Assesment of specific T-cell immunity to SARS-CoV-2 virus antigens in COVID-19 reconvalescents

Full Text

Введение

Стремительное развитие пандемии, связанной с коронавирусом SARS-CoV-2, и тяжесть протекания заболевания COVID-19 послужили стимулом к научным исследованиям, направленным на изучение патогенеза данного заболевания, поиск способов его лечения, механизмов формирования иммунитета против SARS-CoV-2 и разработку вакцин.

В целом ряде исследований после активации лимфоцитов антигенами SARS-CoV-2 были выявлены Т-клетки памяти среди как CD4⁺, так и CD8⁺ в большинстве образцов мононуклеаров из крови взрослых пациентов с COVID-19 (80–100 и 70–80% соответственно) [1–8]. Установлено, что формирование этих клеток вызывается широким кругом структурных и неструктурных белков вируса, выявлено множество иммунодоминантных эпитопов. Оценивались специфичность, величина и кинетика ответа у пациентов, связь этих аспектов с тяжестью заболевания [9–11]. Изучали значение перекрёстной реактивности Т-клеток памяти к сезонным коронавирусам (OC43, HKU1, NL63 и 229E) для тяжести течения COVID-19 [12].

При разработке вакцин против SARS-CoV-2 стимуляция не только гуморального, но и Т-клеточного иммунитета рассматривалась как важный целевой пункт [13–16]. Для этого требуются скрининговые методы, отвечающие следующим требованиям:

– невысокая стоимость;

– отсутствие необходимости в высокотехнологичном оборудовании;

– отсутствие необходимости в большом объёме крови пациента;

– возможность получения ответа в короткие сроки.

Кандидаты в такие методы были разработаны в 2020 г. и относятся к группе технологий IGRA (Interferon Gamma Releasing Assay – тесты, основанные на регистрации антиген-стимулированного выделения интерферона гамма (IFN-γ)).

В наборе «Тигра-Тест SARS-CoV-2» результат обследования достигается использованием готовой комбинации пептидов S-белка (AГ1) и комбинации пептидов белков N, M, ORF3a и ORF7a (АГ2), измерение проводится на оборудовании для ELISPOT и требует соответствующей квалификации сотрудников, а также содержит дорогостоящие реагенты [17].

Технология QuantiFERON, как и ELISPOT, относится к группе технологий IGRA. Первоначально эта технология имела коммерческую реализацию в виде набора для диагностики Т-клеточного иммунитета против туберкулёза (QuantiFERON-TB Gold), затем для диагностики Т-клеточного иммунитета против цитомегаловирусной инфекции (QuantiFERON-CMV), а в настоящее время и против SARS-CoV-2 (QuantiFERON SARS-CoV-2)¹. Набор реагентов QuantiFERON SARS-CoV-2 предназначен для определения клеточного ответа к пептидным антигенам S1/S2 RBD из спайкового белка коронавируса SARS-CoV-2 по уровню продукции IFN-γ в образцах цельной гепаринизированной крови. Для реализации метода цельную кровь делят на 4 порции: негативный контроль (QuantiFERON Nil), позитивный контроль (QuantiFERON Mitogen), антиген S1, антиген S2 RBD (QuantiFERON AntigenTube). Полученные 4 пробирки (по 1 мл крови в каждой) сутки инкубируют в термостате, затем отделяют плазму центрифугированием. Уровень продукции IFN-γ определяют методом иммуноферментного анализа (ИФА). Однако реализация данного метода требует использования реагентов от зарубежных производителей, что делает его неэкономичным и усложняет его применение для массовых исследований.

В связи с вышеперечисленным имеется необходимость разработки отечественного специфичного, несложного и экономичного метода, пригодного для мониторинга в популяции Т-клеточного ответа в отношении SARS-CoV-2 у переболевших и вакцинированных людей.

Цель работы заключалась в отработке скринингового метода оценки активации специфического Т-клеточного иммунитета, предназначенного для наблюдения за формированием иммунологической памяти в отношении SARS-CoV-2 у людей, переболевших COVID-19.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

– оценить специфичность антигенной стимуляции лимфоцитов, выделенных из крови людей, переболевших COVID-19, в лунках готовых полистироловых планшетов ИФА-тест-систем;

– оценить иммунофенотип лимфоцитов, активирующихся при стимуляции антигенами SARS-CoV-2;

– оценить чувствительность и специфичность предлагаемого метода.

