Taxonomic status of the Artashat virus (ARTSV) (Bunyaviridae, Nairovirus) isolated from the ticks Ornithodoros alactagalis Issaakjan, 1936 and O. verrucosus Olenev, Sassuchin et Fenuk, 1934 (Argasidae Koch, 1844) collected in Transcaucasia

Full Text

Прототипный штамм LEIV-2366Ar вируса Арташат (ARTSV1 - Artashat virus) (депонент в Государственной коллекции вирусов РФ № ГКВ 747; авторы: Львов Д.К., Закарян В.А., Громашевский В.Л., Скворцова Т.М.) выделен от клещей Ornithodoros alactagalis Issaakjan, 1936 (Argasidae Koch, 1844), собранных в октябре 1972 г. в норе малого тушканчика (Allactaga elater Lichtenstein, 1825) в окрестностях села Аревшат (40°02' с.ш., 44°32' в.д.) (Армения, Арташатский район) [2]. В 1983 г. там же и из того же источника был изолирован второй штамм ARTSV. В 1984-1985 гг. 10 штаммов ARTSV (топотип- 1Во избежание недоразумений следует иметь в виду, что похожая аббревиатура относится к другому буньявирусу - Арты-баш (ARTV - Artybash) - из рода Hantavirus [1]. ный штамм LEIV-9000Az - депонент № ГКВ 688; авторы: Львов Д.К., Громашевский В.Л., Елкина Н.Ю., Скворцова Т.М.) выделены от клещей O. verrucosus Olenev, Sassuchin et Fenuk, 1934 из нор персидской песчанки (Meriones persicus Blanford, 1875) в Азербайджане (табл. 1) [3-8]. По данным электронной микроскопии ARTSV относится к сем. Bunyaviridae. На основании отсутствия положительных антигенных связей с другими буньяви-русами, изолированными на территории бывшего СССР [1, 10, 11], ARTSV получил статус неклассифицированного представителя этого семейства [1, 3-6]. До последнего времени ARTSV не был классифицирован даже до уровня рода. Данные по изоляции известных штаммов ARTSV представлены в табл. 1. Для корреспонденции: Львов Дмитрий Константинович, д-р мед. наук, проф., акад. РАН, dk_lvov@mail.ru 24 Семейство Bunyaviridae объединяет оболочечные вирусы с сегментированным (L-, M- и S-сегмент) геномом негативной (или с элементами амбисенс-стратегии) полярности. Семейство включает четыре рода вирусов животных (Hantavirus, Phlebovirus, Orthobunyavirus, Nairovirus) и один род вирусов растений (Tospovirus). Около 40 буньявирусов животных, подобно ARTSV, отнесены к неклассифицированным буньявирусам, поскольку не имеют выраженных антигенных связей с другими буньявирусами. К буньявирусам принадлежат многие возбудители опасных заболеваний человека, таких как Крымская-Конго геморрагическая лихорадка, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, москитные лихорадки и др. За исключением вирусов рода Hantavirus, буньявирусы животных являются арбовирусами, и их эволюция тесно связана с экологией их членистоногих переносчиков (клещи, комары, мошки) [1]. Используя метод полногеномного секвенирования, мы определили частичную последовательность генома ARTSV. На основании проведенного филогенетического анализа установили, что ARTSV является новым, самостоятельным членом рода Nairovirus. ARTSV обладает низким уровнем генетической гомологии с другими найровирусами и является прототипным вирусом новой антигенной и филогенетической группы. Материалы и методы Прототипный штамм вируса Арташат (LEIV-2366Ar) получен из Государственной Коллекции вирусов РФ ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4-е сутки) мышей забивали в соответствии с правилами этичного содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 700 мкл лизирующего буфера RLT (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе Tys-sueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделяли набором “RNeasy mini kit” (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) из 350 мкл буфера в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с помощью флюориметра Qubit (Invitrogen, США). Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле-ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплецирован-ной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с помощью набора “NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module” (Neb, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с использованием набора “MinElute PCR Purification Kit” (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIA-cube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор “TruSeq DNA Sample Prep Kits v2” (Illumina, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза “QIAxcel Advanced System” (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США; прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве “Sequencing Library qPCR Quantification Guide” (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек осуществляли на приборе MiSeq (Illu-mina, США), используя набор “MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)” в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили с помощью программы “CLC Genomics Workbench 5.5” (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с применением сервиса BLASTX (http://blast. ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ “Lasergene Core Suite” (DNAstar, США). Последовательности выравнивали по алгоритму ClustalW. Определение генетической дистанции проведено по модели p-distance с попарным удалением гэпов. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли с использованием программы MEGA5 по методу максимального правдоподобия (maximum likelihood) с 1000-кратным бутстреп-тестированием. Результаты и обсуждение Данные полногеномного секвенирования тотальной, рибодеплецированной РНК из мозга зараженных ARTSV мышей проанализировали, используя сервис BLASTX. C помощью данного сервиса провели поиск гомологичных последовательностей в базе данных Gen-Bank с ограничением по таксону “Viruses, taxid:10239”. Оказалось, что полученные последовательности генома ARTSV (ID GenBank KF801650) обладают гомологией (50-60%) только с вирусами Крымской-Конго геморрагической лихорадки (CCHFV - Crimean-Congo hemor- Таблица 1 Изоляция штаммов вируса арташат (ARTSV) в Закавказье Район сбора материала Источник изоляции Время сбора материала Коли чество штаммов Армения, Арта-шатский район Ornithodoros alactagalis из нор малого тушканчика (Allactaga elater) Октябрь 1972 г. 1 Азербайджан, Ждановский район Ornithodoros alactagalis из нор малого тушканчика (Allactaga elater) Июнь 1983 г. 1 Азербайджан, Ордубадский район Ornithodoros verrucosus из нор персидской песчанки (Meriones persicus) Сентябрь 1984 г. 2 Азербайджан, южный Кобы-стан Ornithodoros verrucosus из нор персидской песчанки (Meriones persicus) Сентябрь 1984 г. 1 Азербайджан, Косум-Измаиловский район Ornithodoros verrucosus из нор персидской песчанки (Meriones persicus) Сентябрь 1985 г. 6 Азербайджан, Евлахский район, окрестности города Мингечаур Ornithodoros verrucosus из нор персидской песчанки (Meriones persicus) Сентябрь 1985 г. 1 25 Таблица 2 Генетическая дистанция (p-distance) между наировирусами, рассчитанная на основе нуклеотидной (верхняя правая часть) и аминокислотной (левая нижняя часть) последовательности каталитического центра RdRp Вирус 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Artashat virus 1 0,58 0,46 0,53 0,56 0,49 0,48 0,45 0,44 0,42 0,48 0,56 0,49 0,47 Issyk-Kul virus 2 0,37 0,57 0,46 0,45 0,45 0,55 0,58 0,54 0,52 0,46 0,60 0,58 0,57 Caspiy virus 3 0,34 0,44 0,45 0,48 0,45 0,42 0,36 0,35 0,35 0,45 0,55 0,51 0,53 Bandia virus 4 0,37 0,30 0,37 0,27 0,38 0,45 0,48 0,47 0,47 0,44 0,53 0,56 0,54 Qalyub virus 5 0,36 0,30 0,39 0,06 0,43 0,43 0,48 0,47 0,49 0,42 0,48 0,57 0,49 Abu Hammad virus 6 0,34 0,35 0,34 