Epitope analysis of the hemagglutinin molecule of the Victoria lineage influenza B viruses

Full Text

Введение Вирусы гриппа типа В, впервые выделенные в 1940 г., в течение длительного времени составляли одну весьма гетерогенную группу возбудителей. Начиная с 1983 г. наметился дивергентный характер их эволюции с формированием двух эволюционных линий, родоначальниками которых были признаны референс-вирусы В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88 [1-3], резко отличающиеся по антигенным и генетическим свойствам и периодически (в разные эпидемические сезоны) сменяющие друг друга в циркуляции, что создает серьезные трудности при выборе штаммов для включения в состав гриппозных вакцин [4]. Установлено [5], что в результате естественного иммунопрессинга в пределах линий происходит постоянный антигенный дрейф, обусловленный мутациями в тяжелой субъединице гемагглютинина (HA1). Согласно современным представлениям, Викторианская эволюционная линия (ЭЛ) разделилась далее на две генетически независимые сублинии, а Яма- гатская - на четыре [5]. Информацию о механизмах антигенного дрейфа получают путем сравнения аминокислотного состава гемагглютинина природных изолятов и эскейп-мутантов (ЭМ), получаемых в лабораторных условиях в результате клонирования вирусов в присутствии моноклональных антител (МКА). Наблюдаемые в ходе естественной эволюции аминокислотные замены локализованы преимущественно в определенных локу- сах HA1, представляющих антигенные эпитопы этого белка. Интересно, что в этих же участках обычно происходят аминокислотные замены и у полученных в лабораторных условиях ЭМ. В задачу настоящего исследования входила разработка МКА, направленных к НА1 вирусов гриппа В Викторианской ЭЛ с последующим получением ЭМ вируса и идентификацией иммунодоминантных сайтов в составе молекулы гемагглютинина. Материалы и методы Моноклональные антитела (МКА). МКА к вирусам гриппа типа B были получены в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа по методу [6] в нижеследующей модификации. Мышей линии BALB/c иммунизировали путем введения вну- трибрюшинно 70 мкг очищенных ультрацентрифугированием вирусов гриппа В/Шандонг/07/97 или В/ Малайзия/2506/04. Спустя 3 мес мышей бустировали очищенной фракцией поверхностных гликопротеинов (ГП) тех же вирусов (15 мкг). Через 3 дня проводили гибридизацию спленоцитов иммунных мышей с клетками миеломы Px Ag. 653 в соотношении 10:1 в присутствии 50% раствора ПЭГ-2000 в среде Игла D-MEM. Первичный отбор клонов проводили по детекции антител (АТ) в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием для сенсибилизации планшет фракции ГП вируса с последующим поэтапным внесением исследуемых культуральных жидкостей и, затем, - пероксидазных конъюгатов АТ к IgG мыши (Sigma, США). Отобранные клоны гибридом, культивируемые в среде НАТ, подвергали 5- кратному реклонированию. Стабильные клоны - продуценты МКА криоконсервировали, а также использовали для получения асцитов. Селекция эскейп-мутантов (ЭМ). В целях получения ЭМ использовали ранее описанный метод [7]. Для этого вирусы дикого типа (В/Шандонг/07/97 или В/ Малайзия/2506/04) смешивали с равным количеством взятых в избыточной концентрации специфических МКА к указанным вирусам. Смеси инкубировали 1 ч при 370С, после чего вводили в куриные эмбрионы (КЭ). Через 72 ч аллантоисные жидкости исследовали в