Эпитопный анализ молекулы гемагглютинина вирусов гриппа В Викторианской линии


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Разработана панель моноклональных антител (МКА) к гемагглютинину вирусов гриппа B Викторианской эволюционной линии, обладающих выраженной вируснейтрализующей активностью. В целях идентификации вируснейтрализующих эпитопов получены эскейп-мутанты (ЭМ) вирусов гриппа В/Шандонг/07/97 и В/Малайзия/2506/04 пассированием в присутствии этих мКа. Три из полученных ЭМ имели одиночные, два - двойные и один - тройную замены аминокислот в молекуле НА1 (H122N, А202Е, K203T, K203I, K203N или A317V). Кроме того, у трех ЭМ выявлена замена N197S. Обсуждается связь выявленных замен с особенностями реагирования Эм с МКА в реакции торможения гемагглютинации.

Полный текст

Введение Вирусы гриппа типа В, впервые выделенные в 1940 г., в течение длительного времени составляли одну весьма гетерогенную группу возбудителей. Начиная с 1983 г. наметился дивергентный характер их эволюции с формированием двух эволюционных линий, родоначальниками которых были признаны референс-вирусы В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88 [1-3], резко отличающиеся по антигенным и генетическим свойствам и периодически (в разные эпидемические сезоны) сменяющие друг друга в циркуляции, что создает серьезные трудности при выборе штаммов для включения в состав гриппозных вакцин [4]. Установлено [5], что в результате естественного иммунопрессинга в пределах линий происходит постоянный антигенный дрейф, обусловленный мутациями в тяжелой субъединице гемагглютинина (HA1). Согласно современным представлениям, Викторианская эволюционная линия (ЭЛ) разделилась далее на две генетически независимые сублинии, а Яма- гатская - на четыре [5]. Информацию о механизмах антигенного дрейфа получают путем сравнения аминокислотного состава гемагглютинина природных изолятов и эскейп-мутантов (ЭМ), получаемых в лабораторных условиях в результате клонирования вирусов в присутствии моноклональных антител (МКА). Наблюдаемые в ходе естественной эволюции аминокислотные замены локализованы преимущественно в определенных локу- сах HA1, представляющих антигенные эпитопы этого белка. Интересно, что в этих же участках обычно происходят аминокислотные замены и у полученных в лабораторных условиях ЭМ. В задачу настоящего исследования входила разработка МКА, направленных к НА1 вирусов гриппа В Викторианской ЭЛ с последующим получением ЭМ вируса и идентификацией иммунодоминантных сайтов в составе молекулы гемагглютинина. Материалы и методы Моноклональные антитела (МКА). МКА к вирусам гриппа типа B были получены в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа по методу [6] в нижеследующей модификации. Мышей линии BALB/c иммунизировали путем введения вну- трибрюшинно 70 мкг очищенных ультрацентрифугированием вирусов гриппа В/Шандонг/07/97 или В/ Малайзия/2506/04. Спустя 3 мес мышей бустировали очищенной фракцией поверхностных гликопротеинов (ГП) тех же вирусов (15 мкг). Через 3 дня проводили гибридизацию спленоцитов иммунных мышей с клетками миеломы Px Ag. 653 в соотношении 10:1 в присутствии 50% раствора ПЭГ-2000 в среде Игла D-MEM. Первичный отбор клонов проводили по детекции антител (АТ) в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием для сенсибилизации планшет фракции ГП вируса с последующим поэтапным внесением исследуемых культуральных жидкостей и, затем, - пероксидазных конъюгатов АТ к IgG мыши (Sigma, США). Отобранные клоны