Материалы и методы

Клинические образцы цельной венозной крови и сыворотки были получены от 60 человек обоего пола в возрасте 18–70 лет, постоянно проживающих в Московском регионе. В число обследованных включены: 40 человек, перенёсших COVID-19 лёгкой или средней степени тяжести в период с декабря 2020 г. по октябрь 2021 г. (диагностика и лечение проведены в поликлиниках и клиниках г. Москвы); 20 здоровых добровольцев, не имевших в анамнезе данного заболевания и планирующих вакцинацию против инфекции SARS-CoV-2. Работы с клиническим материалом проводились в соответствии с международными этическими нормами при информированном добровольном согласии обследуемых. Исследование одобрено этическим комитетом ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» (МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского) (протокол № 41 от 10 декабря 2020 г.).

Переболевшие COVID-19 обследовались через 1–1,5 месяца после перенесённого заболевания, здоровый контроль – непосредственно перед вакцинацией (в день введения 1-го компонента вакцины).

Кровь брали в пробирки с гепарином (4 мл крови для исследования лимфоцитов) и в пробирки с активатором образования сгустка (2 мл крови на сыворотку).

Антитела (АТ) класса IgG к SARS-CoV-2 определяли методом ИФА на тест-системе SARS-CoV-2- IgG-ИФА-БЕСТ (АО «Вектор-Бест», Россия, № РЗН 2020/10388 от 18.05.2020), антитела класса IgM к SARS-CoV-2 определяли методом ИФА на тест-системе SARS-CoV-2-IgM-ИФА-БЕСТ (АО «Вектор-Бест», Россия, № РЗН 2020/10389 от 18.05.2020 г.) в соответствии с инструкцией разработчика. Трактовка результатов ИФА-тестирования проводилась в зависимости от коэффициента позитивности (КП). Реакция отрицательна при КП < 0,8, положительна при КП ≥ 1,1, сомнительна при 0,8 ≤ КП < 1,1.

Мононуклеары выделяли из цельной венозной крови в градиенте плотности Histopaque-1077, разводили до концентрации 5 × 10⁶/мл в полной среде RPMI-1640 (ООО «ПанЭко», Россия) с антибиотиками и 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FCS). Доля лимфоцитов среди выделенных мононуклеаров колебалась от 85 до 92%.

Для антигенной стимуляции мононуклеаров использовали коммерческие полистироловые 96-луночные планшеты с сорбированным цельновирионным инактивированным антигеном SARS-CoV-2, предназначенные для выявления IgG-антител к SARS-CoV-2 (производство ФБУН ГНЦ «Вектор», № РЗН 2020/10017 от 10.04.2020). Митогенную стимуляцию лимфоцитов проводили в лунках другого полистиролового планшета фитогемагглютинином Р (Sigma, США). Планшеты инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% СО₂. Для контроля специфичности антигенной стимуляции использовали полистироловые планшеты, предназначенные для выявления IgG-антител к вирусу денге (Vircell, S.L., Испания, REF-G1018), с сорбированным вирусом денге (тип 1 – штамм Гавайи, тип 2 – Новая Гвинея, тип 3 – штамм Н87 и тип 4 – штамм Н241) – возбудителем, с которым большинство жителей Московского региона не контактировало. Спонтанная продукция IFN-γ оценивалась в пробах, инкубированных в аналогичных условиях без антигена.

Супернатанты, собранные через 24 ч культивирования, хранили до исследования в замороженном состоянии (–40 °C). Концентрацию IFN-γ определяли методом ИФА на тест-системах фирмы АО «Вектор-Бест» (№ РЗН 2017/16008 от 24.07.2017). Результаты учитывали как разницу (∆) между антиген-стимулированной и спонтанной продукцией IFN-γ и представляли в виде медианы (Me) и межквартильного диапазона [Q₁–Q₃]. В качестве порогового значения концентрации IFN-γ использовали 50 пг/мл (среднее значение различий между концентрациями IFN-γ, измеренными в триплетах, при определении уровня антиген-стимулированной продукции IFN-γ выделенными лимфоцитами).