РГА. Пробы, содержащие ЭМ вируса, подвергали реклонированию методом предельных разведений, после чего исследовали их способность реагировать в реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) с панелью МКА, включая гомологичные. РТГА проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ. МКА титровали в объеме 50 мкл на 0,1 М ФСБ, после чего вносили 50 мкл вирусной суспензии, содержащей 4 АЕ вируса. После инкубации смеси в течение 1 ч в планшеты вносили по 100 мкл 1% суспензии эритроцитов. ИФА. Планшеты для ИФА («Медполимер») сенсибилизировали в течение 18 ч при 40С очищенным вирусом гриппа в концентрации 1 мкг/мл. В отмытые планшеты вносили разведения МКА на 0,1 М ФСБ, рН 7,2, содержащего 0,5% желатины и 0,05% твина-20 (ФСБ-Ж-Т). После взаимодействия МКА с вирусом в течение 1 ч при 370С планшеты отмывали 3 раза ФСБ-Т и вносили пероксидазный конъюгат АТ к IgG мыши (Sigma, США), разведенный 1:10 000 на ФСБ-Ж-Т, с последующей инкубацией в течение 1 ч при 370С. Затем в отмытые планшеты вносили смесь 3,3'5,5' тетраметилбензидина (0,1 мг/мл) и 0,003% перекиси водорода на 0,1 М ацетат- цитратном буфере, рН 5. Реакцию останавливали 2 N серной кислотой. Результат учитывали на иммунофер- ментном анализаторе Anthos 2040 (Австрия) при длине волны 450 нм. Молекулярно-генетический анализ. Выделение РНК вирусов гриппа В осуществляли с помощью набора QIAampViral RNA Mini Kit («Qiagen», США). Обратную транскрипцию РНК проводили в течение 40 мин при 37°С со случайными гексамерными праймерами с применением коммерческого набора «Реверта-L» (ЦНИИЭ, Россия). Для амплификации использовали полимеразу ДиаТак («Интерлабсервис», Россия). Прямое секвени- рование выполняли с помощью набора BigDye Ternina- tor v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) с применением генетического анализатора GA3130 (Applied Biosystems, США). Результаты и обсуждение Характеристика МКА, использованных в исследовании. В целях идентификации вируснейтрализующих эпитопов в молекуле гемагглютинина вирусов гриппа типа В Викторианской ЭЛ мы разработали панель из пяти МКА к вирусам гриппа, в том числе два к вирусу В/Шандонг/07/97 (5В7 и В/4Н1) и три - к штамму В/ Малайзия/2506/04 (9С1, 9F1 и 11F8). Согласно данным western-блотта все они были направлены к НА1. Все полученные МКА реагировали до высоких титров в ИФА (10-6) и РТГА (1: 5120-1: 20 480) с вирусами Викторианской ЭЛ при полном отсутствии взаимодействия с вирусами гриппа В Ямагатской ЭЛ и штаммами ранних (1954-1983 гг.) лет выделения. Все они обладали выраженной вируснейтрализующей активностью, что обеспечило в дальнейшем возможность получения ЭМ вируса. Вместе с тем МКА отличались по спектру реагирования в РТГА. Так, если МКА B/4H1, 9F1, 11F8 и 9С1 реагировали с различными вирусами Викторианской линии 1997-2011 гг. выделения и были направлены, по- видимому, к относительно консервативным сайтам в составе НА1, то МКА 5В7 выявляли изменчивый сайт, который был утрачен у ряда исследованных изолятов 2011 г., хотя и сохранился в составе других вирусов того же периода изоляции (табл. 1). Таблица 1 Спектр реагирования МКА 5B7, B/4H1, 9F1, 11F8 и 9C1 с различными штаммами вируса гриппа В Викторианской линии в РТГА Эволюционная линия Штамм Титр'1 МКА 5В7 B/4H1 9F1 11F8 9C1 До разделения на линии B/Грэйт Лэйк/54 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 B/Сингапур/222/79 