Взаимодействие вирусов гриппа А и В с сорбентами на основе наноалмазов


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Приведены данные о сорбции вирусов гриппа A(H1N1), A(H1N1)v, A(H3N2), B и кДНК вирусов гриппа A(H1N1) v и B на наноалмазы, шихту. Сорбция вирусов из различных растворов происходила при 4-37 oC в течение 20 мин. Интенсивность сорбции зависела от концентрации сорбента в растворе и его структуры, не зависела от антигенной формулы вирусов и температуры. Сорбирующая способность шихты в отношении вирусов гриппа A и B выше, чем наноалмазов. Установлено, что белки невирусной природы (бычий сывороточный альбумин и антитела к вирусам гриппа) также связываются обоими сорбентами. Десорбция вирусов в физиологический раствор при 4 и 22 oC не происходила в течение 48 ч.

Полный текст

В борьбе с вирусными инфекциями важное место занимает разработка профилактических мер для создания препятствий к их распространению. Для вирусов гриппа птиц, энтеровирусов, вируса гепатита A и др. водный путь передачи является одним из основных. Создание материалов, имеющих различную природу и обладающих сорбционными по отношению к вирусам свойствам, предполагает этап изучения их взаимодействия с патогенными микроорганизмами. Данная работа входит в серию работ по исследованию взаимодействия с вирусами современных углеродсодержащих наноматериалов. Ранее нами было показано, что модифицированный графит, углеродные нанотрубки взаимодействуют с вирусами гриппа A (с гемагглютининами Н1, Н3, Н5, Н7) и В, полиомиелита, бактериофагами и способны удалять их из раствора [2, 3]. Данная работа посвящена исследованию взаимодействия вирусов гриппа A и B с материалами, содержащими наноалмазы. Материалы и методы Вирусы: пандемические штаммы вирусов гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)sw1, А/Калифорния/4/09, антигенно родственные вирусу гриппа свиней [5]; эталонные штаммы А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), А/Перт/06/09 (H3N2); В/Сычуань/379/99, В/Флорида/04/06 эволюционной линии В/Ямагата/16/88; эпидемические штаммы Б/Москва/03/10, В/Москва/06/11 эволюционной линии В/Виктория/2/87. Вирусы получены из коллекции вирусов Центра экологии и эпидемиологии гриппа (ЦЭЭГ), лабораторий НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Культивирование вирусов гриппа проводили на 10-11-дневных развивающихся куриных эмбрионах (КЭ) и культуре клеток MDCK. Гемагглютини-рующую активность вирусов определяли в реакции гемагглютинации (РГА) по общепринятой методике, рекомендованной ВОЗ, с использованием 0,75% взвеси эритроцитов группы крови человека 0(I). Для определения инфекционного титра использовали заражение КЭ 10-кратными разведениями вируссодержащей жидкости. Титр вирусспецифических антител в растворах определяли в реакции торможения гемагглютинации Титр вируса, ГА-ед. Система культивирования/степень очистки/десорбция, время, T-титр, ГА-ед. Сорбент Вирус Антигенная формула до сорбции ГА после сорбции ГА Наноалмаз А/Новая Каледония/20/99 A (H1N1) 128 000 256 КЭ/очищ., конц. А/Перт/16/09 A (H3N2) 128 000 16 КЭ/конц. В/Сычуань/379/99 Линия В/Ямагата 128 < 2 КЭ/очищ., конц. В/Флорида/04/06 Линия В/Ямагата 128 2 КЭ/конц./десорбция, 48 ч, T < 2 А/Калифорния/4/09 A (H1N1)v 32 2 КЭ/аллантоисный/десорбция, 48 ч, T < 1 В/Флорида/04/06 Линия В/Ямагата 32 8 КЭ/аллантоисный В/Москва/03/2010 Линия В/Виктория 128 < 2 MDCK Наноалмаз Т А/Перт/06/09 A (H3N2) 128 000 8 КЭ/конц. В/Флорида/04/06 Линия В/Ямагата 128 2 КЭ/конц./десорбция, 48 ч, T < 2 В/Москва/03/2010 Линия В/Виктория 128 < 2 MDCK Шихта А/Новая Каледония/20/99 A (H1N1) 2000 2 КЭ/очищ., конц. В/Флорида/04/06 Линия В/Ямагата 2000 16 КЭ/конц. А/Перт/16/09 A (H3N2) 64 2 КЭ/аллантоисный В/Флорида/04/06 Линия В/Ямагата 128 32 КЭ/аллантоисный В/Москва/06/11 Линия В/Виктория 64 < 2 MDCK Примечание. Очищ. - очищенный в градиенте сахарозы препарат вируса; конц. - концентрированный препарат вируса, полученный при ультрацентрифугировании при 25 000 об/мин. (РТГА). В работе использовали иммунные крысиные сыворотки к эталонным штаммам вирусов A и B, приготовленные в ЦЭЭГ. Ампликоны - фрагменты кДНК генов современных штаммов вирусов гриппа