гибридом, культивируемые в среде НАТ, подвергали 5- кратному реклонированию. Стабильные клоны - продуценты МКА криоконсервировали, а также использовали для получения асцитов. Селекция эскейп-мутантов (ЭМ). В целях получения ЭМ использовали ранее описанный метод [7]. Для этого вирусы дикого типа (В/Шандонг/07/97 или В/ Малайзия/2506/04) смешивали с равным количеством взятых в избыточной концентрации специфических МКА к указанным вирусам. Смеси инкубировали 1 ч при 370С, после чего вводили в куриные эмбрионы (КЭ). Через 72 ч аллантоисные жидкости исследовали в РГА. Пробы, содержащие ЭМ вируса, подвергали реклонированию методом предельных разведений, после чего исследовали их способность реагировать в реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) с панелью МКА, включая гомологичные. РТГА проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ. МКА титровали в объеме 50 мкл на 0,1 М ФСБ, после чего вносили 50 мкл вирусной суспензии, содержащей 4 АЕ вируса. После инкубации смеси в течение 1 ч в планшеты вносили по 100 мкл 1% суспензии эритроцитов. ИФА. Планшеты для ИФА («Медполимер») сенсибилизировали в течение 18 ч при 40С очищенным вирусом гриппа в концентрации 1 мкг/мл. В отмытые планшеты вносили разведения МКА на 0,1 М ФСБ, рН 7,2, содержащего 0,5% желатины и 0,05% твина-20 (ФСБ-Ж-Т). После взаимодействия МКА с вирусом в течение 1 ч при 370С планшеты отмывали 3 раза ФСБ-Т и вносили пероксидазный конъюгат АТ к IgG мыши (Sigma, США), разведенный 1:10 000 на ФСБ-Ж-Т, с последующей инкубацией в течение 1 ч при 370С. Затем в отмытые планшеты вносили смесь 3,3'5,5' тетраметилбензидина (0,1 мг/мл) и 0,003% перекиси водорода на 0,1 М ацетат- цитратном буфере, рН 5. Реакцию останавливали 2 N серной кислотой. Результат учитывали на иммунофер- ментном анализаторе Anthos 2040 (Австрия) при длине волны 450 нм. Молекулярно-генетический анализ. Выделение РНК вирусов гриппа В осуществляли с помощью набора QIAampViral RNA Mini Kit («Qiagen», США). Обратную транскрипцию РНК проводили в течение 40 мин при 37°С со случайными гексамерными праймерами с применением коммерческого набора «Реверта-L» (ЦНИИЭ, Россия). Для амплификации использовали полимеразу ДиаТак («Интерлабсервис», Россия). Прямое секвени- рование выполняли с помощью набора BigDye Ternina- tor v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) с применением генетического анализатора GA3130 (Applied Biosystems, США). Результаты и обсуждение Характеристика МКА, использованных в исследовании. В целях идентификации вируснейтрализующих эпитопов в молекуле гемагглютинина вирусов гриппа типа В Викторианской ЭЛ мы разработали панель из пяти МКА к вирусам гриппа, в том числе два к вирусу В/Шандонг/07/97 (5В7 и В/4Н1) и три - к штамму В/ Малайзия/2506/04 (9С1, 9F1 и 11F8). Согласно данным western-блотта все они были направлены к НА1. Все полученные МКА реагировали до высоких титров в ИФА (10-6) и РТГА (1: 5120-1: 20 480) с вирусами Викторианской ЭЛ при полном отсутствии взаимодействия с вирусами гриппа В Ямагатской ЭЛ и штаммами ранних (1954-1983 гг.) лет выделения. Все они обладали выраженной вируснейтрализующей активностью, что обеспечило в дальнейшем возможность получения ЭМ вируса. Вместе с тем МКА отличались по спектру реагирования в РТГА. Так, если МКА B/4H1, 9F1, 11F8 и 9С1 реагировали с различными вирусами Викторианской линии 1997-2011 гг. выделения и были направлены, по- видимому, к относительно консервативным сайтам в составе НА1, то МКА 5В7 выявляли изменчивый