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/СССР/100/83 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Ямагатская линия B/Ямагата/16/88 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Панама/45/90 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Пекин/184/93 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Харбин/07/04 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/С-Петербург/210/95 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Липецк/3/97 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Н.Новгород/348/97 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Яманаши/166/98 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Флорида/07/04 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 B/ Флорида /04/06 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Викторианская линия B/Шандонг/07/97 640 20480 20480 320 20480 B/Малайзия/2506/04 640 20 480 20 480 640 20 480 B/Брисбэн/60/08 320 20 480 20 480 640 20 480 B/Краснодар/7/11 < 20 20 480 20 480 320 5120 B/ Краснодар /12/11 < 20 20 480 20 480 2560 10 240 B/ С-Петербург /130/11 320 1280 20 480 1280 20 480 B/ С-Петербург /132/11 1280 20 480 20 480 2560 10 240 B/ С-Петербург /144/11 < 20 5120 20 480 640 10 240 B/ С-Петербург /177/11 < 20 20 480 20 480 640 20480 B/Екатеринбург/7/11 < 20 20 480 20 480 2560 10 240 B/ Екатеринбург /9/11 40 10 240 20 480 1280 10 240 B/ Екатеринбург /10/11 1280 20 480 20 480 2560 20 480 B/Омск/2/11 <20 2560 20 480 <20 20 480 Выявление вируснейтрализующих эпитопов в молекуле гемагглютинина вирусов гриппа В/Шандонг/07/97 и В/Малайзия/2506/04. Известно, что получение ЭМ, резистентных к действию вируснейтрализующих МКА, является ценным инструментом в изучении изменчивости антигенной структуры гемагглютинина и идентификации иммунодоминантных эпитопов в составе НА1. Использование МКА позволяет определить, является ли антигенная детерминанта вирусного белка, с которой они взаимодействуют, индуктором синтеза вирусней- трализующих АТ. Полученные с использованием МКА ЭМ имеют, как правило, одну или две, реже три нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные замены [8]. При этом в РТГА с ЭМ в сравнении с исходным вирусом наблюдается 8-32-кратное и более снижение титров МКА, использованных для селекции. Мы получили ряд ЭМ, резистентных к вируснейтрализующему действию каждого из типов МКА, за исключением МКА 9С1, что может быть объяснено высокой активностью данных МКА, полностью нейтрализовавших репродукцию вируса. В настоящее время в молекуле гемагглютинина вируса гриппа B выделяют четыре антигенно значимых домена - петля 120 и прилегающие регионы HA1 (116-137), петля 150 HA1 (141-150), петля 160 HA1 (162-167), а также спираль 190 HA1 (194- 02) и окружающие ее области [9]. Установлено [10], что эта молекула содержит шесть антигенных сайтов: BA (положения 136, 137, 141, 146, 147, 148, 149, 150, 154), BB1 (положения 194, 195, 196, 197, 199, 200, 205, 206), BB2 (положения 162, 162a-c, 163, 164, 165), BC (положения 47, 48, 80, 81, 116, Локализация аминокислотных замен в молекуле НА1 эскейп- мутантов вирусов гриппа B Викторианской линии. Трехмерная модель молекулы НА1 построена на основе кристаллической структуры ГА вируса гриппа B/Гонконг/8/73, PDB code: 3BT6, с использованием программы RasMol, версия 2.7.4.2. 