Virus-like particles based on rotavarus A recombinant VP2/VP6 proteins for assessment the antibody immune response by ELISA

Full Text

Введение

Ротавирусная инфекция (РВИ), характеризующаяся острым течением, диареей, рвотой, гастроэнтеритом, развитием общего интоксикационного синдрома, значительной степенью распространённости и летальности, является одной из основных проблем инфекционной патологии человека, животных и птиц во всём мире [1]. Ротавирус (РВ) типа А (РВА) – важнейший энтеропатоген неонатального периода человека, свиней, крупного рогатого скота, других видов млекопитающих. За счёт структурной особенности своей трёхслойной белковой оболочки, устойчивой к кислой среде желудка и пищеварительным ферментам, поражает эпителиальные клетки ворсинок тонкого отдела кишечника, вызывая их дегенерацию, некроз и десквамацию. Защита организма происходит за счёт иммунных реакций в лимфоидной ткани слизистых оболочек, в первую очередь экстраваскулярной продукции секреторного IgA (sIgA), являющегося основой иммунитета слизистых. IgG- и ранние IgM-антитела также выполняют важную эффекторную функцию в формировании как системного, так и местного иммунитета против РВИ [2].

Этиологическим агентом РВИ является икосаэдрический безоболочечный вирус рода Rotavirus семейства Reoviridae, в состав которого входят шесть структурных (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 и VP7) и пять неструктурных белков (NSP1 – NSP5/6), кодирующихся одиннадцатью сегментами двухцепочечной РНК в РВ-вирионе размером 18 555 b.p. [3]. На основе секвенирования гена белка внутреннего капсида VP6 и его молекулярных и антигенных свойств в пределах рода идентифицировано десять геногрупп/серогрупп вируса (РВA–РВJ).

Наиболее эффективной мерой борьбы с РВИ человека и животных является вакцинопрофилактика, снижающая уровень заболеваемости и предотвращающая развитие тяжёлых гастроэнтеритов и диарей. В настоящее время в мире используется несколько моно- и поливалентных вакцин, изготовленных из живых ослабленных штаммов РВА человеческого и (или) животного происхождения, однако имеется тенденция к разработке и внедрению в практику более безопасных и эффективных препаратов [4–6], в том числе и на основе нереплицирующихся вирусоподобных частиц (VLP). Предполагается, что VLP-вакцины могут снизить риск побочных эффектов, связанных с традиционными вакцинами, обеспечить повышенную защиту против родственных серотипов РВ [7–10]. Было показано, что вакцинация очищенными ротавирусными VLP вызывает иммунитет у млекопитающих против гетеротипичного РВ [11]. В нашей стране также были получены VLP, синтезированные к актуальным вирусным генотипам РВА, циркулирующим на территории Российской Федерации, и показана перспектива их использования в качестве основного компонента VLP-вакцины [12].

Оценку иммуногенности и эффективности всех типов РВА-вакцин повсеместно проводят на лабораторной модели животных, в качестве которой обычно используют грызунов или новорождённых поросят. Ранее была экспериментально доказана эффективность использования именно поросят в качестве универсальной модели для оценки качества вакцинных препаратов против РВИ человека [13, 14].

Для проведения подобных исследований необходимым условием является наличие тест-системы на основе иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющей в сжатые сроки выявить вирусспецифические антитела различных классов. Ранее нами был разработан ИФА для выявления РВА-специфических антител, относящихся к IgG-изотипу в сыворотке крови и молозиве свиней с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка VP6 (рек-VP6), полученного в бакуловирусной системе экспрессии. Выбор VP6 был не случаен, поскольку известно, что он является основным высококонсервативным группоспецифическим белком вириона, обладает выраженной иммуногенной активностью и содержится в наибольшем количестве [15]. Метод был успешно апробирован в эксперименте на новорождённых поросятах породы вьетнамская вислобрюхая при воспроизведении РВ человека и оценки протективного эффекта клонированного штамма Wa РВА [16]. Вместе с тем за рубежом уже имеются разработки, касающиеся использования различных комбинаций антигенов VLP в непрямом ИФА (VLP ELISA), например, для выявления антител к РВ типа С (РВС) [7].

