Использование вирусоподобных частиц на основе рекомбинантных вирусных белков VP2/VP6 ротавируса А для оценки гуморального иммунного ответа методом ИФА

Полный текст

Введение

Ротавирусная инфекция (РВИ), характеризующаяся острым течением, диареей, рвотой, гастроэнтеритом, развитием общего интоксикационного синдрома, значительной степенью распространённости и летальности, является одной из основных проблем инфекционной патологии человека, животных и птиц во всём мире [1]. Ротавирус (РВ) типа А (РВА) – важнейший энтеропатоген неонатального периода человека, свиней, крупного рогатого скота, других видов млекопитающих. За счёт структурной особенности своей трёхслойной белковой оболочки, устойчивой к кислой среде желудка и пищеварительным ферментам, поражает эпителиальные клетки ворсинок тонкого отдела кишечника, вызывая их дегенерацию, некроз и десквамацию. Защита организма происходит за счёт иммунных реакций в лимфоидной ткани слизистых оболочек, в первую очередь экстраваскулярной продукции секреторного IgA (sIgA), являющегося основой иммунитета слизистых. IgG- и ранние IgM-антитела также выполняют важную эффекторную функцию в формировании как системного, так и местного иммунитета против РВИ [2].

Этиологическим агентом РВИ является икосаэдрический безоболочечный вирус рода Rotavirus семейства Reoviridae, в состав которого входят шесть структурных (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 и VP7) и пять неструктурных белков (NSP1 – NSP5/6), кодирующихся одиннадцатью сегментами двухцепочечной РНК в РВ-вирионе размером 18 555 b.p. [3]. На основе секвенирования гена белка внутреннего капсида VP6 и его молекулярных и антигенных свойств в пределах рода идентифицировано десять геногрупп/серогрупп вируса (РВA–РВJ).

Наиболее эффективной мерой борьбы с РВИ человека и животных является вакцинопрофилактика, снижающая уровень заболеваемости и предотвращающая развитие тяжёлых гастроэнтеритов и диарей. В настоящее время в мире используется несколько моно- и поливалентных вакцин, изготовленных из живых ослабленных штаммов РВА человеческого и (или) животного происхождения, однако имеется тенденция к разработке и внедрению в практику более безопасных и эффективных препаратов [4–6], в том числе и на основе нереплицирующихся вирусоподобных частиц (VLP). Предполагается, что VLP-вакцины могут снизить риск побочных эффектов, связанных с традиционными вакцинами, обеспечить повышенную защиту против родственных серотипов РВ [7–10]. Было показано, что вакцинация очищенными ротавирусными VLP вызывает иммунитет у млекопитающих против гетеротипичного РВ [11]. В нашей стране также были получены VLP, синтезированные к актуальным вирусным генотипам РВА, циркулирующим на территории Российской Федерации, и показана перспектива их использования в качестве основного компонента VLP-вакцины [12].

Оценку иммуногенности и эффективности всех типов РВА-вакцин повсеместно проводят на лабораторной модели животных, в качестве которой обычно используют грызунов или новорождённых поросят. Ранее была экспериментально доказана эффективность использования именно поросят в качестве универсальной модели для оценки качества вакцинных препаратов против РВИ человека [13, 14].

Для проведения подобных исследований необходимым условием является наличие тест-системы на основе иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющей в сжатые сроки выявить вирусспецифические антитела различных классов. Ранее нами был разработан ИФА для выявления РВА-специфических антител, относящихся к IgG-изотипу в сыворотке крови и молозиве свиней с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка VP6 (рек-VP6), полученного в бакуловирусной системе экспрессии. Выбор VP6 был не случаен, поскольку известно, что он является основным высококонсервативным группоспецифическим белком вириона, обладает выраженной иммуногенной активностью и содержится в наибольшем количестве [15]. Метод был успешно апробирован в эксперименте на новорождённых поросятах породы вьетнамская вислобрюхая при воспроизведении РВ человека и оценки протективного эффекта клонированного штамма Wa РВА [16]. Вместе с тем за рубежом уже имеются разработки, касающиеся использования различных комбинаций антигенов VLP в непрямом ИФА (VLP ELISA), например, для выявления антител к РВ типа С (РВС) [7].