сайт, который был утрачен у ряда исследованных изолятов 2011 г., хотя и сохранился в составе других вирусов того же периода изоляции (табл. 1). Таблица 1 Спектр реагирования МКА 5B7, B/4H1, 9F1, 11F8 и 9C1 с различными штаммами вируса гриппа В Викторианской линии в РТГА Эволюционная линия Штамм Титр'1 МКА 5В7 B/4H1 9F1 11F8 9C1 До разделения на линии B/Грэйт Лэйк/54 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 B/Сингапур/222/79 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/СССР/100/83 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Ямагатская линия B/Ямагата/16/88 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Панама/45/90 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Пекин/184/93 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Харбин/07/04 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/С-Петербург/210/95 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Липецк/3/97 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Н.Новгород/348/97 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Яманаши/166/98 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Б/Флорида/07/04 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 B/ Флорида /04/06 < 20 < 20 < 20 < 20 < 20 Викторианская линия B/Шандонг/07/97 640 20480 20480 320 20480 B/Малайзия/2506/04 640 20 480 20 480 640 20 480 B/Брисбэн/60/08 320 20 480 20 480 640 20 480 B/Краснодар/7/11 < 20 20 480 20 480 320 5120 B/ Краснодар /12/11 < 20 20 480 20 480 2560 10 240 B/ С-Петербург /130/11 320 1280 20 480 1280 20 480 B/ С-Петербург /132/11 1280 20 480 20 480 2560 10 240 B/ С-Петербург /144/11 < 20 5120 20 480 640 10 240 B/ С-Петербург /177/11 < 20 20 480 20 480 640 20480 B/Екатеринбург/7/11 < 20 20 480 20 480 2560 10 240 B/ Екатеринбург /9/11 40 10 240 20 480 1280 10 240 B/ Екатеринбург /10/11 1280 20 480 20 480 2560 20 480 B/Омск/2/11 <20 2560 20 480 <20 20 480 Выявление вируснейтрализующих эпитопов в молекуле гемагглютинина вирусов гриппа В/Шандонг/07/97 и В/Малайзия/2506/04. Известно, что получение ЭМ, резистентных к действию вируснейтрализующих МКА, является ценным инструментом в изучении изменчивости антигенной структуры гемагглютинина и идентификации иммунодоминантных эпитопов в составе НА1. Использование МКА позволяет определить, является ли антигенная детерминанта вирусного белка, с которой они взаимодействуют, индуктором синтеза вирусней- трализующих АТ. Полученные с использованием МКА ЭМ имеют, как правило, одну или две, реже три нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные замены [8]. При этом в РТГА с ЭМ в сравнении с исходным вирусом наблюдается 8-32-кратное и более снижение титров МКА, использованных для селекции. Мы получили ряд ЭМ, резистентных к вируснейтрализующему действию каждого из типов МКА, за исключением МКА 9С1, что может быть объяснено высокой активностью данных МКА, полностью нейтрализовавших репродукцию вируса. В настоящее время в молекуле гемагглютинина вируса гриппа B выделяют четыре антигенно значимых домена - петля 120 и прилегающие регионы HA1 (116-137), петля 150 HA1 (141-150), петля 160 HA1 (162-167), а также спираль 190 HA1 (194- 02) и окружающие ее области [9]. Установлено [10], что эта молекула содержит шесть антигенных сайтов: BA (положения 136, 137, 141, 146, 147, 148, 149, 150, 154), BB1 (положения 194, 195, 196, 197, 199, 200, 205, 206), BB2 (положения 162, 162a-c, 163, 164, 165), BC (положения 47, 48, 80, 81, 116, Локализация аминокислотных замен в молекуле НА1 эскейп- мутантов вирусов гриппа B Викторианской линии. Трехмерная модель молекулы НА1 построена на основе кристаллической структуры ГА вируса гриппа B/Гонконг/8/73, PDB code: 3BT6, с использованием программы RasMol, версия 2.7.4.2. 