Целью настоящей работы была разработка непрямого ИФА с использованием вирусоподобных частиц (VLP), состоящих из белков VP2/VP6 РВА, в качестве антигена для выявления и оценки уровня ВГА-специфических антител классов IgG, IgM, IgA в иммунном ответе к РВА.

Материалы и методы

Для получения рекомбинантного бакуловируса, содержащего ген VP2/VР6 GFP РВА, использовали рекомбинантную бакмиду, содержащую белки РВА человека VP6 и VP2, слитую с зелёным флуоресцентным белком eGFP. Получение генно-инженерной конструкции, кодирующей белки VP2-eGFP и VP6 РВА, подробно описано ранее [12]. Трансфекцию перевиваемой линии клеток Spodoptera frugiperda Sf-9 проводили очищенными препаратами бакмидной ДНК с использованием катионного липосомного агента Cellfectin (Invitrogen, США) по методике производителя. После трансфекции проводили ещё два пассажа на клетках Sf-9 для накопления вируса.

Инфекционность рекомбинантного бакуловируса определяли методом титрования в монослойной культуре Sf-21 по методике, описанной в Baculocomlete User Guide с модификациями. Клетки Sf-21 с концентрацией посевной суспензии 5 × 10⁵ клеток/см³ культивировали в двух 12-луночных планшетах в объеме 1 см³/лунка в течение 24 ч. В 24-луночном планшете готовили разведения вируса от 10^–1 до 10^–7 на питательной среде, содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку, в соотношении 0,2 см³ вируса к 1,8 см³ среды. Каждое разведение исследуемого вируса (с 10^–7 по 10^–1) в объёме 0,5 см³ вносили в три лунки одного ряда. Три лунки последнего ряда оставляли незаражёнными в качестве контроля. Инфицированные клетки оставляли для контакта с вирусом на 1 ч при комнатной температуре, после чего последовательно из каждого ряда лунок, начиная с контрольного, удаляли по 0,5 см³ разведения вируса и немедленно вносили по 1,0 см³ тёплого рабочего раствора агарозы. Через 10–20 мин, после застывания слоя агарозы, на его поверхность наносили по 0,5 см³ ростовой среды для предотвращения высыхания клеток. Инкубировали планшеты в термостате с температурой 27,0 ± 0,5 °С в течение 4 суток. После инкубации удаляли из каждой лунки планшетов по 0,5 см³ среды и добавляли по 0,5 см³ приготовленного рабочего раствора нейтрального красного. Инкубировали планшеты в термостате с температурой 27,0 ± 0,5 °С в течение 3–4 ч. По окончании срока инкубации удаляли оставшуюся жидкость и помещали планшеты в термостат с температурой 27,0 ± 0,5 °С для полного проявления бляшек. Через сутки проводили учёт результатов титрования подсчётом бляшек в световом боксе. Бляшки имеют вид неокрашенных пятнышек на монослое клеток красного цвета. Подсчитывали бляшки в ряде лунок с их количеством в пределах 5–30 в лунке. Титр вируса выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ/см³). Высчитывали среднее количество бляшек в разведении по трём лункам и определяли титр вируса, используя формулу (1):

Титр (БОЕ/см³) = А × В × 2, (1)

где А – среднее количество бляшек в разведении; В – значение, обратное степени разведения вируса; 2 – коэффициент пересчёта на 1 см³ (при объёме вносимого вируса в лунку 0,5 см³).

Очистка VP2/VP6 VLP РВА. Культуральную жидкость, содержащую VP2/VP6 VLP РВА, центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин, супернатант повторно центрифугировали 20 мин при 6000 об/мин (4 °С, ротор Sorval SS34, Thermo Scientific).