Целью настоящей работы была разработка непрямого ИФА с использованием вирусоподобных частиц (VLP), состоящих из белков VP2/VP6 РВА, в качестве антигена для выявления и оценки уровня ВГА-специфических антител классов IgG, IgM, IgA в иммунном ответе к РВА.

Материалы и методы

Для получения рекомбинантного бакуловируса, содержащего ген VP2/VР6 GFP РВА, использовали рекомбинантную бакмиду, содержащую белки РВА человека VP6 и VP2, слитую с зелёным флуоресцентным белком eGFP. Получение генно-инженерной конструкции, кодирующей белки VP2-eGFP и VP6 РВА, подробно описано ранее [12]. Трансфекцию перевиваемой линии клеток Spodoptera frugiperda Sf-9 проводили очищенными препаратами бакмидной ДНК с использованием катионного липосомного агента Cellfectin (Invitrogen, США) по методике производителя. После трансфекции проводили ещё два пассажа на клетках Sf-9 для накопления вируса.

Инфекционность рекомбинантного бакуловируса определяли методом титрования в монослойной культуре Sf-21 по методике, описанной в Baculocomlete User Guide с модификациями. Клетки Sf-21 с концентрацией посевной суспензии 5 × 10⁵ клеток/см³ культивировали в двух 12-луночных планшетах в объеме 1 см³/лунка в течение 24 ч. В 24-луночном планшете готовили разведения вируса от 10^–1 до 10^–7 на питательной среде, содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку, в соотношении 0,2 см³ вируса к 1,8 см³ среды. Каждое разведение исследуемого вируса (с 10^–7 по 10^–1) в объёме 0,5 см³ вносили в три лунки одного ряда. Три лунки последнего ряда оставляли незаражёнными в качестве контроля. Инфицированные клетки оставляли для контакта с вирусом на 1 ч при комнатной температуре, после чего последовательно из каждого ряда лунок, начиная с контрольного, удаляли по 0,5 см³ разведения вируса и немедленно вносили по 1,0 см³ тёплого рабочего раствора агарозы. Через 10–20 мин, после застывания слоя агарозы, на его поверхность наносили по 0,5 см³ ростовой среды для предотвращения высыхания клеток. Инкубировали планшеты в термостате с температурой 27,0 ± 0,5 °С в течение 4 суток. После инкубации удаляли из каждой лунки планшетов по 0,5 см³ среды и добавляли по 0,5 см³ приготовленного рабочего раствора нейтрального красного. Инкубировали планшеты в термостате с температурой 27,0 ± 0,5 °С в течение 3–4 ч. По окончании срока инкубации удаляли оставшуюся жидкость и помещали планшеты в термостат с температурой 27,0 ± 0,5 °С для полного проявления бляшек. Через сутки проводили учёт результатов титрования подсчётом бляшек в световом боксе. Бляшки имеют вид неокрашенных пятнышек на монослое клеток красного цвета. Подсчитывали бляшки в ряде лунок с их количеством в пределах 5–30 в лунке. Титр вируса выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ/см³). Высчитывали среднее количество бляшек в разведении по трём лункам и определяли титр вируса, используя формулу (1):

Титр (БОЕ/см³) = А × В × 2, (1)

где А – среднее количество бляшек в разведении; В – значение, обратное степени разведения вируса; 2 – коэффициент пересчёта на 1 см³ (при объёме вносимого вируса в лунку 0,5 см³).

Очистка VP2/VP6 VLP РВА. Культуральную жидкость, содержащую VP2/VP6 VLP РВА, центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин, супернатант повторно центрифугировали 20 мин при 6000 об/мин (4 °С, ротор Sorval SS34, Thermo Scientific).