276, 281), BD (положения 121, 122, 125, 126, 127, 129, 179, 180, 181, 248, 249, 252-255) и ВЕ (положения 56, 58, 68, 69, 71, 73, 75, 76). В наших исследованиях обнаружено, что ряд ЭМ, отобранных с помощью МКА, которые получены к двум разным штаммам вируса гриппа B, имели одинаковые аминокислотные замены (АкЗ), локализованные преимущественно в сайтах BD, BB1 или в непосредственной близости от последнего. Так, ЭМ 5B7 вируса гриппа B/Шандонг/07/97 и ЭМ 11F8 вируса гриппа B/Малайзия/2506/04 имели одну и ту же АкЗ в положении 122 (H122N), а ЭМ B/4H1/4 и B/4H1/6 вируса гриппа B/Шандонг/07/97 и ЭМ 9F1/2 вируса гриппа B/Малайзия/2506/04 - АкЗ в положении 203. При этом лизин, присутствующий в данном положении у вирусов ДТ, у полученных ЭМ B/4H1/4, B/4H1/6 и 9F1/2 был заменен на разные аминокислотные остатки - K203T, K203I и K203N соответственно. Другой ЕМ - 9F1/1 имел две АкЗ: A202E и A317V. Впервые идентифицированный нами эпитоп в положении 317 не был ранее указан ни в одной из известных на данный момент антигенно значимых областей НА1 вируса гриппа B, хотя в ряде работ [11, 12] показаны АкЗ в положениях 313 и 314 в HA1 природных дрейф-вариантов вируса, которые находятся в непосредственной близости от идентифицированной нами АкЗ (А317М) в составе ЭМ 9F1/1. Исходные штаммы B/Шандонг/07/97 и B/Малайзия/2506/04 различались по наличию потенциального сайта N-гликозилирования в положении 197 (NEN и NET соответственно). Все ЭМ вируса B/Малайзия/2506/04, а именно 11F8, 9F1/1 и 9F1/2, утратили потенциальный сайт N-гликозилирования в положении 197 (вне зависимости от других приобретенных аминокислотных замен), одним из наиболее вероятных объяснений чего может служить появление host-зависимых мутаций в результате реклонирования в КЭ, как это было показано ранее и в других исследованиях [13, 14]. Предполагается, что наличие потенциального сайта N-гликозилирования в положении 197 может препятствовать репликации вируса в КЭ [15]. Таблица 2 Взаимодействие полученных ЭМ (5B7, B/4H1/4, B/4H1/6, 9F1/1, 9F1/2 и 11F8) с гомологичными и гетерологичными МКА в РТГА Штамм Титр’1 МКА в РТГА Замена АК Локализация (сайт) 5В7 B/4H1 9F1 11F8 9C1 Б/Шандонг/07/97 640 20 480 20 480 320 20 480 - - Б/Малайзия/2506/04 640 20 480 20 480 640 20 480 - - ЭМ 5В7 < 20 20 480 20 480 < 20 20 480 H122N BD ЭМ B/4H1/4 640 < 20 < 20 160 < 20 K203T Вблизи BB1 ЭМ B/4H1/6 640 < 20 160 160 < 20 K203I Вблизи BB1 ЭМ 9F1/1 320 20 480 < 20 160 20 480 A202E N197S A317V Вблизи BB1 BB1 ? (выявлена впервые) ЭМ 9F1/2 320 < 20 < 20 160 < 20 K203N N197S Вблизи BB1 BB1 ЭМ 11F8 20 20480 20480 < 20 20480 H122N N197S BD BB1 Примечание. Жирным шрифтом выделены гомологичные пары ЭМ + МКА. Пространственная трехмерная модель локализации иммунодоминантных сайтов в молекуле НА1 построена нами на основе идентификации изменчивых эпитопов в составе ЭМ и опубликованных данных по кристаллической структуре молекулы HA1 вируса гриппа B/ Гонконг/8/73 (PDB code: 3BT6) с использованием программы RasMol, версия 2.7.4.2. Идентифицированы замены АК в HA1 в позиции 122 в ЭМ 5B7 (H^N) вируса гриппа B/Шандонг/07/97 и ЭМ 11F8 вируса гриппа B/ Малайзия/2506/04, а также в позиции 202 в ЭМ 9F1/1 (A-E) этого вируса и позиции 203 у ЭМ B/4H1/4 (K-T) и у ЭМ B/4H1/6 (K--I) вируса гриппа B/Шандонг/07/09. Кроме того, локализованы замена (K203N) у ЭМ 9F1/2 и замена A317V в ЭМ 9F1/1, а также N197S в ЭМ 9F1/1, ЭМ 9F1/2 и ЭМ 11F8 вируса гриппа B/ Малайзия /2506/04 (см. рисунок). Влияние аминокислотных в составе гемагглютинина ЭМ вирусов гриппа B на характер взаимодействия с МКА. Для определения влияния аминокислотных замен в молекуле НА1 на характер реагирования со специфическими АТ в перекрестной РТГА изучено взаимодействие полученных ЭМ с различными типами МКА к вирусам гриппа В Викторианской ЭЛ. Установлено, что все полученные ЭМ полностью утратили способность к взаимодействию с гомологичными МКА, использованными для селекции. Два разных ЭМ вируса гриппа B/ Шандонг/07/97 (B/4H1/4 и B/4H1/6) и мутанты вируса гриппа B/Малайзия/2506/04 (9F1/1 и 9F1/2) различались по спектру реагирования с панелью МКА. Так, ЭМ В/4Н1/4, имевший замену K203T, утратил способность к взаимодействию не только с гомологичными МКА, но и с МКА 9F1 и 9С1, тогда как ЭМ В/4Н1/6 (замена K203I) сохранил остаточную (1/128 титра) способность к связыванию МКА 9F1 при полной утрате способности к реагированию с мКа 9С1. ЭМ 9F1/1 и 9F1/2 вируса гриппа B/Малайзия/2506/04 в результате замен АК в позициях 202, 197, 317 и 203, 197 соответственно перестали реагировать с гомологичными МКА, но ЭМ 9F1/2 - одновременно и с МКА В/4Н1. Это свидетельствует о том, что для ЭМ значимым является не только определенное положение аминокислотного остатка, но и конкретная аминокислотная замена. МКА 9С1 утратили способность к связыванию с двумя ЭМ (B/4H1/4 и B/4H1/6), имевшими замену в положении 203. Такого рода отличия получены и при исследовании двух ЭМ к МКА 9F1. В частности, если ЭМ 9F1/1 с тремя заменами АК (A202E, A317V, N197S) стал резистентным только к гомологичным МКА, ЭМ 9F1/2 с двумя заменами (K203N, N197S) приобрел удивительную способность ускользать сразу от трех МКА (В/4Н1, 9F1 и 9С1). Интересно, что ЭМ 5В7 вируса гриппа B/Шандонг/07/97 практически полностью перестал реагировать с МКА 11F8, а ЭМ 11F8 - с МКА 5В7, что могло бы быть объяснено АК заменой в одном и том же положении (Н122К) в составе этих ЭМ (табл. 2). На основании данных секвенирования последовательностей НА вирусов гриппа B ранее установлено, что АК N163, E198, A202 и K203 являются высококонсервативными у вирусов Викторианской ветви и могут влиять на связывание с углеводными цепями. Кроме того, АК в положениях 202 и 203 входят в состав рецепторсвя- зывающего кармана. Значимость мутации в положении 203 предстоит изучить далее в связи с опубликованными данными [16] о том, что замена лизина в положении 203 может существенно влиять на антигенные и рецепторные свойства вирусной частицы, в частности снижать способность связываться с SA а2,3 Gal-рецепторами. Заключение Таким образом, результаты выполненных исследований дали возможность четко локализовать иммунодоми- нантные сайты в составе молекулы гемагглютинина вирусов гриппа B Викторианской ЭЛ, которые позволяют вирусу ускользать от специфического связывания с АТ. Три из полученных ЭМ имели одиночные, два - двойные и один - тройные замены аминокислот в молекуле НА1 (H122N, A202E, K203T, K203I, K203N или A317V). Кроме того, у трех ЭМ выявили замену N197S. При этом весьма важной является замена К203Т, сообщающая вирусу резистентность к разнонаправленным МКА. Подобные штаммы в меньшей мере подвержены селективному иммунопрессингу, потому с эволюционной точки зрения имеют большие перспективы длительной циркуляции в человеческой популяции.

References

Supplementary files