0,27 0,27 0,32 0,44 0,41 0,43 0,49 0,49 0,51 0,52 Abu Mina virus 7 0,32 0,36 0,30 0,29 0,27 0,12 0,50 0,38 0,41 0,46 0,46 0,44 0,48 Punta Salinas virus 8 0,31 0,43 0,21 0,32 0,34 0,30 0,31 0,28 0,25 0,50 0,47 0,54 0,50 Farallon virus 9 0,34 0,39 0,19 0,34 0,35 0,28 0,28 0,09 0,17 0,49 0,52 0,47 0,51 Raza virus 10 0,35 0,40 0,18 0,34 0,37 0,30 0,28 0,09 0,03 0,48 0,54 0,45 0,48 Tillamook virus 11 0,27 0,29 0,26 0,30 0,30 0,31 0,29 0,34 0,30 0,30 0,50 0,49 0,50 Erve virus 12 0,37 0,42 0,45 0,40 0,43 0,40 0,39 0,35 0,37 0,37 0,37 0,44 0,43 Dugbe virus 13 0,30 0,42 0,41 0,39 0,42 0,36 0,35 0,36 0,36 0,37 0,32 0,30 0,37 Crimean-Congo virus 14 0,35 0,40 0,41 0,37 0,38 0,36 0,37 0,35 0,30 0,34 0,29 0,29 0,14 rhagic fever virus), Дугбе (DUGV - Dugbe virus), болезни овец Найроби (NSDV - Nairobi sheep disease virus) и Ер-ве (ERVEV - Erve virus), для которых известны полные нуклеотидные последовательности генома. Таким образом, на основании полученных данных установили, что ARTSV относится к роду Nairovirus (сем. Bunyaviridae) (GenBank ID: KF801650). В род Nairovirus входят около 35 вирусов, которые на основе перекрестных антигенных связей объединены в семь групп: CCHF (CCHFV и Hazara virus), NSD (Nairobi sheep disease virus, DUGV), Hughes (Hughes virus, Punta Salinas virus, Farallon virus, RAZV - Raza virus), Тиафора (ERVEV), Dera Gaza Khan (Abu Mina virus, Abu Hammad virus), Sakhalin (Sakhalin virus, Paramushir virus, Tillamook virus) и Qalyub (Qalyub virus, Bandia virus) [14]. Разделение наировирусов на группы в целом соответствует их географическому распространению и экологическим особенностям, связанных в первую очередь с их основными переносчиками - иксодовыми (Ixodidae) или аргасовыми (Argasidae) клещами. В настоящее время полные последовательности генома известны только для вирусов групп CCHF и NSD (связаны с иксодовыми клещами), а также ERVEV (группа TFAV), переносчик которого не известен. Отметим, что филогенетически ERVEV, хотя его переносчик ERVEV точно не определен, ближе к наировирусам, связанным с иксо-довыми клещами (см. рисунок) [15]. Также в предыдущих исследованиях мы определили последовательности геномов двух новых наирови-русов Иссык-Куль (ISKV) и Каспий (CASV), экология которых в основном связана с аргасовыми клещами. Филогения наировирусов изучена ранее на основе консервативного участка РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp), включающего каталитический домен [16]. Данный участок является наиболее консервативным у вирусов с РНК-геномом негативной полярности. Гомология белковых последовательностей данного участка у наировирусов составляет 65-75%. ARTSV по данному участку RdRp практически равноудален от других наи-ровирусов (табл. 2). Гомология ARTSV с наировирусами составляет от 42 (с ISKV) до 58% (с RAZV, группа Хьюз) по нуклеотидной последовательности. Гомология по аминокислотной последовательности ARTSV в среднем 65-70% (см. табл. 2). Низкий уровень гомологии ARTSV и его равноудаленное положение от остальных наировирусов позволяют классифицировать ARTSV как новый прототипный вид в составе рода Nairovirus, который образует самостоятельную антигенную и филогенетическую группу. Филогенетический анализ ARTSV провели методом максимального правдоподобия (maximum likelihood) на основе указанного участка RdRp. На дендрограмме (см. рисунок) видно, что наировирусы можно разделить на две филогенетические группы. В первую входят вирусы передаваемые иксодидами: серогруппа CCHF (CCHFV и Hazara virus - преимущественно Hyalomma и Haema-physalis, а также Dermacentor, Rhipicephalus, Ixodes); серогруппа NSD, Dugbe virus - преимущественно Am-blyomma, а также Hyalomma, Rhipicephalus, Haemaph-ysalis); серогруппа Sakhalin (Sakhalin virus, Tillamook virus, Paramushir virus - преимущественно Ixodes). Сюда же входит группа Тиафора (ERVEV), переносчик которой точно не известен. Другая филогенетическая ветвь Qualyub - Issyk-Kul virus - Qalyub virus AY359528 - Bandia virusAY357717 - Caspy virus - Raza virus AY359529 - Farallon virus AY359523 Hughes - Punta Salinas virus AY359527 - Abu Hammad virus AY357715 - Abu Mina virus AY357716 - • Artashat virus - ErvevirusAY357719 Thiafora - Dugbe virus NC004159 Dugbe - Crimean-Congo HFvirus NC005301 CCHF - Tillamook virus AY359530 Sakhalin Dera Gazi Khan Филогенетическое древо наировирусов. 26 объединяет наировирусы групп Хьюз, Дера-Гхази-Хан и Кальюб, переносчиками которых являются преимущественно аргазиды: Argas sp. и Ornithodoros (Carios) spp. К данной филогенетической линии также относятся новые наировирусы ISKV и CASV. На представленной дендрограмме видно, что ARTSV филогенетически относится к наировирусам, передаваемым иксодовыми клещами, хотя все изоляции ARTSV были получены из аргасовых клещей Ornithodoros alac-tagalis и Ornithodoros verrucosus (Argasidae) (см. табл. 1). При этом эволюционное расхождение ARTSV с CCHV. NSV и ERVEV произошло позднее отделения от них вирусов группы Сахалин (см. рисунок). Объяснить этот факт трудно. Однако можно предположить, что адаптация ARTSV к аргазидам является вторичной и произошла в результате занятия предковой, связанной с иксодовыми клещами формой ARTSV узкой, специфической ниши, связанной с аргазидами подродов Theriodoros Pospelova-Shtrom, 1950 и Pavlovskyella Pospelova-Strom, 1950. Аналогичный процесс, по-видимому, происходил с европейским наировирусом ERVEV, членистоногий переносчик которого в настоящее время не установлен. Хотя ERVEV так же, как и ARTSV, филогенетически близок к наировирусам, передаваемым иксодовыми клещами, на эндемичных территориях (юг Европы) связи ERVEV с клещами Ixodes spp. не установлено [17]. Про-тотипный штамм ERVER изолирован от землеройки Crocidura russula [18]. Адаптация ряда вирусов к аргасовым клещам (Argasidae Koch, 1844) облегчает возможность переживания вирусных популяций в зимнее время при низких температурах и в засушливый период. Способность ар-газид к длительному голоданию (до 9 лет и более), потенциальная длительность жизненного цикла (до 20-25 лет), их полифагия, экологическая пластичность как подстерегающих убежищных гематофагов определяют устойчивость природных очагов арбовирусов, передаваемых аргасовыми клещами [12, 13]. Такие очаги приурочены главным образом к аридным районам южной части умеренного пояса и субтропикам [5-7, 11]. Северная граница ареала аргасовых клещей совпадает с изолиниями длительности безморозного периода 150-180 сут в году и среднесуточной температурой выше 20°С не менее 90-100 сут в году [9, 13]. Виды аргазид из подрода Theriodoros Pospelova-Shtrom, 1950 - O. alactagalisIssaakjan, 1936, O. nereensis Pavlovskiy, 1941 - и подрода Pavlovskyella Pospelova-Strom, 1950 - O. papillipes Birula, 1895, O. verrucosus Olenev, Sassuchin et Fenuk, 1934, O. cholodkovskiy Pavlovskiy, 1930, O. tartakovskiy Olenev, 1931 - связаны главным образом с норами грызунов в отличие от видов под-рода Alectorobius Pocock, 1907 [9, 13]. Экологические особенности сужают возможности распространения и эволюции вирусов, адаптированных к аргазидам подро-дов Theriodoros и Pavlovskyella [9]. В полной мере это относится и к ARTSV, распространенному в Закавказье. Зондирование территории Закавказья проводили в рамках программы по биобезопасности и изучения биоразнообразия в различных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения Государственной коллекции вирусов Российской Федерации [7, 10-12].

References

Supplementary files