VLP из осветлённых суспензий очищали ультрацентрифугированием в течение 2 ч при 28 000 об/мин (4 °С; центрифуга Оptima XE-100, бакетный ротор SW 32Ti, Beckman Coulter, США) на подушке из 35% (w/v) сахарозы, приготовленной на буфере TNС (10 мM Tris-HCl, 140 мM NaCl, 10 мM CaCl₂; рН 7,4).

Также для получения VLP из осветлённых суспензий использовали проточное центрифугирование (центрифуга Оptima XE-100, проточный ротор CF-32, Beckman Coulter, США) 28 000 об/мин на подушке из 35% (w/v) сахарозы на буфере TNС. Осадок VLP смывали со стенок ротора буфером TNC, и полученную суспензию VLP наслаивали на 6 мл 35% (w/v) сахарозы, приготовленной на буфере TNС, центрифугировали в течение 2 ч при 28 000 об/мин (4 °С; центрифуга Оptima XE-100, бакетный ротор SW 32Ti, Beckman Coulter, США). Полученные осадки, содержащие VLP, ресуспендировали в буфере TNС и хранили при 4 °С.

Электронная микроскопия. 3 мкл препарата с концентрацией 12–30 мг/мл наносили на медную сетку, покрытую углеродной подложкой (Ted Pella, США) и обработанную в атмосфере тлеющего разряда, инкубировали 30 сек при комнатной температуре. Затем на сетку наносили каплю 2% раствора ацетата урана, выдерживали 30 сек, излишки раствора удаляли с сетки фильтровальной бумагой. Окрашенные сетки хранили в пластиковых контейнерах до использования. Исследование образцов производили в просвечивающем электронном микроскопе JEOL JEM-2100 (JEOL, Япония), оборудованном катодом из гексаборита лантана, при ускоряющем напряжении 200 кВ. Изображения получали с увеличением ×25 000 с помощью ПЗС-камеры Gatan X100 с размером матрицы 2000 × 2000 пикселей (Gatan, США).

Концентрацию белка в образцах определяли с использованием коммерческого набора Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo, США).

Чистоту и специфичность продуктов оценивали методами электрофореза в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) на приборе Mini-PROTEAN II (Bio-Rad, США) в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 В.

Экспериментальная вакцина «VLP-рота» представляет смесь VLP, состоящих из четырех рекомбинантных белков: VP2, VP4, VP6 и VP7 [12].

В качестве испытуемых проб использовали сыворотку крови мышей, морских свинок, свиней. Предварительно все испытуемые пробы были протестированы в реакции нейтрализации (РН) и по её результатам в зависимости от наличия и титра антител к РВА дифференцированы на положительные и отрицательные.

Получение РВА-специфических сывороток мышей. Для исследования использовали самок мышей линии BALB/c 3–4-недельного возраста массой 16–18 г (питомник лабораторных животных филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» Федерального медико-биологического агентства, Россия). Проводили двукратную иммунизацию экспериментальной вакциной «VLP-рота» с интервалом 14 суток. При интраназальном введении применяли лёгкий эфирный наркоз. Сформировали 7 опытных групп:

– группа 1 – внутримышечное введение с адъювантом в объёме 0,2 мл/мышь;

– группа 2 – внутримышечное введение без адъюванта в объёме 0,2 мл/мышь;

– группа 3 – внутрибрюшинное введение с адъювантом в объёме 0,2 мл/мышь;

– группа 4 – внутрибрюшинное введение без адъюванта в объёме 0,2 мл/мышь;

– группа 5 – интраназальное введение с адъювантом в объёме 0,05 мл/мышь;

– группа 6 – интраназальное введение без адъюванта в объёме 0,05 мл/мышь;

– группа 7 – контроль.

Через 7 суток после второй иммунизации от всех животных получали сыворотку крови и определяли уровень антител к РВА методом непрямого ИФА с использованием в качестве сорбированного антигена рек-VP6 и VP2/VP6 VLP РВА. Сыворотки тестировали с двойным шагом в разведениях от 1/200 до 1/25 600. Использовали пероксидазные конъюгаты анти-IgG, анти-IgM и анти-IgA мыши (Sigma) в разведении 1/2000.

