Enteroviral (Picornaviridae: Enterovirus) (nonpolio) vaccines

Full Text

Введение

Энтеровирусы (Viruses, Riboviria, Orthornavirae, Pisuviricota, Pisoniviricetes, Picornavirales, Picornaviridae, Enterovirus) – повсеместно распространённые небольшие (около 30 нм) безоболочечные вирусы с геномом, представленным рибонуклеиновой кислотой (РНК) позитивной полярности. Энтеровирусы инфицируют широкий круг позвоночных животных. По данным Международного комитета по таксономии вирусов, в настоящее время к роду Enterovirus относят более 300 представителей. На основе генетических, иммунологических характеристик и сродства вирусов к рецепторам клетки род разделяют на 15 видов: 12 видов Enterovirus, обозначенных буквами от A до L, и 3 вида Rhinovirus – от А до С [1]. Базируясь на серологических и генетических характеристиках, внутри видов выделяют различные типы вирусов [2].

Среди собственно энтеровирусов патогенными для человека являются энтеровирусы 106 типов, относящиеся к четырем видам: Enterovirus А – 20 типов, Enterovirus В – 59 типов, Enterovirus С – 23 типа, Enterovirus D – 4 типа. К неполиомиелитным энтеровирусам (НПЭВ) относятся вирусы 103 типов, за исключением полиовирусов 1, 2, 3-го типа вида Enterovirus С [3]. Изучение глобальной распространённости и распределения типов НПЭВ показало, что представители вида Enterovirus В обнаруживаются по всему миру. В то же время представители Enterovirus А чаще других обнаруживаются в Азии, а Enterovirus С – в Африке [4].

Энтеровирусы – это широко распространённые вирусные агенты, являющиеся одним из основных возбудителей заболеваний человека вирусной этиологии. Например, в США энтеровирусы вызывают не менее 10–15 млн симптоматических инфекций в год [5]. НПЭВ имеют большую значимость в инфекционной патологии детей первых лет жизни, периодически вызывая массовые вспышки [6]. В Российской Федерации многолетняя динамика заболеваемости энтеровирусной инфекцией характеризовалась устойчивой тенденцией к росту и периодическими подъемами. До пандемии COVID-19 средний показатель заболеваемости энтеровирусными инфекциями составлял 7,02 на 100 тыс. населения, при этом удельный вес детей до 17 лет был более 90% [7]. Однако при проведении противоэпидемических мероприятий по профилактике новой коронавирусной инфекции зарегистрирован спад заболеваемости, вызванной НПЭВ. Это указывает на возможное уменьшение иммунной прослойки к НПЭВ и риск эпидемического подъёма заболеваемости в последующие годы [8].

Целью настоящей работы является обзор современных данных о заболеваниях, вызываемых НПЭВ, их распространённости, существующих и новых подходах к разработке вакцин для профилактики энтеровирусной (неполио) инфекции.

Заболевания, вызванные неполиомиелитными энтеровирусами

НПЭВ являются причиной широкого спектра заболеваний, включая энцефалит, менингит, миокардит, экзантему полости рта и конечностей (HFMD – Hand, Foot and Mouth Disease), конъюнктивит, респираторные и желудочно-кишечные заболевания, но большинство инфекций, связанных с НПЭВ, остаются бессимптомными. НПЭВ легко передаются от человека к человеку с использованием фекально-орального механизма или воздушно-капельным путём и могут поражать людей разных возрастных групп. Симптомы появляются через 3–7 дней после заражения. С появлением симптомов вирусная РНК детектируется в периферической крови, носоглоточных смывах и фекалиях, а при наличии осложнений – в спинномозговой жидкости [9]. У взрослых заболевания обычно протекают бессимптомно или характеризуются лёгким течением, которое в основном описывается как респираторное. Наиболее часто НПЭВ инфицируют новорождённых и детей младшего возраста, что связано с отсутствием у них антител. У детей клинические проявления могут варьировать от острых лихорадочных заболеваний до тяжёлых осложнений, требующих госпитализации и приводящих в ряде случаев к инвалидности или летальному исходу. Например, в Восточной и Юго-Восточной Азии частота госпитализаций с диагнозом HFMD составила около 6% от всех заболевших, из которых у 20% развивались осложнения, связанные с поражением центральной нервной системы, а 5% умирали [10]. Причины неблагоприятного течения заболевания остаются во многом непонятными. Однако в ряде исследований было показано, что генетические особенности хозяина и чрезмерная продукция различных цитокинов (цитокиновый шторм) коррелируют с тяжёлым течением заболевания [11].