А и В - получены в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием диагностических тест-систем “ДНК-технология”: “Пан H1N1”, “Influenza A virus”, “Influenza B virus”. Электрофорез фрагментов кДНК выполняли в 2% агарозном геле в течение 1,5 ч при напряжении 80 B, в качестве положительного контроля использовали контрольные образцы, входящие в тест-системы. Гели фотографировали и анализировали на трансиллюминаторе с ультрафиолетовым светом с длиной волны 1 = 254 нм. Использованы следующие сорбенты в виде порошков: наноалмазы Т, прошедшие термообработку при 490oC, наноалмазы без термообработки, шихта - первичный продукт детонационного синтеза наноструктурных алмазов. Сорбцию вирусов проводили из физиологического раствора (ФР), водопроводной автокла-вированной воды, аллантоисной жидкости КЭ, питательной среды Игла для культуры клеток MDCK по методу, описанному в работе [2]. Токсичность сорбентов, разведенных в ФР, исследовали на культуре клеток MDCK в микропланшете. В првую лунку вносили взвесь сорбента V = 20 мкл. Начальная концентрация сорбента в первой лунке составляла 1 мг/мл. Далее полученную суспензию разводили 1/10 и выдерживали в термостате (37oC, 18 ч). Клеточный монослой анализировали методом световой микроскопии. Электронномикроскопические исследования выполняли на препаратах, обработанных с помощью 2% водного раствора уранилацетата. Результаты и обсуждение Наноалмазы, или ультрадисперсные алмазы, можно рассматривать как специфические наноуглеродные материалы, входящие в обширное и приобретающее все большую популярность семейство наноуглерод-ных кластеров, состоящее из фуллеренов, нанотрубок, нанографита. Наноалмазы образуются в течение 0,3 мкс при детонации взрывчатых веществ тротила и гексогена при высоком давлении 16-23 гПа и температуре (Т) около 3000 К. При этом, кроме наноалмазов, образуется алмазная шихта, содержащая наряду с алмазной фазой неалмазные углероды и примеси метана [4, 7]. Выбор вирусов гриппа в качестве биологических объектов исследования обусловлен широким распространением этих вирусов в природе, поражением людей, птиц и животных, водным путем передачи инфекции в случае вирусов гриппа птиц и, возможно, пандемического штамма A(H1N1)v, интродукцией вирусов гриппа птиц в человеческую популяцию. В таблице представлены результаты взаимодействия с наноалмазами и шихтой вирусов гриппа A(H1N1), A((H3N2) и В эволюционных линий В/Виктория- и В/Ямагата-подобных. Как видно из представленных данных, при сорбции на наноалмазы падение гемаг-глютинирующих (ГА) титров в случае концентрированных вирусов достигало 4000 раз и зависело от начального титра вируса. Различия в сорбционных свойствах обоих образцов наноалмазов не выявлены, т. е. термообработка наноалмазов при 450oC не оказывала влияния на их сорбционные свойства. ФР или автоклавированная вода, в которых присутствовали вирусы, также не оказывали влияние на сорбцию (см. таблицу). Падения ГА-титров вирусов в вируссодер- 4000 -| 3500- 3000о. н 2500- S н 2000- < X 1500 - 1000 - 500- 0- ,биуил 22 37 сор' А0 Температура, С0 140-1 120- 100 - Q. Н S 80н < 60- X 40- 20- 0- До сорбции После Десорбция Десорбция сорбции 24ч 48ч 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000Н 500 0 д 1 I У7Л биуил сор1 д° Концентрация альбумина, мг/мл Шихта Щ Наноалмазы А/Калифорния/04/09(Н1 N1) |Щ] В/Флорида/04/06 Рис. 1. Сорбция вирусов гриппа А и В и кДНК на наноалмазы и шихту в зависимости от массы сорбентов (а), температуры среды (б), времени контакта вируса с сорбентами (в), концентрации альбумина (д); сорбция и десорбция вирусов в ФР (г); сорбция кДНК (е): дорожки 1 - плазмида PUC 19 (маркер размера фрагментов ДНК), 3 - кДНК до сорбции, 4, 5 - кДНК после сорбции на наноалмазы, 6, 7 - на шихту. жащей аллантоисной жидкости, разведенной ФР, варьировали от 2 до 8 раз. Далее проведено исследование зависимости сорбции концентрированных вирусов гриппа А/Перт/16/09 (H3N2) от следующих параметров эксперимента -массы сорбента, времени контакта с сорбентом Тмин и температурного режима. Исследование влияния массы (m) сорбентов (шихты и наноалмазов) на эффективности сорбции проводили в диапазоне m от 1 до 10 мг при других