276, 281), BD (положения 121, 122, 125, 126, 127, 129, 179, 180, 181, 248, 249, 252-255) и ВЕ (положения 56, 58, 68, 69, 71, 73, 75, 76). В наших исследованиях обнаружено, что ряд ЭМ, отобранных с помощью МКА, которые получены к двум разным штаммам вируса гриппа B, имели одинаковые аминокислотные замены (АкЗ), локализованные преимущественно в сайтах BD, BB1 или в непосредственной близости от последнего. Так, ЭМ 5B7 вируса гриппа B/Шандонг/07/97 и ЭМ 11F8 вируса гриппа B/Малайзия/2506/04 имели одну и ту же АкЗ в положении 122 (H122N), а ЭМ B/4H1/4 и B/4H1/6 вируса гриппа B/Шандонг/07/97 и ЭМ 9F1/2 вируса гриппа B/Малайзия/2506/04 - АкЗ в положении 203. При этом лизин, присутствующий в данном положении у вирусов ДТ, у полученных ЭМ B/4H1/4, B/4H1/6 и 9F1/2 был заменен на разные аминокислотные остатки - K203T, K203I и K203N соответственно. Другой ЕМ - 9F1/1 имел две АкЗ: A202E и A317V. Впервые идентифицированный нами эпитоп в положении 317 не был ранее указан ни в одной из известных на данный момент антигенно значимых областей НА1 вируса гриппа B, хотя в ряде работ [11, 12] показаны АкЗ в положениях 313 и 314 в HA1 природных дрейф-вариантов вируса, которые находятся в непосредственной близости от идентифицированной нами АкЗ (А317М) в составе ЭМ 9F1/1. Исходные штаммы B/Шандонг/07/97 и B/Малайзия/2506/04 различались по наличию потенциального сайта N-гликозилирования в положении 197 (NEN и NET соответственно). Все ЭМ вируса B/Малайзия/2506/04, а именно 11F8, 9F1/1 и 9F1/2, утратили потенциальный сайт N-гликозилирования в положении 197 (вне зависимости от других приобретенных аминокислотных замен), одним из наиболее вероятных объяснений чего может служить появление host-зависимых мутаций в результате реклонирования в КЭ, как это было показано ранее и в других исследованиях [13, 14]. Предполагается, что наличие потенциального сайта N-гликозилирования в положении 197 может препятствовать репликации вируса в КЭ [15]. Таблица 2 Взаимодействие полученных ЭМ (5B7, B/4H1/4, B/4H1/6, 9F1/1, 9F1/2 и 11F8) с гомологичными и гетерологичными МКА в РТГА Штамм Титр’1 МКА в РТГА Замена АК Локализация (сайт) 5В7 B/4H1 9F1 11F8 9C1 Б/Шандонг/07/97 640 20 480 20 480 320 20 480 - - Б/Малайзия/2506/04 640 20 480 20 480 640 20 480 - - ЭМ 5В7 < 20 20 480 20 480 < 20 20 480 H122N BD ЭМ B/4H1/4 640 < 20 < 20 160 < 20 K203T Вблизи BB1 ЭМ B/4H1/6 640 < 20 160 160 < 20 K203I Вблизи BB1 ЭМ 9F1/1 320 20 480 < 20 160 20 480 A202E N197S A317V Вблизи BB1 BB1 ? (выявлена впервые) ЭМ 9F1/2 320 < 20 < 20 160 < 20 K203N N197S Вблизи BB1 BB1 ЭМ 11F8 20 20480 20480 < 20 20480 H122N N197S BD BB1 Примечание. Жирным шрифтом выделены гомологичные пары ЭМ + МКА. Пространственная трехмерная модель локализации иммунодоминантных сайтов в молекуле НА1 построена нами на основе идентификации изменчивых эпитопов в составе ЭМ и опубликованных данных по кристаллической структуре молекулы HA1 вируса гриппа B/ Гонконг/8/73 (PDB code: 3BT6) с использованием программы RasMol, версия 2.7.4.2. Идентифицированы замены АК в HA1 в позиции 122 в ЭМ 5B7 (H^N) вируса гриппа B/Шандонг/07/97 и ЭМ 11F8 вируса гриппа B/ Малайзия/2506/04, а также в позиции 202 в ЭМ 9F1/1 (A-E) этого вируса и позиции 203 у ЭМ B/4H1/4 (K-T) и у ЭМ B/4H1/6 (K--I) вируса гриппа