Иммунофенотип активированных лимфоцитов определяли на проточном цитометре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител (Beckman Coulter, США), которые содержали следующие флюоресцентные метки: CD69-PC5, CD3-FITC, CD8-PC7, CD4-PE, CD(16+56)-PE. Для исследования применяли две комбинации флюоресцентно меченных антител (CD69, CD3, CD8, CD4), которая давала сведения о количестве активированных Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺CD69⁺), активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ, CD3⁺CD8⁺CD69⁺) или (CD69, CD3, CD8, CD(16+56)), с помощью которой оценивали количество активированных NK (CD3^–CD16⁺56⁺CD69⁺) и NKT-клеток (CD3⁺CD16⁺56⁺CD69⁺). Результаты учитывали как разницу (Δ) между интактной пробой и SARS-CoV-2-стимулированной пробой и представляли в виде медианы (Me) и межквартильного диапазона [Q₁–Q₃].

Статистический анализ данных проведён с использованием пакета статистических программ Microsoft Excel и Statistica 10 (StatSoft Inc., США). Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Справедливость проверяемой гипотезы исследования оценивали по величине р value, критическим значением которой считали p < 0,05.

Результаты

Исследование проводилось с декабря 2020 г. по октябрь 2021 г. среди лиц, постоянно проживающих в Московском регионе. По данным интернет-ресурса GoGov², с момента начала вакцинации в РФ по май 2021 г. в Москве против SARS-CoV-2 был вакцинирован 1 млн 500 тыс. человек, количество людей с активной инфекцией оценивалось в 1 млн 180 тыс. К началу сентября эти цифры увеличились до 3 млн 611 тыс. и 1 млн 568 тыс. соответственно. Таким образом, в период исследования (особенно в его начале) возможность подбора неиммунного контроля была высокой.

У всех обследованных одновременно с забором крови для исследования Т-клеточного иммунитета к SARS-CoV-2 в сыворотке крови определяли концентрацию антител против того же вируса.

Все переболевшие COVID-19 через 1–1,5 месяца после выздоровления имели антитела класса IgG (среднее значение коэффициента позитивности КП = 11,5 ± 1,1), 25 человек сохраняли антитела класса IgM (КП = 3,3 ± 0,4). Здоровые лица, обследованные на неиммунный контроль, не имели определяемых уровней специфических АТ ни в одном из проводимых тестов.

Стимуляция цельновирионным инактивированным антигеном SARS-CoV-2 мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови доноров, показала значительно более высокий медианный ответ IFN-γ у 40 человек, перенёсших COVID-19, по сравнению с 20 здоровыми донорами крови (172,1 [34, 3–575, 1] пг/мл против 15,4 [6, 9–25, 8] пг/мл; р < 0,0001). Не было различий в медианном уровне IFN-γ в супернатантах, собранных с нестимулированных мононуклеарных клеток от переболевших COVID-19 и здоровых доноров (2,7 [0, 4–11, 4] пг/мл против 0,8 [0, 0–23, 3] пг/мл; р < 0,05). Увеличение продукции IFN-γ лимфоцитами в присутствии этого антигена у половины пациентов происходила даже интенсивнее, чем теми же лимфоцитами, стимулированными митогеном фитогемагглютинином (107,5 [43, 4–261, 5] пг/мл).

Используя индекс Юдена [18], подсчитали, что общая чувствительность и специфичность составляли 73% (95% доверительный интервал (ДИ) 58–88%) и 100% (95% ДИ 100–100%) соответственно при пороговом значении 50 пг/мл.

В нашем исследовании было показано, что при культивировании образцов клеток с цельновирионным инактивированным антигеном SARS-CoV-2 происходит специфическая активация лимфоцитов, выделенных из крови переболевших COVID-19 людей. В табл. 1 и 2 для доноров, у которых было достаточное количество мононуклеарных клеток для стимуляции всеми видами антигенов и митогеном, представлен ответ in vitro не только на вирусные частицы SARS-CoV-2, но и на аналогичный антигенный материал, полученный на основе вируса – возбудителя лихорадки денге.

Из табл. 1 видно, что для каждого из обследованных людей, перенёсших COVID-19, увеличение продукции IFN-γ при стимуляции их мононуклеаров на ИФА-планшете, содержащем цельновирионный антиген SARS-CoV-2, превышает таковую при стимуляции на планшете с антигенами вируса денге в 1,5–40 раз, а само увеличение этого ответа на вирус денге у половины доноров не превышает 5 пг/мл.

 

Таблица 1. Продукция IFN-γ мононуклеарными клетками периферической крови доноров, перенёсших COVID-19

Table 1. IFN-γ production by peripheral blood mononuclear cells from COVID-19 reconvalescents

№ донора Donor’s ID	Продукция IFN-γ, пг/мл IFN-γ production, pg/ml
	спонтанная Spontaneous	стимулированная вирусом SARS-CoV-2 Stimulated by a SARS-CoV-2 virus	∆1	стимулированная вирусом денге Stimulated by the dengue virus	∆2
1	2,5	27,9	25,4	16,6	14,1
2	7,1	99,2	92,2	20,3	13,2
3	9,3	35,8	26,5	9,7	0,4
4	1,3	27,9	26,6	3,8	2,5
5	5,9	39,5	33,6	10,2	4,3
6	3,0	46,1	43,1	11,2	8,1
7	1,1	96,7	95,6	28,9	27,8
8	7,4	64,1	56,7	26,7	19,3
9	0,0	40,5	40,5	0,0	0,0
10	20,3	75,7	55,4	0,7	0,0
11	29,6	246,8	217,2	35,4	5,8
12	2,7	204,1	201,4	14,9	12,3
13	4,3	86,1	81,8	15,3	11,0
14	4,6	122,2	117,5	22,4	17,8
15	1,3	81,0	79,7	2,8	1,5
16	1,5	255,1	253,6	3,4	1,9
17	1,5	81,1	79,6	2,2	0,7
18	2,0	32,5	30,5	2,2	0,2
19	18,1	359,0	340,9	13,5	0,0
20	14,3	1703,8	1689,5	15,2	1,0
21	1,3	716,3	714,9	8,3	7,0
22	85,3	623,2	537,9	111,0	25,7
23	0,0	198,5	198,5	2,0	2,0
24	0,0	425,9	425,9	22,0	22,0
25	11,9	184,8	172,8	14,5	2,6
26	23	1245,1	1221,9	47,0	23,7
27	0,2	56,5	56,3	1,8	1,6
28	1,5	67,1	65,6	2,5	1,0
29	0,0	230,0	230,0	10,5	10,5
30	0,0	184,5	184,5	15,5	15,5
31	33,8	121,2	87,4	35,7	1,9

Примечание. ∆₁ – разность между спонтанной и SARS-CoV-2-индуцированной продукцией; ∆₂ – разность между спонтанной и индуцированной вирусом денге продукцией.

Note. ∆₁ – difference between spontaneous and SARS-CoV-2-induced production; ∆₂ – difference between spontaneous and dengue virus induced production.

 

Из табл. 2 видно, что у лиц, не болевших COVID-19, реакция мононуклеаров на антигены SARS-CoV-2 практически такая же низкая, как и на антигены вируса денге.

 

Таблица 2. Продукция IFN-γ мононуклеарными клетками периферической крови доноров, не болевших COVID-19

Table 2. Production of IFN-γ by peripheral blood mononuclear cells of donors who had no history of COVID-19

№ донора Donor’s No.	Продукция IFN-γ, пг/мл IFN-γ production, pg/ml
	спонтанная Spontaneous	стимулированная вирусом SARS-CoV-2 Stimulated by a SARS-CoV-2 virus	∆1	стимулированная вирусом денге Stimulated by the dengue virus	∆2
1	58,3	58,3	0,0	65,9	7,5
2	0,3	6,9	6,6	0,8	0,5
3	2,4	3,0	0,6	3,0	0,6
4	0,0	1,9	1,9	0,0	0,0
5	26,3	26,3	0,0	26,3	0,0
6	2,7	19,5	16,8	19,5	16,8
7	35,1	35,1	0,0	12,4	0,0
8	23,9	26,2	2,3	11,3	0,0
9	0,0	3,2	3,2	1,2	1,2
10	0,0	2,0	2,0	0	0,0
11	0,0	11,1	11,1	0	0,0
12	0,0	7,6	7,6	0	0,0
13	0,0	12,3	12,3	0,0	0,0
14	3,1	15,4	12,4	22,5	19,4
15	0,8	21,8	21,0	23,3	22,5
16	1,4	20,1	18,7	9,9	8,5
17	23,3	25,9	2,6	24,8	1,5
18	0,0	16,4	16,4	0,0	0,0
19	0,0	13,9	13,9	21,6	21,6

Примечание. ∆₁ – разность между спонтанной и SARS-CoV-2-индуцированной продукцией; ∆₂ – разность между спонтанной и индуцированной вирусом денге продукцией.

Note. ∆₁ – difference between spontaneous and SARS-CoV-2-induced production; ∆₂ – difference between spontaneous and dengue virus induced production.

 

Медианы ответов IFN-γ и межквартильный диапазон на АГ-стимуляцию мононуклеаров людей, перенёсших COVID-19 (группа 1) и не болевших им (группа 2), представлены в табл. 3.

 

Таблица 3. Медианы [Q₁–Q₃] продукции IFN-γ у людей, перенёсших COVID-19 (группа 1) и не болевших им (группа 2), пг/мл

Table 3. Medians [Q₁–Q₃] of IFN-γ production in COVID-19 reconvalescents (group 1) and participants who had no history of COVID-19 (group 2), pg/ml

Варианты стимуляции Stimulation options	Группа 1 (n = 31) Group 1 (n = 31)	Группа 2 (n = 19) Group 1 (n = 19)
Спонтанная продукция Spontaneous modes	2,7 [1, 3–11, 9]	0,8 [0, 0–23, 3]
Продукция после стимуляции антигенами SARS-CoV-2 Production after stimulation with SARS-CoV-2 antigens	99,2 [26, 5–246, 8]	15,4 [6, 9–25, 8]
∆1 – разница между спонтанной и индуцированной SARS-CoV-2 продукции ∆1 – the difference between spontaneous and SARS-CoV-2 induced production	92,2* [55, 4–230, 0]	6,5 [1, 9–13, 9]
Продукция после стимуляции антигенами вируса денге Production after stimulation by dengue virus antigens	13,5 [2, 8–22, 0]	9,9 [0, 0–22, 5]
∆2 – разница между спонтанной и индуцированной вирусом денге продукции ∆2 – the difference between spontaneous and dengue induced products	4,3 [1, 0–14, 1]	0,5 [0, 0–8, 5]

Примечание. *Различие между ∆₁ в группах 1 и 2 значимо при р < 0,001 по критерию Манна–Уитни.

Note. *The difference between ∆1 in groups 1 and 2 is significant at p < 0.001 according to the Mann–Whitney test.

 

Статистическая обработка результатов данного исследования, приведённая в табл. 3, показывает, что после стимуляции in vitro антигенами SARS-CoV-2, фиксированными в лунках полистиролового планшета, продукция IFN-γ мононуклеарными клетками периферической крови доноров, не болевших COVID-19, значимо ниже, чем у лиц, перенёсших это заболевание. На стимуляцию антигенами вируса денге, не связанными с SARS-CoV-2, и также фиксированными в лунках полистиролового планшета, реакция мононуклеаров в обеих группах была низкой и практически одинаковой.

По данным литературы [19, 20], распознавание антигена клетками памяти и запуск ими синтеза IFN-γ свойственны Т-лимфоцитам. В нашем исследовании также было необходимо показать, что запуск реакции активации обеспечивается именно антигенспецифическими Т-лимфоцитами.

Для количественной оценки активации Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺) или цитотоксических лимфоцитов (CD3⁺CD8⁺) после их стимуляции антигенами SARS-CoV-2, пометили четырёхкомпонентной смесью флюоресцентно меченных моноклональных антител: CD3-FITC, CD4-PE, CD8-PС7, CD69-PC5 и исследовали на проточном цитометре.

В табл. 4 представлены результаты иммунофенотипирования SARS-CoV-2-стимулированных лимфоцитов у 25 пациентов, перенёсших COVID-19, и 20 здоровых доноров в виде Δ изменения процента лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации CD69. Кроме того, приведены результаты измерения продукции IFN-γ (в виде Δ концентрации, пг/мл) методом ИФА в супернатантах из соответствующих лунок ИФА-планшета.

 

Таблица 4. Иммунофенотип лимфоцитов, активирующихся в присутствии антигенов SARS-CoV-2, и концентрация IFN-γ, секретируемого ими в культуральную жидкость, Me [Q₁–Q₃]

Table 4. Immunophenotype of lymphocytes activated in the presence of SARS-CoV-2 antigens and the concentration of IFN-γ secreted by them into the culture medium, Me [Q₁–Q₃]

Группа Group	Δ увеличения лимфоцитов, экспрессирующих CD69 (%) Δ increase in lymphocytes expressing CD69 (%)		Δ концентрации IFN-γ, пг/мл Δ IFN-γ сoncentration, pg/ml
	среди CD3+CD4+ among CD3+CD4+	среди CD3+CD8+ among CD3+CD8+
Пациенты, перенёсшие COVID-19 (n = 25) COVID-19 reconvalescents (n = 25)	2,7 [0, 6–8, 0]*	4,5 [1, 5–13, 1]*	172,0 [52, 7–392, 0]*
Здоровые люди (n = 20) Healthy volunteers (n = 20)	0,7 [0, 3–1, 9]	1,8 [0, 8–3, 7]	4,1 [1, 6–9, 8]

Примечание. *Различие между группами значимо при р < 0,01 по критерию Манна–Уитни.

Note. *The difference between the groups is significant at p < 0.01 according to the Mann–Whitney test.

 

У 5 из 25 обследованных переболевших людей не повышалась АГ-стимулированная продукция IFN-γ. Однако у двух пациентов происходила активация лимфоцитов, которая выражалась увеличением доли CD8⁺ Т-клеток, экспрессирующих маркер CD69 на клеточной мембране. У 20 человек, перенёсших COVID-19, в присутствии антигенов SARS-CoV-2 активируются как Т-хелперы, так и Т-цитотоксические лимфоциты, и активация последних выражается большей величиной Δ. Кроме того, CD8⁺ Т-клетки активировались у 19 человек, а CD4⁺ Т-клетки – у 16. Активация обеих субпопуляций происходила у 10 человек.

Для оценки степени участия NK- и NKТ-лимфоцитов в продукции IFN-γ, стимулированной антигенами SARS-COV-2, набор флюоресцентно меченных моноклональных антител был несколько изменён: CD3-FITC, CD(16+56)-PE, CD8-PС7, CD69-PC5. С помощью такой комбинации антител в одной и той же пробе лимфоцитов непосредственно определялось количество активированных CD8⁺ Т-клеток, NK- и NKT-лимфоцитов, а также косвенно (как разница между процентом Т-клеток и CD8⁺ Т-клеток) – количество активированных CD4⁺ Т-клеток.

Стимуляция лимфоцитов контрольным антигеном (вируса денге) в парных пробах одних и тех же пациентов (табл. 5) не вызывает активации CD8⁺ Т-клеток и в меньшей степени затрагивает NK- и NKT-субпопуляции, чем стимуляция антигенами SARS-CoV-2 (в 4–8 раз). Сопровождающая этот процесс продукция IFN-γ существенно ниже при стимуляции контрольным антигеном (примерно в 500 раз) с учётом того, что прирост активированных CD8⁺ Т-клеток в пробах, стимулированных антигенами вируса денге, в 10 раз ниже, чем в пробах, стимулированных SARS-CoV-2.

 

Таблица 5. Изменение иммунофенотипа Т- и NK-клеток и продукции IFN-γ при их стимуляции антигенами SARS-CoV-2 или вируса денге в группе пациентов после COVID-19 (индивидуальные данные)

Table 5. Changes in the immunophenotype of T- and NK-cells and IFN-γ production during their stimulation with SARS-CoV-2 or dengue virus antigens in the group of COVID-19 reconvalescents (individual data)

№ пробы Sample No.	Лимфоциты активированы на планшете с антигенами SARS-CoV-2 Lymphocytes are activated on a plate with SARS-CoV-2 antigens					Лимфоциты активированы на планшете с антигенами вируса денге Lymphocytes are activated on a plate with dengue virus antigens
	Th Δ%	CTL Δ%	NK Δ%	NKT Δ%	IFN-γ, пг/мл pg/ml	Th Δ%	CTL Δ%	NK Δ%	NKT Δ%	IFN-γ, пг/мл pg/ml
1	5,5	7,8	3,4	9,4	30,5	0,0	0,0	3,4	5,9	0,2
2	2,8	3,9	46,8	11,3	79,7	0,8	0,8	9,2	6,3	1,5
3	3,8	7,7	55,3	14,1	37,2	1,0	1,5	14,4	3,7	0,0
4	1,0	5,0	28,2	1,3	49,6	0,0	4,9	21,2	4,2	4,4
5	0,7	7,7	26,1	6,1	64,1	0,4	1,1	13,8	0,0	0,2
6	3,0	9,4	50,5	7,6	82,8	1,6	4,5	38,3	3,0	29,9
7	1,2	5,1	64,7	20,3	340,9	2,1	1,2	30,0	0,0	0,0
8	0,9	4,0	14,4	16,0	102,0	0,3	0,7	0,0	0,0	0,0
9	17,7	18,1	55,4	48,0	1600,4	1,0	0,0	0,3	3,0	0,0
10	13,5	2,1	37,5	28,2	714,9	4,5	0,0	19,4	5,7	7,0
11	8,5	25,2	64,2	39,9	1185,2	0,3	0,0	27,5	3,5	5,4
12	0,7	7,7	36,6	19,8	369,3	0,4	1,1	9,9	3,7	0,0
13	1,2	7,7	45,4	21,3	180,8	0,0	0,0	1,5	0,0	0,0
Ме [Q1–Q3]	2,8* [1, 0–5, 5]	7,7* [5, 0–7, 8]	45,4* [28, 2–55, 3]	16* [9, 4–21, 3]	102* [64, 1–369, 3]	0,4 [0, 3–1, 0]	0,8 [0, 0–1, 2]	13,8 [3, 4–21, 2]	3,5 [0, 0–4, 2]	0,2 [0, 0–4, 4]

Примечание. *Различия между значениями в пробах, стимулированных антигенами SARS-CoV-2, и значениями одноимённых параметров в пробах, стимулированными антигенами вируса денге, значимы при р < 0,001 по критерию Манна–Уитни.

Note. *Differences between values in samples stimulated with SARS-CoV-2 antigens and values of similar parameters in samples stimulated with dengue virus antigens are significant at p < 0.001 according to the Mann–Whitney test.

 

Обсуждение

В мировой научной литературе представлены работы о возможности применения технологии IGRA для диагностики крови in vitro, используемой в клинических лабораториях для измерения IFN-γ, высвобождаемого антиген-специфическими Т-клетками после стимуляции патоген-специфическими пептидами [21–23]. Авторы показывают, что в зависимости от срока обследования после заболевания COVID-19 или выздоровления чувствительность и специфичность теста могут составлять от 81,1% (95% ДИ 74,9–86%) до 90% (95% ДИ 82–95%) и от 90,9% (95% ДИ 74,5–97,6%) до 96% (95% ДИ 86–99%) соответственно.

В современных реалиях чтобы лучше оценить иммунный статус отдельных лиц и групп населения и новые вакцины, необходимы адекватные иммунодиагностические инструменты, которые измеряют клеточный иммунный ответ на SARS-CoV-2. Предложенный нами способ активации лимфоцитов с использованием готовых коммерческих тест-систем показал, что в ходе его реализации происходит АГ-стимуляция, которая специфична с высокой степенью чувствительности – 73% (95% ДИ 58–88%) – и не уступает по своей информативности анализу учёта IFN-γ другим вариантам технологии IGRA.

CD69 довольно давно известен как маркер активации Т-лимфоцитов и NK-клеток [24]. Повышение на Т-лимфоцитах экспрессии CD69 и продукции IFN-γ после антигенной стимуляции используется для выявления клеток памяти при многих инфекциях [25, 26].

В случае, когда синтез IFN-γ регистрируется не внутри клетки с известным иммунофенотипом, а вне её (например, методом ELISPOT), возникает вопрос, какая часть IFN-γ происходит из Т-клеток, а какая – из NK-клеток. Ряд исследователей полагает, что NK-клетки могут напрямую распознавать сложный патоген, такой как цитомегаловирус человека (HCMV). Так, воздействие HCMV (штамм TB40/E) на NK-клетки человека индуцировало экспрессию CD69, стимулировало секрецию IFN-γ и увеличивало их цитотоксическую активность в отношении инфицированных HCMV клеток [27]. Другие считают, что при острой инфекции эти механизмы не имеют большого значения [28].

В нашей работе также мог иметь значение тот факт, что специфические Т-клетки определялись в крови людей, переболевших COVID-19. В работе S. Varchetta и соавт. показано, что у пациентов с COVID-19 (особенно с тяжёлой формой) было изменено распределение лимфоцитов периферической крови с увеличением доли зрелых NK- и низким количеством Т-клеток. NK-клетки и CD8⁺ Т-клетки, в частности, характеризовались повышенной экспрессией CD69. После выздоровления количество CD8⁺ Т-клеток и экспрессия CD69 на них нормализовались [29]. Тем не менее нельзя было исключить, что, будучи активированы in vivo, эти клетки более активно реагируют и in vitro.

Оценка степени участия NK- и NKТ-лимфоцитов в продукции IFN-γ, стимулированной антигенами SARS-CoV-2, в наших исследованиях позволила показать, что вклад NK-лимфоцитов в результирующий эффект АГ-стимулированной продукции IFN-γ, вероятно, меньше, чем вклад T-лимфоцитов. NK-лимфоциты одного и того же пациента активируются в присутствии антигенов как SARS-CoV-2, так и вируса денге, однако степень активации NK-клеток (с повышением экспрессии CD69) в присутствии антигенов вируса денге ниже и не приводит к продукции IFN-γ даже на низком уровне, если только не сопровождается активацией CD8⁺ Т-клеток.

Заключение

Таким образом, наши исследования показали, что предложенный способ определения клеточного иммунного ответа на SARS-CoV-2 позволяет различать перенёсших COVID-19 и неинфицированных здоровых доноров крови. Общая чувствительность и специфичность метода не уступают другим аналогичным методам. Следовательно, применение разработанного нами способа определения клеточного иммунного ответа на SARS-CoV-2 является обоснованным и перспективным.

Предлагаемый способ определения клеточного иммунного ответа на SARS-CoV-2 как любой метод имеет суммарную погрешность оценки АГ-стимулированного увеличения экспрессии маркера активации Т-лимфоцитов CD69 или АГ-стимулированной продукции IFN-γ, которая складывается из точности дозирования лимфоцитов в лунки планшета, аликвотирования клеток и супернатантов, а также из измерительной погрешности автоматических приборов для цито- и фотометрии. Однако эти ограничения не являются определяющими и устраняются путём применения поверенного оборудования и дублирования клеточных проб.

Предложенный способ имеет следующие преимущества перед зарубежными аналогичными методами, которые делают его пригодным для мониторинга Т-клеточного ответа в популяции:

– является более экономичным, так как не требует дорогостоящего оборудования и может быть реализован с использованием реагентов российских производителей;

– позволяет использовать готовые полистироловые планшеты ИФА-тест-систем, прошедших регистрацию для медицинских целей, с фиксированным антигеном вируса SARS-CoV-2, которые применяются для обнаружения антител соответствующей специфичности, что позволяет дополнительно стандартизировать метод;

– подходит для людей с любым гаплотипом по антигенам главного комплекса гистосовместимости (HLA) и может быть осуществлён в течение трёх суток.

Дальнейшие исследования будут направлены на возможность применения предложенного способа для определения клеточного иммунного ответа на разные эпитопы антигенов SARS-CoV-2 (с использованием ИФА-тест-систем с фиксированными антигенами вируса) с целью изучения формирования поствакцинального иммунного ответа.

Участие авторов: Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической, экспериментальной работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.

Финансирование. Исследование выполнено за счёт государственного бюджета.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическое утверждение. Исследование проводилось при информированном согласии пациентов. Исследование одобрено этическим комитетом ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора (протокол № 41 от 10 декабря 2020 г).

 

¹ QuantiFERON SARS-CoV-2 RUO. A comprehensive immune response assessment toolset to maximize T cell immune response research insights. Available at: https://www.qiagen.com/us/products/diagnostics-and-clinical-research/infectious-disease/quantiferon-sars-cov-2-ruo?clear=true#orderinginformation

² Статистика вакцинации от COVID-19 в Москве. Доступно на: https://gogov.ru/covid-v-stats/msk#data

About the authors

Maria S. Blyakher

G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: maria.s.b@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-3480-6873

D. Sci. (Med.), Professor, Head Laboratory, Department of immunology

Россия, 125212, Moscow

Irina M. Fedorova

G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: vestnik-07@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0335-2752

Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Department of immunology

Россия, 125212, Moscow

Elena A. Tulskaya

G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: etul@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1969-4009

Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Department of immunology

Россия, 125212, Moscow

Ivan V. Kapustin

G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: maria.s.b@bk.ru
ORCID iD: 0000-0001-6191-260X

Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Department of immunology

Россия, 125212, Moscow

Svetlana I. Koteleva

G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: felileo@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1878-2234

к.м.н, в.н.с. отдела иммунологии

Россия, 125212, Moscow

Zarema K. Ramazanova

G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: rzarema@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9314-3312

Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Department of immunology

Россия, 125212, Moscow

Evgeny E. Odintsov

G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: rinocerus@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5895-2520

Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Department of immunology

Россия, 125212, Moscow

Svetlana V. Sandalova

G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: s.sandalova74@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4548-9888

Researcher, Department of immunology

Россия, 125212, Moscow

Lidia I. Novikova

G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: vestnik-07@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0307-4561

Cand. Sci. (Med.), Head Laboratory, Department of immunology

Россия, 125212, Moscow

References

Supplementary files