постоянных параметрах: времени контакта вируса с сорбентами Тмин = 20 мин и температуре 22oC (рис. 1, а). Начальные ГА-титры были одинаковы для всех растворов, в которые вносили сорбенты. Исследования показали, что титр вирусов < 2 ГА-единиц регистрировали для 4 мг шихты, полное удаление вирусов наноалмазами наступало при их массе 10 мг, т. е. активность шихты превышала активность алмазов при прочих равных условиях в 2,5 раза. Существенные различия поверхностных свойств могут быть обусловлены как различием в величинах удельной поверхности, так и природой этих материалов. Удельная поверхность (S) шихты составляет 450 м2/г, что существенно больше, чем S = 300 м2/г для наноалмазов. Кроме того, шихта имеет и некоторые отличия в свойствах поверхностных углеродов. В шихте содержится больше аморфного углерода. При исследовании влияния температуры окружающей среды на взаимодействие вирусов с сорбентами было установлено, что в выбранном диапазоне температур от 4 до 37oC сорбция вирусов практически одинакова Рис. 2. Электронная микроскопия кластеров наноалмазов (а), шихты (б). (рис. 1, б). Результаты исследования влияния времени контакта вирусов с выбранными сорбентами показали, что в случае шихты этот процесс происходит наиболее активно в первые 10 мин контакта, в случае наноалмазов - от 10 до 20 мин, далее он замедляется (рис. 1, в). Поэтому все исследования проводили при контакте вируса с сорбентами в течение 20 мин. Падение ГА-титра в растворе сопровождалось снижением инфекционного титра. В случае шихты уменьшение составляло 4,5 lg ЭИД50. Чтобы определить, насколько прочно удерживаются вирусы в составе иммуносорбента (вирус + наноалмазы), мы провели исследования по десорбции адсорбированных концентрированных вирусов А/Перт/16/09 и аллантоисных вирусов А/Калифорния/04/09 при стандартных условиях. Результаты показали, что десорбция в ФР при 22 и 4oC или не происходит, или крайне слабо выражена. Титр вируса в растворе после контакта иммуносорбента с ФР в течение 24-48 ч не превышал 2 ГА-единиц (рис. 1, г). Далее было проведено изучение сорбции белков невирусной природы: сывороточных белков-иммуноглобулинов и бычьего сывороточного альбумина, которые активно используются в иммунологических исследованиях (рис. 1, д). При исследовании сорбции иммунной сыворотки, содержащей антитела к вирусу гриппа В/ Флорида/04/06, на наноалмазы, титр сыворотки падал с 1280 до < 40 после контактов с наноалмазами, прошедшими термообработку, и был равен 40 в случае наноалмазов без обработки. Эти результаты свидетельствуют о том, что оба типа алмазов способны сорбировать вирусспецифические антигриппозные антитела из иммунной сыворотки, разведенной в ФР. Исследования сорбции альбумина и его способности конкурировать за места связывания на сорбенте проводили по следующей схеме. Первый этап включал сорбцию препаратов альбумина в концентрации 1, 2, 4 мг/мл на шихту. Затем комплекс шихта + альбумин массой 2 мг добавляли в растворы, содержащие равное количество вируса, далее выполняли анализ по стандартному методу. Как видно из полученных данных, альбумин в концентрациях 2-4 мг/мл конкурировал с вирусом за места связывания на сорбенте. При концентрации альбумина 1 мг/мл он не мешал связыванию сорбента с вирусами, что приводило к снижению ГА-титра с 4000 до 4 ГА-единиц, т. е. в 1000 раз. таким образом, показано, что белки невирусной природы - антитела-иммуноглобулины G и бычий сывороточный альбумин - способны взаимодействовать с сорбентами, содержащими наноалмазы. Следующим этапом работы были исследования возможности сорбции нуклеиновых кислот на выбранных сорбентах. Ампликоны - фрагменты кДНК вирусов гриппа A (H1N1)sw и вирусов гриппа В - активно взаимодействовали с сорбентами. Двунитчатые фрагменты кДНК размером 190 пар нуклеотидов (п. н.) удалялись из раствора полностью наноалмазами и шихтой. Если размеры фрагментов кДНК превышали 560 п. н., в случае шихты наблюдалось полное удаление из растворов, а в случае наноалмазов - частичное (рис. 1, е). Следует отметить, что ранее факт избирательной способности наноалмазов взаимодействовать с молекулами ДНК описан в работе [10], в которой установлена сорбция линейных молекул ДНК наноалмазами и ее отсутствие при взаимодействии с кольцевыми молекулами. Нами показано, что в случае двунитчатых молекул ДНК размер линейных фрагментов также важен для сорбции наноалмазами и не столь критичен для шихты в выбранном диапазоне длин ДНК от 190 до 560 п. н. Электронно-микроскопические исследования препаратов сорбентов показали, что в суспензиях наноалмазы и шихта собираются в агрегаты - кластеры различной формы и размеров. Зернистость поверхности более выражена у наноалмазных кластеров (рис. 2, а, б). Для практического применения в биологии и медицине важен вопрос, насколько токсичны выбранные материалы. Проведенные нами исследования взвеси наноалмазов и шихты в концентрациях от 1 до 10-4 мг/мл на лунку микропланшета с культурой клеток MDCK показали, что в этом диапазоне концентраций сорбентов деформация клеточного монослоя не происходила. Следует отметить, что в исследованиях, ранее проведенных отечественными и зарубежными учеными, отмечено отсутствие токсичности наноалмазов для клеток и животных [1, 6, 11]. Первые опыты, проведенные нами с шихтой, свидетельствуют об отсутствии у нее токсичных свойств для выбранных клеток, однако для окончательного решения этого вопроса требуются исследования на других типах клеток, а также на лабораторных животных. Рассматривая в историческом аспекте исследование наноалмазов, нужно отметить, что после их открытия более 40 лет первый этап был посвящен изучению их физико-химических свойств [4, 7]. В практике наноалмазы стали компонентами сорбентов смазок, полировочных композитов. В последние годы в мире начали активно проводиться исследования взаимодействия наноалмазов с биологическими объектами [1, 9-11]. Способность к сорбции наноалмазами белковых молекул, ферментов с сохранением их каталитической функции является основанием для создания диагностических тест-систем. Важным фактором для использования наноалмазов в медицине является отсутствие у них токсичных свойств для животных, что позволяет также рассматривать наноалмазы в качестве носителей для адресной доставки лекарств к раковым клеткам [8, 11]. Отдельным направлением исследования является изучение взаимодействия сорбентов с микроорганизмами. Этому вопросу посвящено лишь ограниченное число публикаций. Установлена способность наноалмазов сорбировать клетки E. coli [9]. В доступной литературе мы не встретили работ, посвященных взаимодействию наноалмазов с вирусами. Информация о взаимодействии шихты с биологическими объектами также отсутствовала. Полученные в работе приоритетные данные свидетельствуют о том, что наноалмазы, шихта могут взаимодействовать с оболочечными вирусами, представителями которых являются вирусы гриппа. Природа этих взаимодействий обусловлена строением поверхностного слоя наноалмазов и шихты. Эти материалы имеют разную степень чистоты и содержат на поверхности, кроме атомов углерода, различные функциональные группы, включающие атомы кислорода, азота, серы, водорода [4, 7, 11]. Именно они образуют связи с функциональными группами вирионных белков, в случае гриппа, по-видимому, - с аминокислотными группами гемагглютинина. Полученные нами результаты согласуются с физико-химическими свойствами наноалмазов и шихты. Их удельная сорбционная поверхность составляет от 300 до 450 м2/г. Это в 5-6 раз больше, чем для углеродных нанотрубок (S = 60-80 м2/г), которые не имеют примесей на поверхности. Максимальное падение ГА-титров в растворах для концентрированных вирусов гриппа в случае сорбентов, содержащих наноалмазы, достигало 4000 раз и превышало этот максимальный показатель для углеродных трубок, составлявший от 64 до 126 раз [3]. таким образом, полученные данные расширяют аспекты применения наноалмазных материалов в биологии и медицине. В частности наряду с установленными ранее адсорбционными свойствами углеродсодержащих материалов (графита и углеродных нанотрубок) в отношении вирусов наноалмазы и шихта могут быть использованы в качестве фильтров для деконтаминации растворов от микропатогенов. Работа и публикация научной статьи была поддержана кооперативным соглашением, грант № 1U51|P000527-01 CDC&P, Атланта, США, и грантом Президента РФ МК 882.2011.3.
×

Список литературы

  1. Бондарь В. С., Пузырь А. П., Пуртов К. В. и др. Наноалмазы с оригинальными свойствами: применение в биологии и медицине // Международный форум по нанотехнологиям. - М., 2008. - Т. 2. - С. 90-91.
  2. Иванова В. Т., Курочкина Я. Е., Буравцев В. Н. и др. Изучение взаимодействия вирусов гриппа А и В с углеродсодержащим сорбентом // Вопр. вирусол. - 2008. - № 2. - С. 40-43.
  3. Иванова В. Т., Курочкина Я. Е., Иванов В. Ф. и др. Сорбция вирусов из растворов на полианилин, углеродные нанотрубки и нанокомпозиты на их основе // Вопр. вирусол. - 2011. - № 4. - С. 19-23.
  4. Кулакова Т. М. Химия поверхности наноалмазов // Физика твердого тела. - 2004. - Т. 46, № 4. - С. 621-628.
  5. Львов В. К., Бурцева Е. И., Прилипов А. Г. и др. Изоляция 24.05.2009 и депонирование в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ 2452 от 24.05.2009) первого штамма A/IIVMoscow/01/2009 (H1N1)swl, подобного свиному вирусу A(H1N1) от первого выявленного 21.05.2009 больного в Москве // Вопр. вирусол. - 2009. - Т. 54, № 5. - С. 10-14.
  6. Пузырь А. П., Бондарь В. С., Селимханова З. Ю. и др. Результаты исследования возможности применения детонационных наноалмазов в качестве сорбента // Сиб. мед. обозр. - 2004. - Т. 2, №3. - С. 25-28.
  7. Спицын Б. В., Алексеенко А. Е., Галушко Т. Б. Функционализация наночастиц детонационного алмаза // Современные проблемы физической химии наноматериалов. - М., 2008. - С. 178-185.
  8. Adnan A., Lam R., Chen H. et al. Nanodia atomistic simulation and measurement of pH dependent cancer therapeutic interactions with nanodiamond carrier // Mol. Pharm. - 2011. - Vol. 8, N 2. - P. 368374.
  9. Liu Y. L., Sun K. W. Protein functionalized nanodiamond arrays // Nanoscale Res. Lett. -2010. - Vol. 5, N 6. - P. 1045-1050.
  10. Purtov K. V, Duratova L. P., Puzyr A. P., Bondar V. S. The interaction of liner and ring form of DNA molecules with nanodiamonds synthesized by detonation // Nanotechnology. - 2008. - Vol. 19. - P. 1-3.
  11. Schrand A. M., Hens S. A. C., Shenderova O. A. Nanodiamond particles: Properties and perspectives for bioapplications // Crit. Rev. Solid State Material Sci. - 2009. - Vol. 34, N 1-2. - P. 18-19.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Иванова В.Т., Иванова М.В., Бурцева Е.И., Гарина Е.О., Трушакова С.В., Шевченко Е.С., Маныкин А.А., Исакова А.А., Корженевский А.П., Спицын Б.В., 2012

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах