами было установлено, что в выбранном диапазоне температур от 4 до 37oC сорбция вирусов практически одинакова Рис. 2. Электронная микроскопия кластеров наноалмазов (а), шихты (б). (рис. 1, б). Результаты исследования влияния времени контакта вирусов с выбранными сорбентами показали, что в случае шихты этот процесс происходит наиболее активно в первые 10 мин контакта, в случае наноалмазов - от 10 до 20 мин, далее он замедляется (рис. 1, в). Поэтому все исследования проводили при контакте вируса с сорбентами в течение 20 мин. Падение ГА-титра в растворе сопровождалось снижением инфекционного титра. В случае шихты уменьшение составляло 4,5 lg ЭИД50. Чтобы определить, насколько прочно удерживаются вирусы в составе иммуносорбента (вирус + наноалмазы), мы провели исследования по десорбции адсорбированных концентрированных вирусов А/Перт/16/09 и аллантоисных вирусов А/Калифорния/04/09 при стандартных условиях. Результаты показали, что десорбция в ФР при 22 и 4oC или не происходит, или крайне слабо выражена. Титр вируса в растворе после контакта иммуносорбента с ФР в течение 24-48 ч не превышал 2 ГА-единиц (рис. 1, г). Далее было проведено изучение сорбции белков невирусной природы: сывороточных белков-иммуноглобулинов и бычьего сывороточного альбумина, которые активно используются в иммунологических исследованиях (рис. 1, д). При исследовании сорбции иммунной сыворотки, содержащей антитела к вирусу гриппа В/ Флорида/04/06, на наноалмазы, титр сыворотки падал с 1280 до < 40 после контактов с наноалмазами, прошедшими термообработку, и был равен 40 в случае наноалмазов без обработки. Эти результаты свидетельствуют о том, что оба типа алмазов способны сорбировать вирусспецифические антигриппозные антитела из иммунной сыворотки, разведенной в ФР. Исследования сорбции альбумина и его способности конкурировать за места связывания на сорбенте проводили по следующей схеме. Первый этап включал сорбцию препаратов альбумина в концентрации 1, 2, 4 мг/мл на шихту. Затем комплекс шихта + альбумин массой 2 мг добавляли в растворы, содержащие равное количество вируса, далее выполняли анализ по стандартному методу. Как видно из полученных данных, альбумин в концентрациях 2-4 мг/мл конкурировал с вирусом за места связывания на сорбенте. При концентрации альбумина 1 мг/мл он не мешал связыванию сорбента с вирусами, что приводило к снижению ГА-титра с 4000 до 4 ГА-единиц, т. е. в 1000 раз. таким образом, показано, что белки невирусной природы - антитела-иммуноглобулины G и бычий сывороточный альбумин - способны взаимодействовать с сорбентами, содержащими наноалмазы. Следующим этапом работы были исследования возможности сорбции нуклеиновых кислот на выбранных сорбентах. Ампликоны - фрагменты кДНК вирусов гриппа A (H1N1)sw и вирусов гриппа В - активно взаимодействовали с сорбентами. Двунитчатые фрагменты кДНК размером 190 пар нуклеотидов (п. н.) удалялись из раствора полностью наноалмазами и шихтой. Если размеры фрагментов кДНК превышали 560 п. н., в случае шихты наблюдалось полное удаление из растворов, а в случае наноалмазов - частичное (рис. 1, е). Следует отметить, что ранее факт избирательной способности наноалмазов взаимодействовать с молекулами ДНК описан в работе [10], в которой установлена сорбция линейных молекул ДНК наноалмазами и ее отсутствие при взаимодействии с кольцевыми молекулами. Нами показано, что в случае двунитчатых молекул ДНК размер линейных фрагментов также важен для сорбции наноалмазами и не столь критичен для шихты в выбранном диапазоне длин ДНК от 190 до 560 п. н. Электронно-микроскопические исследования препаратов сорбентов показали, что в суспензиях наноалмазы и шихта собираются в агрегаты - кластеры различной формы и размеров. Зернистость поверхности более выражена у наноалмазных кластеров (рис. 2, а, б). Для практического применения в биологии и медицине важен вопрос, насколько токсичны выбранные материалы. Проведенные нами исследования взвеси наноалмазов и шихты в концентрациях от 1 до 10-4 мг/мл на лунку микропланшета с культурой клеток MDCK показали, что в этом диапазоне концентраций сорбентов деформация клеточного монослоя не происходила. Следует отметить, что в исследованиях, ранее проведенных отечественными и зарубежными учеными, отмечено отсутствие токсичности наноалмазов для клеток и животных [1, 6, 11]. Первые опыты, проведенные нами с шихтой, свидетельствуют об отсутствии у нее токсичных свойств для выбранных клеток, однако для окончательного решения этого вопроса требуются исследования на других типах клеток, а также на лабораторных животных. Рассматривая в историческом аспекте исследование наноалмазов, нужно отметить, что после их открытия более 40 лет первый этап был посвящен изучению их физико-химических свойств [4, 7]. В практике наноалмазы стали компонентами сорбентов смазок, полировочных композитов. В последние годы в мире начали активно проводиться исследования взаимодействия наноалмазов с биологическими объектами [1, 9-11]. Способность к сорбции наноалмазами белковых молекул, ферментов с сохранением их каталитической функции является основанием для создания диагностических тест-систем. Важным фактором для использования наноалмазов в медицине является отсутствие у них токсичных свойств для животных, что позволяет также рассматривать наноалмазы в качестве носителей для адресной доставки лекарств к раковым клеткам [8, 11]. Отдельным направлением исследования является изучение взаимодействия сорбентов с микроорганизмами. Этому вопросу посвящено лишь ограниченное число публикаций. Установлена способность наноалмазов сорбировать клетки E. coli [9]. В доступной литературе мы не встретили работ, посвященных взаимодействию наноалмазов с вирусами. Информация о взаимодействии шихты с биологическими объектами также отсутствовала. Полученные в работе приоритетные данные свидетельствуют о том, что наноалмазы, шихта могут взаимодействовать с оболочечными вирусами, представителями которых являются вирусы гриппа. Природа этих взаимодействий обусловлена строением поверхностного слоя наноалмазов и шихты. Эти материалы имеют разную степень чистоты и содержат на поверхности, кроме атомов углерода, различные функциональные группы, включающие атомы кислорода, азота, серы, водорода [4, 7, 11]. Именно они образуют связи с функциональными группами вирионных белков, в случае гриппа, по-видимому, - с аминокислотными группами гемагглютинина. Полученные нами результаты согласуются с физико-химическими свойствами наноалмазов и шихты. Их удельная сорбционная поверхность составляет от 300 до 450 м2/г. Это в 5-6 раз больше, чем для углеродных нанотрубок (S = 60-80 м2/г), которые не имеют примесей на поверхности. Максимальное падение ГА-титров в растворах для концентрированных вирусов гриппа в случае сорбентов, содержащих наноалмазы, достигало 4000 раз и превышало этот максимальный показатель для углеродных трубок, составлявший от 64 до 126 раз [3]. таким образом, полученные данные расширяют аспекты применения наноалмазных материалов в биологии и медицине. В частности наряду с установленными ранее адсорбционными свойствами углеродсодержащих материалов (графита и углеродных нанотрубок) в отношении вирусов наноалмазы и шихта могут быть использованы в качестве фильтров для деконтаминации растворов от микропатогенов. Работа и публикация научной статьи была поддержана кооперативным соглашением, грант № 1U51|P000527-01 CDC&P, Атланта, США, и грантом Президента РФ МК 882.2011.3.

References

Supplementary files