VLP из осветлённых суспензий очищали ультрацентрифугированием в течение 2 ч при 28 000 об/мин (4 °С; центрифуга Оptima XE-100, бакетный ротор SW 32Ti, Beckman Coulter, США) на подушке из 35% (w/v) сахарозы, приготовленной на буфере TNС (10 мM Tris-HCl, 140 мM NaCl, 10 мM CaCl₂; рН 7,4).

Также для получения VLP из осветлённых суспензий использовали проточное центрифугирование (центрифуга Оptima XE-100, проточный ротор CF-32, Beckman Coulter, США) 28 000 об/мин на подушке из 35% (w/v) сахарозы на буфере TNС. Осадок VLP смывали со стенок ротора буфером TNC, и полученную суспензию VLP наслаивали на 6 мл 35% (w/v) сахарозы, приготовленной на буфере TNС, центрифугировали в течение 2 ч при 28 000 об/мин (4 °С; центрифуга Оptima XE-100, бакетный ротор SW 32Ti, Beckman Coulter, США). Полученные осадки, содержащие VLP, ресуспендировали в буфере TNС и хранили при 4 °С.

Электронная микроскопия. 3 мкл препарата с концентрацией 12–30 мг/мл наносили на медную сетку, покрытую углеродной подложкой (Ted Pella, США) и обработанную в атмосфере тлеющего разряда, инкубировали 30 сек при комнатной температуре. Затем на сетку наносили каплю 2% раствора ацетата урана, выдерживали 30 сек, излишки раствора удаляли с сетки фильтровальной бумагой. Окрашенные сетки хранили в пластиковых контейнерах до использования. Исследование образцов производили в просвечивающем электронном микроскопе JEOL JEM-2100 (JEOL, Япония), оборудованном катодом из гексаборита лантана, при ускоряющем напряжении 200 кВ. Изображения получали с увеличением ×25 000 с помощью ПЗС-камеры Gatan X100 с размером матрицы 2000 × 2000 пикселей (Gatan, США).

Концентрацию белка в образцах определяли с использованием коммерческого набора Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo, США).

Чистоту и специфичность продуктов оценивали методами электрофореза в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) на приборе Mini-PROTEAN II (Bio-Rad, США) в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 В.

Экспериментальная вакцина «VLP-рота» представляет смесь VLP, состоящих из четырех рекомбинантных белков: VP2, VP4, VP6 и VP7 [12].

В качестве испытуемых проб использовали сыворотку крови мышей, морских свинок, свиней. Предварительно все испытуемые пробы были протестированы в реакции нейтрализации (РН) и по её результатам в зависимости от наличия и титра антител к РВА дифференцированы на положительные и отрицательные.

Получение РВА-специфических сывороток мышей. Для исследования использовали самок мышей линии BALB/c 3–4-недельного возраста массой 16–18 г (питомник лабораторных животных филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» Федерального медико-биологического агентства, Россия). Проводили двукратную иммунизацию экспериментальной вакциной «VLP-рота» с интервалом 14 суток. При интраназальном введении применяли лёгкий эфирный наркоз. Сформировали 7 опытных групп:

– группа 1 – внутримышечное введение с адъювантом в объёме 0,2 мл/мышь;

– группа 2 – внутримышечное введение без адъюванта в объёме 0,2 мл/мышь;

– группа 3 – внутрибрюшинное введение с адъювантом в объёме 0,2 мл/мышь;

– группа 4 – внутрибрюшинное введение без адъюванта в объёме 0,2 мл/мышь;

– группа 5 – интраназальное введение с адъювантом в объёме 0,05 мл/мышь;

– группа 6 – интраназальное введение без адъюванта в объёме 0,05 мл/мышь;

– группа 7 – контроль.

Через 7 суток после второй иммунизации от всех животных получали сыворотку крови и определяли уровень антител к РВА методом непрямого ИФА с использованием в качестве сорбированного антигена рек-VP6 и VP2/VP6 VLP РВА. Сыворотки тестировали с двойным шагом в разведениях от 1/200 до 1/25 600. Использовали пероксидазные конъюгаты анти-IgG, анти-IgM и анти-IgA мыши (Sigma) в разведении 1/2000.

Получение РВА-специфических сывороток свиней. Для исследования использовали сыворотку крови карликовых свиней после трёхкратной иммунизации с интервалом 9–10 суток экспериментальной вакциной «VLP-рота» в дозах 30, 120 мкг белка/доза. Контрольным животным вводили 0,9% NaCl. Уровень РВА-специфических антител классов IgG и IgА определяли методом непрямого ИФА с использованием в качестве сорбированного антигена VP2/VP6 VLP РВА и пероксидазные конъюгаты анти-IgG, анти-IgM и анти-IgA свиньи (Sigma).

Все испытуемые пробы сывороток также исследовали на наличие антител к РВА в коммерческом наборе Ingezim Rotavirus Porcino (Ingenasa, Испания) по методике производителя.

Получение РВА-специфических сывороток морских свинок. Морских свинок иммунизировали двукратно с интервалом 14 дней вакциной «VLP-рота» в дозах 60, 120 мкг белка/доза. Контрольным животным вводили 0,9% NaCl. Уровень РВА-специфических антител IgG-изотипа определяли методом непрямого ИФА с использованием в качестве сорбированного антигена VP2/VP6 VLP РВА и пероксидазного конъюгата анти-IgG морской свинки (Sigma).

Реакцию нейтрализации РВА с испытуемыми пробами проводили микрометодом в 96-луночных полистироловых культуральных планшетах (Costar, США) на перевиваемой культуре клеток MARC-145, выращенной на питательной среде МЕМ с глутамином с добавлением 5% эмбриональной сыворотки телёнка по стандартной методике с рабочей дозой РВА, содержащей 100 ТЦИД₅₀/100 мкл. Разведения вируса готовили в питательной среде, содержащей 10 мкг/мл трипсина. Испытуемые пробы прогревали на водяной бане при температуре 56 °С в течение 30 мин с целью инактивации неспецифических ингибиторов. Далее готовили их разведения от 1 : 10 до 1 : 1280 и вносили по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета. К разведениям сывороток добавляли по 100 мкл вируссодержащей суспензии и инкубировали смесь в течение 1 ч при 37 °С. Затем смесь переносили в 96-луночные планшеты с монослоем клеток MARC-145. Через 4–5 суток инкубации при 37 °С и 5% СО₂ проводили учёт результатов путём микроскопирования монослоя с целью определения цитопатических изменений в клетках. Вируснейтрализующий титр испытуемой пробы выражали как её предельное разведение, ингибирующее развитие цитопатического действия вируса.

Непрямой ИФА. В лунки иммунологического планшета (Greiner, Германия) вносили 0,1 мл рек-VP6 или VP2/VP6 VLP РВА (10 мкг/мл) в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5. Планшет инкубировали 18 ч при 4 °С, после чего удаляли избыток антигена пятикратной отмывкой ФСБТ (0,01 М фосфатный буфер, 170 mM NaCl, 0,1% твин-20, pH 7,4). Свободные участки пластика блокировали 1% желатином (Gerbu, Германия) в ФСБТ (1 ч при 37 °С), удаляли блокирующий раствор и вносили в лунки 0,1 мл РВА-специфических или нейтральных испытуемых сывороток в ФСБТ и 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Планшет инкубировали 1 ч при 37 °С, промывали ФСБТ и добавляли 0,1 мл меченых пероксидазой соответствующего конъюгата в рабочем разведении. Через 1 ч инкубации при 37 °С отмывали планшет ФСБТ и вносили в лунки 100 мкл субстратного раствора с тетраметилбензидином (ООО «Хема», Россия). Инкубировали 15 мин при комнатной температуре и останавливали реакцию добавлением 0,1 мл 1M H₂SO₄. Интенсивность окраски в лунках определяли на спектрофотометре с вертикальным лучом (Multiscan FC, Thermо, США) при 450 нм (А₄₅₀).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ Microsoft Office Excel 2007–2016 и статистических онлайн-калькуляторов (https://math.semestr.ru, https://medstatistic.ru).

Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus author guidelines for animal use (IAVES, July, 23 2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом организации ООО «Институт доклинических исследований» (Протокол № БЭК 4.25/21 от 02.06.2021).

Результаты

На первом этапе работы был получен рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген VP2/VP6 GFP РВА. Результат трансфекции линии клеток Sf-9 бакмидной ДНК, содержащей гены белков РВА VP6 и VP2-eGFP, представлен на рис. 1, по данным которого видно, что флуоресценция, свидетельствующая об успешной трансфекции клеток, наблюдается в 1-м пассаже и усиливается в 3-м. Для оценки бляшкообразования непосредственно перед окраской монослоя нейтральным красным проводили контроль инфицированных клеток методом флуоресцентной микроскопии (рис. 2). Титр полученного рекомбинантного бакуловируса, содержащего ген VP2/VР6 GFP РВА, в 3-м пассаже составил 2,3 × 10⁶ БОЕ/см³.

 

Рис. 1. Результат трансфекции линии клеток Sf-9 бакмидной ДНК, содержащей гены белков РВА VP6 и VP2-eGFP: а – незараженная культура клеток Sf-9 в проходящем свете; б, в – культура клеток Sf-9, зараженная рекомбинантным бакуловирусом 1-го (б) и 3-го (в) пассажа соответственно в флуоресцентном поле.

 

Рис. 2. Инокулированная культура клеток Sf-21, разведение вируса 10^–4: а – в проходящем свете; б, в, г – бляшки в флуоресцентном поле.

 

По результатам очистки установлено, что совместная экспрессия (коэкспрессия) VP2 и VP6 приводила к сборке двухслойных частиц, которые могут служить базовой структурой для всех остальных вариантов соответствующих рекомбинантных белков РВА, полученных ранее [12]. Результаты электронной микроскопии показали, что по морфологии и размеру VP2/VP6 VLP РВА соответствовали вириону нативного вируса и представляли собой трёхслойный колесообразный капсид размером 50–80 нм (рис. 3). При этом более 90% полученных частиц были собраны правильно и не разрушены, концентрация общего белка в растворе после проведённой очистки составила 10–20 мг/мл, что, вероятнее всего, и является количественным содержанием VP2/VP6 VLP РВА.

 

Рис. 3. Электронная микрофотография VP2/VP6 VLP РВА (а) и РВА (б). Увеличение ×25 000.

 

Результаты по определению структурного состава субстанции показали, что VP2/VP6 VLP РВА представляют собой гомогенную смесь двух рекомбинантных белков VP2 и VP6 с молекулярной массой приблизительно 120 кД и 45 кД соответственно (рис. 4). Антигенная активность VP2/VP6 VLP РВА была подтверждена в иммуноблоттинге с РВА-положительными пробами сывороток крови свиньи и мыши.

 

Рис. 4. Структурный анализ препарата VP2/VP6 VLP РВА методом электрофореза в 12% ПААГ-ДСН. На электрофореграмме видны две полосы, соответствующие по молекулярной массе структурным белкам VP2 и VP6 ротавируса А (120 and 45 kDa). Видимые дополнительные полосы отсутствуют.

 

Для изучения антигенной активности полученного препарата и возможности его применения в качестве антигена в иммуноферментном методе для выявления РВА-специфических антител использованы сыворотки крови мыши, свиньи и морской свинки.

При сравнении антигенной активности препаратов рекомбинантного VP6 и VP2/VP6 VLP РВА показано, что оба препарата позволяют эффективно выявлять РВА-специфические антитела IgG-, IgM- и IgA-изотипов в сыворотках крови мышей, иммунизированных VP2/VP6 VLP РВА, причём при использовании в качестве сорбированного антигена VP2/VP6 VLP РВА чувствительность тест-системы на 15–30% выше, чем при использовании рек-VP6 (рис. 5).

 

Рис. 5. Сравнительный анализ специфического связывания рек-VP6 (синие столбцы) и VP2/VP6 VLP РВА (красные столбцы) при их использовании в качестве антигена в непрямом ИФА для выявления IgG (а), IgM (б) и IgA (в) специфических антител в сыворотке крови мышей.

 

В опыте на поросятах была установлена динамика содержания РВА-специфических антител, относящихся к IgG- и IgA-изотипам в сыворотке крови животных в процессе поствакцинального иммуногенеза (рис. 6). При этом статистически достоверное повышение их уровня отмечено у животных после третьей иммунизации (r = 0,95; р < 0,05). При параллельном исследовании этих же проб в РН и ИФА-наборе зарубежного производства положительная корреляция полученных результатов установлена между VLP ИФА / РН (r = 0,9, p <0,05) и VLP ИФА / Ingezim Rotavirus Porcino (r = 0,87, p <0,05), что свидетельствует о высокой эффективности разработанной тест-системы.

 

Рис. 6. Распределение сывороточных IgG (a) и IgA (б) антител в иммунном ответе к РВА в опыте на новорождённых карликовых поросятах. В качестве антигена использован VP2/VP6 VLP РВА, испытуемые пробы отобраны до, после первой, второй и третьей иммунизации (ось абсцисс) соответственно. Приведены среднегеометрические показатели значения обратного титра антител (ось ординат).

 

Установленная динамика содержания уровня IgG-специфических поствакцинальных антител к РВА в сыворотке крови морских свинок подтвердила высокую чувствительность и специфичность метода (рис. 7).

 

Рис. 7. Кривые титрования проб сыворотки крови морских свинок в VLP ИФА, отражающие уровень вирусспецифических антител IgG. В качестве антигена использован VP2/VP6 VLP РВА, испытуемые пробы отобраны после первой (а), второй (б) и третьей (в) иммунизации соответственно. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови неиммунных животных.

 

Обсуждение

Несмотря на значительные успехи в борьбе с РВИ человека и животных, проблема разработки новых средств диагностики и специфической профилактики остаётся весьма актуальной. Прежде всего это обусловлено биологией РВ, связанной с их реассортацией (обмен геномными фрагментами между вакцинным и вирулентным вирусом или между различными РВ после одномоментного заражения) и приводящей к появлению новых, зачастую более вирулентных и трудно диагностируемых штаммов РВ. Использование VLP в вакцине (VLP-вакцина) является альтернативным подходом к замене живого вируса на более безопасный и не менее эффективный белковый иммуноген. Поскольку VLP, образующиеся путём самосборки рекомбинантных белков, экспрессируемых в клетке, обладают морфологическими и структурными особенностями, сходными с таковыми у нативных вирусов, не содержат никаких инфекционных генетических материалов, они более безопасны, чем цельновирионные вакцины. Последние данные свидетельствуют о том, что VLP представляют собой технологию платформы для вакцинации с высоким потенциалом для использования против широкого спектра инфекционных вирусов, при этом технология получения рекомбинантных белков в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы экспрессии достаточно подробно освещена в зарубежной и отечественной литературе [17–19]. В настоящем исследовании композиция VP2/VP6 VLP РВА, представляющая собой конформационную структуру двух рекомбинантных белков, помимо перспективы применения в качестве компонента вакцины, была использована в качества антигена для ИФА. Методологически этот подход коррелирует с технологией разработки ИФА для выявления IgA- и IgG-антител к РВС в сыворотке крови и молоке свиней с использованием отдельных очищенных комбинаций VLP или коктейля из всех полученных VLP РВС, показавший свою практическую эффективность [7]. Помимо высокой консервативности и иммуногенности, особенностью VP6 является наличие нескольких других полезных свойств, которые могут позволить использовать их в качестве адъювантов, иммунологических носителей и средств доставки лекарств, а также выступать в качестве каркаса для производства ценных нанобиоматериалов [20, 21].

Известно, что с биологической точки зрения основу системного иммунитета составляют антитела IgG-класса, в то время как локальная продукция специфических sIgA-антител (димерная форма молекулы IgA, связанная с секреторным компонентом) в лимфоидных тканях желудочно-кишечного, респираторного и мочеполового тракта обеспечивает местную систему защиты против вирусов. В формировании как системного иммунитета, так и иммунитета слизистых важную роль играют IgM-антитела, обеспечивающие вирусспецифическое связывание на ранней стадии иммунного ответа. Далее после изотипического переключения плазматические клетки начинают синтезировать антитела IgG и IgA. Этот процесс связан с реконструкцией ДНК В-клеток, реализуется CD4⁺-эффекторными Т-лимфоцитами и приводит к функциональному разнообразию гуморальный иммунный ответ. При энтеровирусных инфекциях изотипическое переключение с IgM на IgA происходит главным образом в зародышевых центрах В-клеток лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником (GALT). В отличие от других иммуноглобулинов, молекулы sIgA устойчивы к протеолитическому расщеплению в желудочно-кишечном тракте, и поэтому по сравнению с IgG- или IgM-антителами они наиболее эффективны в связывании с энтеропатогенами [22, 23].

Ранее нами было показано, что появление IgG-антител к РВА в сыворотке крови является маркером формирования системного иммунитета против РВИ, обеспечивающего наряду с местным выживание животных после экспериментального заражения [16].

Разработанная в настоящем исследовании тест-система позволяет выявлять не только IgG-, но и IgM- и IgA-антитела к РВА, что значительно расширяет показатели иммунного статуса организма животных (а в будущем, возможно, и человека), спектр исследуемого биологического материала и позволяет достоверно оценивать этапы формирования противовирусного иммунного ответа в доклинических исследованиях.

Заключение

Таким образом, можно сделать общий вывод о том, что разработанный ИФА с использованием VP2/VP6 VLP РВА в качестве универсального антигена выявляет весь спектр IgG-, IgM-, IgA-антител в иммунном ответе к РВА. Тест-система позволяет с высокой степенью достоверности определить уровень антител как в сыворотке крови, где IgG является основным изотипом, так и в секретах слизистых оболочек, где преобладают секреторные антитела класса IgA. Изучение распределения различных классов антител имеет важное значение в оценке иммуногенности и эффективности разрабатываемых вакцин против РВИ в доклинических исследованиях.

Об авторах

Илья Евгеньевич Филатов

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: filat69rus@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5274-224X

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, г. Москва

Валерий Владимирович Цибезов

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: tsibezov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2150-5764

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, лаборатории средств специфической профилактики вирусных болезней

Россия, 123098, г. Москва

Марина Владимировна Баландина

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: mbalandina77@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-8179-1379

старший научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, г. Москва

Светлана Николаевна Норкина

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: snork9@list.ru
ORCID iD: 0009-0006-9608-4713

старший научный сотрудник лаборатории средств специфической профилактики вирусных болезней

Россия, 123098, г. Москва

Олег Евгеньевич Латышев

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: oleglat80@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5757-3809

к.б.н., заведующий лабораторией иммунологии

Россия, 123098, г. Москва

Олеся Васильевна Елисеева

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: olesenka80@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0723-9749

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, г. Москва

Станислав Андреевич Черепушкин

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: cherepushkin1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1734-5369

научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, г. Москва

Олег Анатольевич Верховский

АНО «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных»

Email: info@dpri.com
ORCID iD: 0000-0003-0784-9341

доктор биологических наук, профессор, президент

Россия, 123098, г. Москва

Татьяна Владимировна Гребенникова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: t_grebennikova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6141-9361

доктор биологических наук, профессор, чл-корр. РАН, зав. лабораторией молекулярной диагностики

Россия, 123098, г. Москва

Список литературы

Дополнительные файлы