НПЭВ разных типов могут быть причиной сходных по клинике заболеваний. При этом установлена преимущественная связь определённых типов энтеровируса со специфической клинической картиной. Так, представители вида Enterovirus А ответственны более чем за 90% случаев энтеровирусной экзантемы, которая может проявляться в форме HFMD, атипичной экзантемы и герпетической ангины [12]. Основными возбудителями, вызывающими вспышки HFMD во всём мире, являются Enterovirus (EV) A71 (EV-A71) [13] и Coxsackievirus (CV) A16 (CVА16) [14]. С начала ХХI в. в странах Азиатско-Тихоокеанского региона к ним присоединился CVА6 [15], а также CVА10, который сформировал вариант с повышенной нейровирулентностью [16]. Представители вида Enterovirus В чаще вызывают такие серьёзные, требующие госпитализации заболевания, как серозный энтеровирусный менингит, энцефалит, миелит и миокардит. Этиологическими агентами энтеровирусного менингита преимущественно являются типы Echovirus (E) – Е6, Е7, Е9, Е11, Е30 и др. Фактически вспышки асептического менингита и энцефалита по всему миру в основном связаны с различными типами Echovirus [17] и CVB5 [18]. Вирусы CVВ6 являются этиологической причиной разных клинических форм заболевания, включая HFMD и острый миокардит. В США CVB3 ежегодно вызывает 20 000–40 000 случаев острого миокардита, при этом у 3–8 из каждых 100 тыс. больных развивается дилатационная кардиомиопатия [19]. НПЭВ вида Enterovirus С могут вызывать HFMD, герпангину, асептический менингит и др. Особое эпидемическое значение приобрёл вариант CVA24v, вызвавший вспышки острого геморрагического конъюнктивита в ряде стран [20]. EV-D68, относящийся к виду Enterovirus D, известен как вирус, вызывающий вспышки полиомиелитоподобных острых вялых миелитов, в том числе с летальными исходами, в США и некоторых странах Европы с 2014 г. Циркуляция этого вируса зафиксирована в Западной Европе, Северной Америке, Африке, Юго-Восточной Азии [21].

На территории России обнаружена циркуляция не менее 53 типов НПЭВ: Enterovirus А (CVA2-А6, А8, А10, А14, А16, EV-A71, А76, А120); Enterovirus В (CVA9, CVB1-6, E1-7, Е9, Е11, Е13-19, Е21, Е22, Е24, Е29, Е30, Е31, Е33, EV-B75); Enterovirus С (CVA1, А13, А17, А20, А21, А22, А24, EV-C99, С113, С116); Enterovirus D (EV-D68). Однако эпидемическое значение имеют возбудители экзантемных форм заболевания (CVA6, CVA10, CVA16, EV-A71), асептического менингита (Е30, E6, CVB5) и миокардита (CVB3). Суммарная доля данных вирусов превышает 50% от всех НПЭВ, идентифицированных на территории России [22, 23]. При этом частота обнаружения НПЭВ в субъектах Российской Федерации характеризуется неравномерностью распределения и сезонными подъёмами. Дальневосточный федеральный округ характеризуется наиболее высокой частотой обнаружения НПЭФ, а на Кавказе НПЭФ детектируются реже, чем в других регионах. Сезонный подъём заболеваемости, вызванный НПЭВ, регистрируется в августе–сентябре [7].

Структурная организация энтеровирусов

Геном энтеровирусов представлен однонитевой линейной РНК позитивной полярности размером 7,1–7,4 kb и включает концевые нетранслируемые регионы, фланкирующие одну открытую рамку считывания, кодирующую полипротеин размером 2100 аминокислот. В процессе трансляции происходит каскад расщепления полипротеина вирусными протеазами 2А и 3С сначала на три белка-предшественника (P1, P2 и P3), затем на функциональные белки. P1 расщепляется на четыре структурных белка (VP1, VP2, VP3, VP4), а P2 и P3 – на семь неструктурных белков (P2-2Apro, 2B, 2C, P3-3A, 3B, 3Cpro, 3Dpol). Четыре структурных белка путём самосборки формируют основной строительный блок капсида вириона – протомер. Пять протомеров образуют пентамер, а 12 пентамеров и вирусный геном образуют икосаэдральный вирион диаметром 30 нм с pseudo-Т = 3 типом симметрии. Белки VP1, VP2 и VP3, представленные на поверхности вириона, формируют структуры, отвечающие за распознавание рецептора [24].

Капсидные белки являются основными антигенами вириона. На белках VP1, VP2 и VP3 обнаружены линейные и конформационные эпитопы, связывание с которыми антител приводит к нейтрализации вируса [25]. Высокая вариабельность аминокислотных последовательностей поверхностных белков НПЭВ приводит к тому, что антитела, нейтрализующие один тип вируса, не способны нейтрализовать другие типы. Неструктурные белки также содержат В- и Т-клеточные эпитопы, некоторые из которых вызывают перекрестные иммунные реакции с разными типами НПЭВ [11].

Иммунный ответ на неполиомиелитные энтеровирусы

К настоящему времени понятно, что для эффективной защиты организма от инфекции НПЭВ достаточно нейтрализующих антител, которые в большинстве случаев предотвращают заражение или останавливают прогрессирование заболевания. На примере больных HFMD было показано, что антитела класса IgM к вирусу EV-A71 детектировались уже через день после появления клинических симптомов, а антитела класса IgG – на 3–6-й день. Продукция нейтрализующих антител в большинстве случаев приводит к выздоровлению. У пациентов с поражением центральной нервной системы титры нейтрализующих антител не отличались от соответствующих титров у пациентов с лёгким течением HFMD. После выздоровления антитела IgM сохранялись в сыворотке крови в течение месяцев, а IgG детектировались несколько лет [26]. Следует отметить, что антитела класса IgG против НПЭВ могут передаваться от матери к плоду и сохраняться в периферической крови ребёнка в течение нескольких месяцев после рождения [27].

Сероэпидемиологические исследования показали, что частота обнаружения антител к НПЭВ варьирует в зависимости от типа вируса, возрастной группы населения, времени и места проведения исследования. Общей закономерностью является увеличение частоты обнаружения антител к НПЭВ с увеличением возраста детей. У младенцев 5–12 мес частота обнаружения антител составляет 4–18%, а в возрастной группе 7–19 лет она возрастает до 30–50% с последующим сохранением данного показателя у взрослых [28].

Вакцины против неполиомиелитных энтеровирусов

В связи со значимостью в инфекционной патологии детей ведется разработка вакцин против разных эпидемических типов НПЭВ. Эпидемии, связанные с EV-А71, стали серьёзной угрозой для общественного здравоохранения в Азиатско-Тихоокеанском регионе, что определило усилия в первую очередь китайских исследователей по разработке типоспецифических вакцин для профилактики HFMD. Наибольшее распространение приобрела классическая технология получения вакцин путём инактивации цельных вирионов. Тремя разработчиками (Sinovac Biotech, Beijing Vigoo Biological и Китайской академией медицинских наук) были получены три инактивированные вакцины против EV-A71. В клинических испытаниях все три вакцины показали безопасность и высокую эффективность для профилактики заболеваний, ассоциированных с EV-A71. В настоящее время китайскими компаниями получена лицензия на производство инактивированных вакцин против EV-A71 для детей до 5 лет. При этом вакцина фирмы Sinovac Biotech, основанная на использовании вируса субгенотипа С4, показала 95% эффективность против HFMD, вызванной EV-А71, и 100% защиту от инфекции EV-А71 с неврологическими симптомами [29]. Вакцина вызывала устойчивый, в течение 5 лет, иммунитет против различных генотипов EV-A71. В связи с этим Всемирная организация здравоохранения полагает, что она может быть использована во всём мире [30]. На Тайване для ‎‎производства инактивированной вакцины против EV-A71 ‎‎использовали вирус генотипа B4. Вакцина вызывала продукцию нейтрализующих антител против EV-A71 разных генотипов и не обладала серьёзными побочными эффектами, а антитела сохранялись не менее 2 лет. В настоящий момент вакцина проходит 3-й этап испытаний [31]. Имеются сообщения о разработке типоспецифических моновалентных и комбинированных вакцин на основе инактивированных вирусов CVA16, CVA6, CVA10. По результатам доклинических испытаний хорошую иммуногенность и протективные свойства показали моновалентная вакцина против CVA16 и двухвалентная против EV-A71 и CVA16 [32].

Ведутся исследования, направленные на получение живых вакцин на основе аттенуированных вирусов. В процессе адаптации CVA16 к диплоидной линии эмбриональных клеток лёгких человека KMB17 был получен аттенуированный штамм K168-8Ac. При вакцинации макак резусов штаммом K168-8Ac была показана высокая эффективность защиты от инфекции CVA16 [33]. Для получения аттенуированных вирусов широко применяется создание инфекционных клонов комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты НПЭВ. На примере EV-A71 определено, что мутации в 5’-нетранслируемом регионе РНК или аминокислотные замены в белках вируса приводят к снижению вирулентности in vitro и in vivo. Установлено, что замена цитозина на урацил в позиции 158 РНК снижала скорость трансляции полипротеина и вирулентность EV-A71 [34]. Аминокислотные замены в VP1 (G64R или G64T) и 3D полимеразе (S264L и L123F) также снижали вирулентность EV-А71 [35, 36]. P.T.I. Yee и соавт. сконструировали штамм EV-A71 (pIY), в геном которого были встроены нуклеотидные последовательности, являющиеся мишенью для двух микроРНК (let-7a и miR-124a). Это приводило к уменьшению числа копий РНК вируса по сравнению с диким типом в клетках, имеющих различное тканевое происхождение. Вакцинация штаммом pIY защищала мышей от смертельной дозы EV-A71 [37]. В США группой учёных создан живой ослабленный штамм CVB3 (Mt10), имеющий аминокислотную замену в VP1 (H790A). Иммунизация мышей штаммом Mt10 защищала их как от миокардита, так и от панкреатита [38].

Следует отметить, что живые аттенуированные вакцины являются высокоиммуногенными препаратами, однако их использование для создания поливалентных энтеровирусных вакцин несёт риски. Для НПЭВ показано, что межвидовая и внутривидовая рекомбинации между геномами являются одним из факторов формирования новых эпидемических вариантов. При попадании вакцинных штаммов в организм, инфицированный диким вирусом, возникает риск формирования вариантов НПЭВ с непредсказуемыми свойствами [39].

В качестве альтернативы инактивированным и живым аттенуированным вакцинам разрабатываются субъединичные вакцины. К настоящему времени в аминокислотных последовательностях поверхностных белков НПЭВ обнаружено множество консервативных линейных эпитопов, являющихся мишенями для нейтрализующих антител. Использование пептида SP70 VP1 EV-A71 (208–222 аминокислоты) для вакцинации показало, что антисыворотка против SP70 пассивно защищала новорождённых мышей как от гомологичных, так и от гетерологичных штаммов EV-A71. Y.X. Li и соавт. разработали пептид, состоящий из трёх линейных эпитопов белка VP1 EV-A71, последовательно соединённых линкером (Gly4Ser). Однако, несмотря на применение адъювантов, титры нейтрализующих антител после иммунизации мышей пептидами были в 4 раза ниже, чем у мышей, иммунизированных инактивированной вакциной [40].

Для повышения иммуногенности субъединичных вакцин проводятся исследования по встраиванию пептидов поверхностных белков НПЭВ в другие вирусы и вирусоподобные частицы (ВпЧ). X. Tian и соавт. сообщили о включении эпитопа SP70 EV-A71 в экспонированные на поверхности домены гексона аденовируса III типа (Mastadenovirus: Human adenovirus B: Human adenovirus 3). Конструкция была способна вызывать гуморальный ответ, специфичный для эпитопа SP70 [41]. Основной антиген (HBc) вируса гепатита B (Orthohepadnavirus: Hepatitis B virus) был использован для формирования вирусоподобных частиц с экспонированным на поверхности эпитопом VP2 CVA10 (136–150 а.к.). Такие ВпЧ вызывали сильный гуморальный ответ у мышей, а антитела нейтрализовали как штамм-прототип, так и другие клинические изоляты CVA10 [42]. L. Jiang и соавт. сконструировали Р-частицы норовируса (Calicividae: Norovirus), экспонирующие на поверхности эпитопы капсидных белков EV-A71. Наибольшую эффективность показал эпитоп VP3 (176–190 аминокислоты), использование которого в составе Р-частицы для иммунизации самок мышей позволяло защитить рождённых ими мышат от летальной дозы EV-A71 в период лактации [43]. В нашей работе на основе белка VP1 норовируса были получены ВпЧ, презентирующие на поверхности полноразмерный VP1 Е30 [44].

При исследовании самосборки вирионов НПЭВ было установлено, что для формирования ВпЧ энтеровирусов достаточна совместная экспрессия только P1 и 3C областей генома. Причём самосборка происходила при экспрессии в клетках как насекомых [45], так и дрожжей [46]. Данное наблюдение было использовано для получения ВпЧ НПЭВ в качестве антигенов для вакцины. Группа исследователей из Китая на основе ВпЧ основных возбудителей HFMD (EV-А71, CVA16, CVA6, CVA10) создала четырехвалентную вакцину и продемонстрировала её способность вызывать у мышей протективный иммунитет против исследуемых вирусов. Титры нейтрализующих антител были сравнимы с соответствующими моновалентными вакцинами и защищали мышей как от единичного, так и от смешанного инфицирования вирусами EV-А71, CVA16, CVA6, CVA10 [47]. Подобным образом были получены ВпЧ EV-А71 генотипа С4а, явившегося причиной вспышки HFMD в Корее в 2009 г., при которой заболевание характеризовалось частыми поражениями центральной нервной системы [48]. Также с использованием клеток насекомых получены ВпЧ CVB3 и CVB1 и разработана технология их производства с повышенным выходом и чистотой продукта [49]. В целом показано, что такие ВпЧ индуцируют сильный и длительный гуморальный иммунный ответ и перспективны для разработки высокоэффективных вакцин против энтеровирусов.

Совместная экспрессия белка-предшественника P1 и протеазы 3CD также приводила к самосборке ВпЧ энтеровирусов в дрожжах. C. Zhang и соавт. получили высокий выход рекомбинантных ВпЧ EV-A71 в клетках Pichia pastoris. При иммунизации мышей такие ВпЧ индуцировали высокие титры антител, способных нейтрализовать различные штаммы EV-A71. Что ещё более важно, иммунизация самок защищала рождённых ими мышат от летального исхода при заражении EV-A71 [50]. Z. Yang и соавт. сообщили о получении штамма P. pastoris с высоким уровнем продукции ВпЧ, который составил 270 мг/л [51]. Опубликованы результаты успешных доклинических испытаний данной кандидатной вакцины на грызунах и приматах, что послужило основанием для проведения клинических испытаний [52]. Также в клетках P. pastoris получены ВпЧ EV-D68. Мыши, иммунизированные такими ВпЧ, продуцировали антитела, нейтрализующие вирус в условиях in vitro. Вакцинация самок защищала рождённых ими мышат-сосунков от летальных доз вируса. Пассивный перенос сывороток, содержащих антитела против полученных ВпЧ, обеспечивал полную защиту мышей-реципиентов [53]. L. Sherry и соавт. с использованием генетического материала термостабильного мутантного штамма PV-1 получили в P. pastoris ВпЧ, которые имели общие характеристики с ВпЧ, продуцируемыми клетками млекопитающих. Авторы заключили, что ВпЧ полиовируса, полученные в дрожжах, являются многообещающей системой для крупномасштабного производства полиовирусных вакцин [54].

Заключение

НПЭВ являются одними из основных склонных к эпидемическому распространению возбудителей заболеваний вирусной этиологии у детей младшего возраста, вызывающих заболевания с различной клинической картиной. В связи с этим в мире ведется разработка вакцин против разных эпидемических типов НПЭВ. Для предотвращения вспышек экзантемных заболеваний в Юго-Восточной Азии разработаны инактивированные типоспецифические вакцины для профилактики HFMD, связанной с ЭВ-А71, разрабатываются поливалентные вакцины на основе инактивированных вирусов CVA16, CVA6, CVA10. Также исследуется применимость альтернативных подходов, основанных на аттенуированных вирусах, субъединичных вакцинах и ВпЧ. Обзор литературных данных показал, что ВпЧ являются привлекательной платформой для разработки более безопасных вакцин против как заболеваний, вызванных НПЭВ, так и полиомиелита. В ВпЧ отсутствует вирусный геном, они безопасны в производстве и применении. Развитие биотехнологии на современном этапе позволяет использовать ВпЧ для разработки поливалентных энтеровирусных вакцин нового поколения, обладающих высокой иммуногенностью и возможностью непрерывной модернизации, позволяющей заменять антигены в составе вакцины на актуальные.

Участие авторов: Новиков Д.В., Мелентьев Д.А. – анализ литературы, написание текста статьи, утверждение окончательного варианта статьи.

Финансирование. Исследование проведено в рамках государственного задания Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор).

Конфликт интересов: Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

About the authors

Dmitri V. Novikov

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: novikov.dv75@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7049-6935

Ph.D. (Biol.), Associate Professor, Lead Researcher of the Immunochemistry Laboratory

Russian Federation, 603950, Nizhny Novgorod

Dmitry A. Melentev

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology; N.I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Author for correspondence.
Email: dim-melente@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2441-6874

Junior Researcher of the Immunochemistry Laboratory, Postgraduate Student

Russian Federation, 603950, Nizhny Novgorod; 603022, Nizhny Novgorod

References

Supplementary files