B/Шандонг/07/09. Кроме того, локализованы замена (K203N) у ЭМ 9F1/2 и замена A317V в ЭМ 9F1/1, а также N197S в ЭМ 9F1/1, ЭМ 9F1/2 и ЭМ 11F8 вируса гриппа B/ Малайзия /2506/04 (см. рисунок). Влияние аминокислотных в составе гемагглютинина ЭМ вирусов гриппа B на характер взаимодействия с МКА. Для определения влияния аминокислотных замен в молекуле НА1 на характер реагирования со специфическими АТ в перекрестной РТГА изучено взаимодействие полученных ЭМ с различными типами МКА к вирусам гриппа В Викторианской ЭЛ. Установлено, что все полученные ЭМ полностью утратили способность к взаимодействию с гомологичными МКА, использованными для селекции. Два разных ЭМ вируса гриппа B/ Шандонг/07/97 (B/4H1/4 и B/4H1/6) и мутанты вируса гриппа B/Малайзия/2506/04 (9F1/1 и 9F1/2) различались по спектру реагирования с панелью МКА. Так, ЭМ В/4Н1/4, имевший замену K203T, утратил способность к взаимодействию не только с гомологичными МКА, но и с МКА 9F1 и 9С1, тогда как ЭМ В/4Н1/6 (замена K203I) сохранил остаточную (1/128 титра) способность к связыванию МКА 9F1 при полной утрате способности к реагированию с мКа 9С1. ЭМ 9F1/1 и 9F1/2 вируса гриппа B/Малайзия/2506/04 в результате замен АК в позициях 202, 197, 317 и 203, 197 соответственно перестали реагировать с гомологичными МКА, но ЭМ 9F1/2 - одновременно и с МКА В/4Н1. Это свидетельствует о том, что для ЭМ значимым является не только определенное положение аминокислотного остатка, но и конкретная аминокислотная замена. МКА 9С1 утратили способность к связыванию с двумя ЭМ (B/4H1/4 и B/4H1/6), имевшими замену в положении 203. Такого рода отличия получены и при исследовании двух ЭМ к МКА 9F1. В частности, если ЭМ 9F1/1 с тремя заменами АК (A202E, A317V, N197S) стал резистентным только к гомологичным МКА, ЭМ 9F1/2 с двумя заменами (K203N, N197S) приобрел удивительную способность ускользать сразу от трех МКА (В/4Н1, 9F1 и 9С1). Интересно, что ЭМ 5В7 вируса гриппа B/Шандонг/07/97 практически полностью перестал реагировать с МКА 11F8, а ЭМ 11F8 - с МКА 5В7, что могло бы быть объяснено АК заменой в одном и том же положении (Н122К) в составе этих ЭМ (табл. 2). На основании данных секвенирования последовательностей НА вирусов гриппа B ранее установлено, что АК N163, E198, A202 и K203 являются высококонсервативными у вирусов Викторианской ветви и могут влиять на связывание с углеводными цепями. Кроме того, АК в положениях 202 и 203 входят в состав рецепторсвя- зывающего кармана. Значимость мутации в положении 203 предстоит изучить далее в связи с опубликованными данными [16] о том, что замена лизина в положении 203 может существенно влиять на антигенные и рецепторные свойства вирусной частицы, в частности снижать способность связываться с SA а2,3 Gal-рецепторами. Заключение Таким образом, результаты выполненных исследований дали возможность четко локализовать иммунодоми- нантные сайты в составе молекулы гемагглютинина вирусов гриппа B Викторианской ЭЛ, которые позволяют вирусу ускользать от специфического связывания с АТ. Три из полученных ЭМ имели одиночные, два - двойные и один - тройные замены аминокислот в молекуле НА1 (H122N, A202E, K203T, K203I, K203N или A317V). Кроме того, у трех ЭМ выявили замену N197S. При этом весьма важной является замена К203Т, сообщающая вирусу резистентность к разнонаправленным МКА. Подобные штаммы в меньшей мере подвержены селективному иммунопрессингу, потому с эволюционной точки зрения имеют большие перспективы длительной циркуляции в человеческой популяции.