Получение РВА-специфических сывороток свиней. Для исследования использовали сыворотку крови карликовых свиней после трёхкратной иммунизации с интервалом 9–10 суток экспериментальной вакциной «VLP-рота» в дозах 30, 120 мкг белка/доза. Контрольным животным вводили 0,9% NaCl. Уровень РВА-специфических антител классов IgG и IgА определяли методом непрямого ИФА с использованием в качестве сорбированного антигена VP2/VP6 VLP РВА и пероксидазные конъюгаты анти-IgG, анти-IgM и анти-IgA свиньи (Sigma).

Все испытуемые пробы сывороток также исследовали на наличие антител к РВА в коммерческом наборе Ingezim Rotavirus Porcino (Ingenasa, Испания) по методике производителя.

Получение РВА-специфических сывороток морских свинок. Морских свинок иммунизировали двукратно с интервалом 14 дней вакциной «VLP-рота» в дозах 60, 120 мкг белка/доза. Контрольным животным вводили 0,9% NaCl. Уровень РВА-специфических антител IgG-изотипа определяли методом непрямого ИФА с использованием в качестве сорбированного антигена VP2/VP6 VLP РВА и пероксидазного конъюгата анти-IgG морской свинки (Sigma).

Реакцию нейтрализации РВА с испытуемыми пробами проводили микрометодом в 96-луночных полистироловых культуральных планшетах (Costar, США) на перевиваемой культуре клеток MARC-145, выращенной на питательной среде МЕМ с глутамином с добавлением 5% эмбриональной сыворотки телёнка по стандартной методике с рабочей дозой РВА, содержащей 100 ТЦИД₅₀/100 мкл. Разведения вируса готовили в питательной среде, содержащей 10 мкг/мл трипсина. Испытуемые пробы прогревали на водяной бане при температуре 56 °С в течение 30 мин с целью инактивации неспецифических ингибиторов. Далее готовили их разведения от 1 : 10 до 1 : 1280 и вносили по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета. К разведениям сывороток добавляли по 100 мкл вируссодержащей суспензии и инкубировали смесь в течение 1 ч при 37 °С. Затем смесь переносили в 96-луночные планшеты с монослоем клеток MARC-145. Через 4–5 суток инкубации при 37 °С и 5% СО₂ проводили учёт результатов путём микроскопирования монослоя с целью определения цитопатических изменений в клетках. Вируснейтрализующий титр испытуемой пробы выражали как её предельное разведение, ингибирующее развитие цитопатического действия вируса.

Непрямой ИФА. В лунки иммунологического планшета (Greiner, Германия) вносили 0,1 мл рек-VP6 или VP2/VP6 VLP РВА (10 мкг/мл) в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5. Планшет инкубировали 18 ч при 4 °С, после чего удаляли избыток антигена пятикратной отмывкой ФСБТ (0,01 М фосфатный буфер, 170 mM NaCl, 0,1% твин-20, pH 7,4). Свободные участки пластика блокировали 1% желатином (Gerbu, Германия) в ФСБТ (1 ч при 37 °С), удаляли блокирующий раствор и вносили в лунки 0,1 мл РВА-специфических или нейтральных испытуемых сывороток в ФСБТ и 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Планшет инкубировали 1 ч при 37 °С, промывали ФСБТ и добавляли 0,1 мл меченых пероксидазой соответствующего конъюгата в рабочем разведении. Через 1 ч инкубации при 37 °С отмывали планшет ФСБТ и вносили в лунки 100 мкл субстратного раствора с тетраметилбензидином (ООО «Хема», Россия). Инкубировали 15 мин при комнатной температуре и останавливали реакцию добавлением 0,1 мл 1M H₂SO₄. Интенсивность окраски в лунках определяли на спектрофотометре с вертикальным лучом (Multiscan FC, Thermо, США) при 450 нм (А₄₅₀).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ Microsoft Office Excel 2007–2016 и статистических онлайн-калькуляторов (https://math.semestr.ru, https://medstatistic.ru).

Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus author guidelines for animal use (IAVES, July, 23 2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом организации ООО «Институт доклинических исследований» (Протокол № БЭК 4.25/21 от 02.06.2021).

Результаты

На первом этапе работы был получен рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген VP2/VP6 GFP РВА. Результат трансфекции линии клеток Sf-9 бакмидной ДНК, содержащей гены белков РВА VP6 и VP2-eGFP, представлен на рис. 1, по данным которого видно, что флуоресценция, свидетельствующая об успешной трансфекции клеток, наблюдается в 1-м пассаже и усиливается в 3-м. Для оценки бляшкообразования непосредственно перед окраской монослоя нейтральным красным проводили контроль инфицированных клеток методом флуоресцентной микроскопии (рис. 2). Титр полученного рекомбинантного бакуловируса, содержащего ген VP2/VР6 GFP РВА, в 3-м пассаже составил 2,3 × 10⁶ БОЕ/см³.

 

Рис. 1. Результат трансфекции линии клеток Sf-9 бакмидной ДНК, содержащей гены белков РВА VP6 и VP2-eGFP: а – незараженная культура клеток Sf-9 в проходящем свете; б, в – культура клеток Sf-9, зараженная рекомбинантным бакуловирусом 1-го (б) и 3-го (в) пассажа соответственно в флуоресцентном поле.

 

Рис. 2. Инокулированная культура клеток Sf-21, разведение вируса 10^–4: а – в проходящем свете; б, в, г – бляшки в флуоресцентном поле.

 

По результатам очистки установлено, что совместная экспрессия (коэкспрессия) VP2 и VP6 приводила к сборке двухслойных частиц, которые могут служить базовой структурой для всех остальных вариантов соответствующих рекомбинантных белков РВА, полученных ранее [12]. Результаты электронной микроскопии показали, что по морфологии и размеру VP2/VP6 VLP РВА соответствовали вириону нативного вируса и представляли собой трёхслойный колесообразный капсид размером 50–80 нм (рис. 3). При этом более 90% полученных частиц были собраны правильно и не разрушены, концентрация общего белка в растворе после проведённой очистки составила 10–20 мг/мл, что, вероятнее всего, и является количественным содержанием VP2/VP6 VLP РВА.

 

Рис. 3. Электронная микрофотография VP2/VP6 VLP РВА (а) и РВА (б). Увеличение ×25 000.

 

Результаты по определению структурного состава субстанции показали, что VP2/VP6 VLP РВА представляют собой гомогенную смесь двух рекомбинантных белков VP2 и VP6 с молекулярной массой приблизительно 120 кД и 45 кД соответственно (рис. 4). Антигенная активность VP2/VP6 VLP РВА была подтверждена в иммуноблоттинге с РВА-положительными пробами сывороток крови свиньи и мыши.

 

Рис. 4. Структурный анализ препарата VP2/VP6 VLP РВА методом электрофореза в 12% ПААГ-ДСН. На электрофореграмме видны две полосы, соответствующие по молекулярной массе структурным белкам VP2 и VP6 ротавируса А (120 and 45 kDa). Видимые дополнительные полосы отсутствуют.

 

Для изучения антигенной активности полученного препарата и возможности его применения в качестве антигена в иммуноферментном методе для выявления РВА-специфических антител использованы сыворотки крови мыши, свиньи и морской свинки.

При сравнении антигенной активности препаратов рекомбинантного VP6 и VP2/VP6 VLP РВА показано, что оба препарата позволяют эффективно выявлять РВА-специфические антитела IgG-, IgM- и IgA-изотипов в сыворотках крови мышей, иммунизированных VP2/VP6 VLP РВА, причём при использовании в качестве сорбированного антигена VP2/VP6 VLP РВА чувствительность тест-системы на 15–30% выше, чем при использовании рек-VP6 (рис. 5).

 

Рис. 5. Сравнительный анализ специфического связывания рек-VP6 (синие столбцы) и VP2/VP6 VLP РВА (красные столбцы) при их использовании в качестве антигена в непрямом ИФА для выявления IgG (а), IgM (б) и IgA (в) специфических антител в сыворотке крови мышей.

 

В опыте на поросятах была установлена динамика содержания РВА-специфических антител, относящихся к IgG- и IgA-изотипам в сыворотке крови животных в процессе поствакцинального иммуногенеза (рис. 6). При этом статистически достоверное повышение их уровня отмечено у животных после третьей иммунизации (r = 0,95; р < 0,05). При параллельном исследовании этих же проб в РН и ИФА-наборе зарубежного производства положительная корреляция полученных результатов установлена между VLP ИФА / РН (r = 0,9, p <0,05) и VLP ИФА / Ingezim Rotavirus Porcino (r = 0,87, p <0,05), что свидетельствует о высокой эффективности разработанной тест-системы.

 

Рис. 6. Распределение сывороточных IgG (a) и IgA (б) антител в иммунном ответе к РВА в опыте на новорождённых карликовых поросятах. В качестве антигена использован VP2/VP6 VLP РВА, испытуемые пробы отобраны до, после первой, второй и третьей иммунизации (ось абсцисс) соответственно. Приведены среднегеометрические показатели значения обратного титра антител (ось ординат).

 

Установленная динамика содержания уровня IgG-специфических поствакцинальных антител к РВА в сыворотке крови морских свинок подтвердила высокую чувствительность и специфичность метода (рис. 7).

 

Рис. 7. Кривые титрования проб сыворотки крови морских свинок в VLP ИФА, отражающие уровень вирусспецифических антител IgG. В качестве антигена использован VP2/VP6 VLP РВА, испытуемые пробы отобраны после первой (а), второй (б) и третьей (в) иммунизации соответственно. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови неиммунных животных.

 

Обсуждение

Несмотря на значительные успехи в борьбе с РВИ человека и животных, проблема разработки новых средств диагностики и специфической профилактики остаётся весьма актуальной. Прежде всего это обусловлено биологией РВ, связанной с их реассортацией (обмен геномными фрагментами между вакцинным и вирулентным вирусом или между различными РВ после одномоментного заражения) и приводящей к появлению новых, зачастую более вирулентных и трудно диагностируемых штаммов РВ. Использование VLP в вакцине (VLP-вакцина) является альтернативным подходом к замене живого вируса на более безопасный и не менее эффективный белковый иммуноген. Поскольку VLP, образующиеся путём самосборки рекомбинантных белков, экспрессируемых в клетке, обладают морфологическими и структурными особенностями, сходными с таковыми у нативных вирусов, не содержат никаких инфекционных генетических материалов, они более безопасны, чем цельновирионные вакцины. Последние данные свидетельствуют о том, что VLP представляют собой технологию платформы для вакцинации с высоким потенциалом для использования против широкого спектра инфекционных вирусов, при этом технология получения рекомбинантных белков в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы экспрессии достаточно подробно освещена в зарубежной и отечественной литературе [17–19]. В настоящем исследовании композиция VP2/VP6 VLP РВА, представляющая собой конформационную структуру двух рекомбинантных белков, помимо перспективы применения в качестве компонента вакцины, была использована в качества антигена для ИФА. Методологически этот подход коррелирует с технологией разработки ИФА для выявления IgA- и IgG-антител к РВС в сыворотке крови и молоке свиней с использованием отдельных очищенных комбинаций VLP или коктейля из всех полученных VLP РВС, показавший свою практическую эффективность [7]. Помимо высокой консервативности и иммуногенности, особенностью VP6 является наличие нескольких других полезных свойств, которые могут позволить использовать их в качестве адъювантов, иммунологических носителей и средств доставки лекарств, а также выступать в качестве каркаса для производства ценных нанобиоматериалов [20, 21].

Известно, что с биологической точки зрения основу системного иммунитета составляют антитела IgG-класса, в то время как локальная продукция специфических sIgA-антител (димерная форма молекулы IgA, связанная с секреторным компонентом) в лимфоидных тканях желудочно-кишечного, респираторного и мочеполового тракта обеспечивает местную систему защиты против вирусов. В формировании как системного иммунитета, так и иммунитета слизистых важную роль играют IgM-антитела, обеспечивающие вирусспецифическое связывание на ранней стадии иммунного ответа. Далее после изотипического переключения плазматические клетки начинают синтезировать антитела IgG и IgA. Этот процесс связан с реконструкцией ДНК В-клеток, реализуется CD4⁺-эффекторными Т-лимфоцитами и приводит к функциональному разнообразию гуморальный иммунный ответ. При энтеровирусных инфекциях изотипическое переключение с IgM на IgA происходит главным образом в зародышевых центрах В-клеток лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником (GALT). В отличие от других иммуноглобулинов, молекулы sIgA устойчивы к протеолитическому расщеплению в желудочно-кишечном тракте, и поэтому по сравнению с IgG- или IgM-антителами они наиболее эффективны в связывании с энтеропатогенами [22, 23].

Ранее нами было показано, что появление IgG-антител к РВА в сыворотке крови является маркером формирования системного иммунитета против РВИ, обеспечивающего наряду с местным выживание животных после экспериментального заражения [16].

Разработанная в настоящем исследовании тест-система позволяет выявлять не только IgG-, но и IgM- и IgA-антитела к РВА, что значительно расширяет показатели иммунного статуса организма животных (а в будущем, возможно, и человека), спектр исследуемого биологического материала и позволяет достоверно оценивать этапы формирования противовирусного иммунного ответа в доклинических исследованиях.

Заключение

Таким образом, можно сделать общий вывод о том, что разработанный ИФА с использованием VP2/VP6 VLP РВА в качестве универсального антигена выявляет весь спектр IgG-, IgM-, IgA-антител в иммунном ответе к РВА. Тест-система позволяет с высокой степенью достоверности определить уровень антител как в сыворотке крови, где IgG является основным изотипом, так и в секретах слизистых оболочек, где преобладают секреторные антитела класса IgA. Изучение распределения различных классов антител имеет важное значение в оценке иммуногенности и эффективности разрабатываемых вакцин против РВИ в доклинических исследованиях.

About the authors

Ilya E. Filatov

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: filat69rus@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5274-224X

Junior Researcher, Laboratory of Molecular Diagnostics

Россия, 123098, Moscow

Valery V. Tsibezov

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: tsibezov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2150-5764

PhD, Leading Researcher

Россия, 123098, Moscow

Marina V. Balandina

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: mbalandina77@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-8179-1379

Senior Researcher, Laboratory of Molecular Diagnostics

Россия, 123098, Moscow

Svetlana N. Norkina

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: snork9@list.ru
ORCID iD: 0009-0006-9608-4713

Senior Researcher

Россия, 123098, Moscow

Oleg E. Latyshev

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: oleglat80@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5757-3809

PhD, senior researcher at the Laboratory of Molecular Diagnostics

Россия, 123098, Moscow

Olesia V. Eliseeva

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: olesenka80@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0723-9749

Senior Researcher at the Laboratory of Molecular Diagnostics

Россия, 123098, Moscow

Stanislav A. Cherepushkin

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: cherepushkin1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1734-5369

Researcher, Laboratory of Molecular Diagnostics

Россия, 123098, Moscow

Oleg A. Verkhovsky

Diagnostic and Prevention Research Institute for human and animal diseases

Email: info@dpri.com
ORCID iD: 0000-0003-0784-9341

Professor

Россия, 123098, Moscow

Tatyana V. Grebennikova

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: t_grebennikova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6141-9361

Doctor of Biological Sciences, Professor, Corresponding Member RAS, Head Laboratory of Molecular Diagnostics

Россия, 123098, Moscow

References

Supplementary files