×

Список литературы

  1. Kanegae Y., Sugita S., Endo A., Ishida M., Senya S., Osako K., et al. Evolutionary pattern of the hemagglutinin gene of influenza B viruses isolated in Japan: cocirculating lineages in the same epidemic season. J. Virol. 1990; 64: 2860-5.
  2. McCullers J.A., Saito, T. & Iverson, A.R. Multiple genotypes of influenza B virus circulated between 1979 and 2003. J. Virol. 2004; 78: 12817-28.
  3. Shih S., Chen G., Yang C., Yang W., Liu D., Lin J. et al. Laboratory based surveillance and molecular epidemiology of influenza virus in Taiwan. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 1651-61.
  4. Соминина А.А., Лонская Н.И., Еропкин М.Ю., Литвинова О.М., Коновалова Н.И., Лобова Т.Г. и др. К вопросу о штаммовой композиции гриппозных вакцин на предстоящий эпидемический сезон 2005 - 2006 годов. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2005; 4: 3-7.
  5. Shen J., Kirk B., Ma J., Wang Q. Diversifying selective pressure on influenza B virus hemagglutinin. J. Med. Virol. 2009; 81(1): 114-24.
  6. Kohler G., Milstein C. Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. Eur. J. Immunol. 1976; 6: 511-9.
  7. Kaverin N., Rudneva I., Govorkova E., Timofeeva T., Shilov A., Kochergin-Nikitsky K., et al. Epitope mapping of the hemagglutinin molecule of a highly pathogenic H5N1 influenza virus by using monoclonal antibodies. J. Virol. 2007; 81: 12911-7.
  8. Nakagawa N., Kubota R., Nakagawa T., Okuno Y. Neutralizing epitopes specific for influenza B virus Yamagata group strains are in the ‘loop’. J. Gen. Virol. 2003; 84: 769-73.
  9. Wang Q., Cheng F., Lu M., Tian X., Ma J. Crystal structure of unliganded influenza B virus hemagglutinin. J. Virol. 2008; 82: 3011-20.
  10. Stray S., Pittman L. Subtype- and antigenic site-specific differences in biophysical influences on evolution of influenza virus hemagglutinin. Virol. J. 2012; 9:91 doi: 10.1186/1743-422X-9-91.
  11. Lindstrom S., Hiromoto Y., Nishimura H., Saito T., Nerome R., Nerome K. Comparative analysis of evolutionary mechanisms of the hemagglutinin and three internal protein genes of influenza B virus: multiple cocirculating lineages and frequent reassortment of the NP, M, and NS genes. J. Virol. 1999; 73(5): 4413-26.
  12. Лобова Т.Г., Прокопец А.В., Комиссаров А.Б., Даниленко Д.М., Паянкова В.Ф., Суховецкая В.Ф. и др. Эволюционная изменчивость вирусов гриппа В, циркулировавших в Российской Федерации с 2005 по 2012 г. Вопросы вирусологии. 2012; 54(6): 22-6.
  13. Chen Z., Aspelund A., Jin H. Stabilizing the glycosylation pattern of influenza B hemagglutinin following adaptation to growth in eggs. Vaccine. 2008; 26: 361-71.
  14. Gatherer D.J. Passage in egg culture is a major cause of apparent positive selection in influenza B hemagglutinin. J. Med. Virol. 2010; 82(1): 123-7.
  15. Saito T., Nakaya Y., Suzuki T., Ito R., Saito H., Takao S., et al. Antigenic alteration of influenza B virus associated with loss of a glycosylation site due to host-cell adaptation. J. Med. Virol. 2004; 74(2): 336-43.
  16. Wang Y., Chang C., Chi C., Wang H., Wang J., Su I. Characterization of glycan binding specificities of influenza B viruses with correlation with hemagglutinin genotypes and clinical features. J. Med. Virol. 2012; 84(4): 679-85.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Сорокин Е.В., Царева Т.Р., Соминина А.А., Писарева М.М., Комиссаров А.Б., Кошелева А.А., Гоубинин М.П., 2014

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах