Энтеровирусные (Picornaviridae: Enterovirus) (неполио) вакцины

Полный текст

Введение

Энтеровирусы (Viruses, Riboviria, Orthornavirae, Pisuviricota, Pisoniviricetes, Picornavirales, Picornaviridae, Enterovirus) – повсеместно распространённые небольшие (около 30 нм) безоболочечные вирусы с геномом, представленным рибонуклеиновой кислотой (РНК) позитивной полярности. Энтеровирусы инфицируют широкий круг позвоночных животных. По данным Международного комитета по таксономии вирусов, в настоящее время к роду Enterovirus относят более 300 представителей. На основе генетических, иммунологических характеристик и сродства вирусов к рецепторам клетки род разделяют на 15 видов: 12 видов Enterovirus, обозначенных буквами от A до L, и 3 вида Rhinovirus – от А до С [1]. Базируясь на серологических и генетических характеристиках, внутри видов выделяют различные типы вирусов [2].

Среди собственно энтеровирусов патогенными для человека являются энтеровирусы 106 типов, относящиеся к четырем видам: Enterovirus А – 20 типов, Enterovirus В – 59 типов, Enterovirus С – 23 типа, Enterovirus D – 4 типа. К неполиомиелитным энтеровирусам (НПЭВ) относятся вирусы 103 типов, за исключением полиовирусов 1, 2, 3-го типа вида Enterovirus С [3]. Изучение глобальной распространённости и распределения типов НПЭВ показало, что представители вида Enterovirus В обнаруживаются по всему миру. В то же время представители Enterovirus А чаще других обнаруживаются в Азии, а Enterovirus С – в Африке [4].

Энтеровирусы – это широко распространённые вирусные агенты, являющиеся одним из основных возбудителей заболеваний человека вирусной этиологии. Например, в США энтеровирусы вызывают не менее 10–15 млн симптоматических инфекций в год [5]. НПЭВ имеют большую значимость в инфекционной патологии детей первых лет жизни, периодически вызывая массовые вспышки [6]. В Российской Федерации многолетняя динамика заболеваемости энтеровирусной инфекцией характеризовалась устойчивой тенденцией к росту и периодическими подъемами. До пандемии COVID-19 средний показатель заболеваемости энтеровирусными инфекциями составлял 7,02 на 100 тыс. населения, при этом удельный вес детей до 17 лет был более 90% [7]. Однако при проведении противоэпидемических мероприятий по профилактике новой коронавирусной инфекции зарегистрирован спад заболеваемости, вызванной НПЭВ. Это указывает на возможное уменьшение иммунной прослойки к НПЭВ и риск эпидемического подъёма заболеваемости в последующие годы [8].

Целью настоящей работы является обзор современных данных о заболеваниях, вызываемых НПЭВ, их распространённости, существующих и новых подходах к разработке вакцин для профилактики энтеровирусной (неполио) инфекции.

Заболевания, вызванные неполиомиелитными энтеровирусами

НПЭВ являются причиной широкого спектра заболеваний, включая энцефалит, менингит, миокардит, экзантему полости рта и конечностей (HFMD – Hand, Foot and Mouth Disease), конъюнктивит, респираторные и желудочно-кишечные заболевания, но большинство инфекций, связанных с НПЭВ, остаются бессимптомными. НПЭВ легко передаются от человека к человеку с использованием фекально-орального механизма или воздушно-капельным путём и могут поражать людей разных возрастных групп. Симптомы появляются через 3–7 дней после заражения. С появлением симптомов вирусная РНК детектируется в периферической крови, носоглоточных смывах и фекалиях, а при наличии осложнений – в спинномозговой жидкости [9]. У взрослых заболевания обычно протекают бессимптомно или характеризуются лёгким течением, которое в основном описывается как респираторное. Наиболее часто НПЭВ инфицируют новорождённых и детей младшего возраста, что связано с отсутствием у них антител. У детей клинические проявления могут варьировать от острых лихорадочных заболеваний до тяжёлых осложнений, требующих госпитализации и приводящих в ряде случаев к инвалидности или летальному исходу. Например, в Восточной и Юго-Восточной Азии частота госпитализаций с диагнозом HFMD составила около 6% от всех заболевших, из которых у 20% развивались осложнения, связанные с поражением центральной нервной системы, а 5% умирали [10]. Причины неблагоприятного течения заболевания остаются во многом непонятными. Однако в ряде исследований было показано, что генетические особенности хозяина и чрезмерная продукция различных цитокинов (цитокиновый шторм) коррелируют с тяжёлым течением заболевания [11].

НПЭВ разных типов могут быть причиной сходных по клинике заболеваний. При этом установлена преимущественная связь определённых типов энтеровируса со специфической клинической картиной. Так, представители вида Enterovirus А ответственны более чем за 90% случаев энтеровирусной экзантемы, которая может проявляться в форме HFMD, атипичной экзантемы и герпетической ангины [12]. Основными возбудителями, вызывающими вспышки HFMD во всём мире, являются Enterovirus (EV) A71 (EV-A71) [13] и Coxsackievirus (CV) A16 (CVА16) [14]. С начала ХХI в. в странах Азиатско-Тихоокеанского региона к ним присоединился CVА6 [15], а также CVА10, который сформировал вариант с повышенной нейровирулентностью [16]. Представители вида Enterovirus В чаще вызывают такие серьёзные, требующие госпитализации заболевания, как серозный энтеровирусный менингит, энцефалит, миелит и миокардит. Этиологическими агентами энтеровирусного менингита преимущественно являются типы Echovirus (E) – Е6, Е7, Е9, Е11, Е30 и др. Фактически вспышки асептического менингита и энцефалита по всему миру в основном связаны с различными типами Echovirus [17] и CVB5 [18]. Вирусы CVВ6 являются этиологической причиной разных клинических форм заболевания, включая HFMD и острый миокардит. В США CVB3 ежегодно вызывает 20 000–40 000 случаев острого миокардита, при этом у 3–8 из каждых 100 тыс. больных развивается дилатационная кардиомиопатия [19]. НПЭВ вида Enterovirus С могут вызывать HFMD, герпангину, асептический менингит и др. Особое эпидемическое значение приобрёл вариант CVA24v, вызвавший вспышки острого геморрагического конъюнктивита в ряде стран [20]. EV-D68, относящийся к виду Enterovirus D, известен как вирус, вызывающий вспышки полиомиелитоподобных острых вялых миелитов, в том числе с летальными исходами, в США и некоторых странах Европы с 2014 г. Циркуляция этого вируса зафиксирована в Западной Европе, Северной Америке, Африке, Юго-Восточной Азии [21].

На территории России обнаружена циркуляция не менее 53 типов НПЭВ: Enterovirus А (CVA2-А6, А8, А10, А14, А16, EV-A71, А76, А120); Enterovirus В (CVA9, CVB1-6, E1-7, Е9, Е11, Е13-19, Е21, Е22, Е24, Е29, Е30, Е31, Е33, EV-B75); Enterovirus С (CVA1, А13, А17, А20, А21, А22, А24, EV-C99, С113, С116); Enterovirus D (EV-D68). Однако эпидемическое значение имеют возбудители экзантемных форм заболевания (CVA6, CVA10, CVA16, EV-A71), асептического менингита (Е30, E6, CVB5) и миокардита (CVB3). Суммарная доля данных вирусов превышает 50% от всех НПЭВ, идентифицированных на территории России [22, 23]. При этом частота обнаружения НПЭВ в субъектах Российской Федерации характеризуется неравномерностью распределения и сезонными подъёмами. Дальневосточный федеральный округ характеризуется наиболее высокой частотой обнаружения НПЭФ, а на Кавказе НПЭФ детектируются реже, чем в других регионах. Сезонный подъём заболеваемости, вызванный НПЭВ, регистрируется в августе–сентябре [7].

Структурная организация энтеровирусов

Геном энтеровирусов представлен однонитевой линейной РНК позитивной полярности размером 7,1–7,4 kb и включает концевые нетранслируемые регионы, фланкирующие одну открытую рамку считывания, кодирующую полипротеин размером 2100 аминокислот. В процессе трансляции происходит каскад расщепления полипротеина вирусными протеазами 2А и 3С сначала на три белка-предшественника (P1, P2 и P3), затем на функциональные белки. P1 расщепляется на четыре структурных белка (VP1, VP2, VP3, VP4), а P2 и P3 – на семь неструктурных белков (P2-2Apro, 2B, 2C, P3-3A, 3B, 3Cpro, 3Dpol). Четыре структурных белка путём самосборки формируют основной строительный блок капсида вириона – протомер. Пять протомеров образуют пентамер, а 12 пентамеров и вирусный геном образуют икосаэдральный вирион диаметром 30 нм с pseudo-Т = 3 типом симметрии. Белки VP1, VP2 и VP3, представленные на поверхности вириона, формируют структуры, отвечающие за распознавание рецептора [24].

Капсидные белки являются основными антигенами вириона. На белках VP1, VP2 и VP3 обнаружены линейные и конформационные эпитопы, связывание с которыми антител приводит к нейтрализации вируса [25]. Высокая вариабельность аминокислотных последовательностей поверхностных белков НПЭВ приводит к тому, что антитела, нейтрализующие один тип вируса, не способны нейтрализовать другие типы. Неструктурные белки также содержат В- и Т-клеточные эпитопы, некоторые из которых вызывают перекрестные иммунные реакции с разными типами НПЭВ [11].

Иммунный ответ на неполиомиелитные энтеровирусы

К настоящему времени понятно, что для эффективной защиты организма от инфекции НПЭВ достаточно нейтрализующих антител, которые в большинстве случаев предотвращают заражение или останавливают прогрессирование заболевания. На примере больных HFMD было показано, что антитела класса IgM к вирусу EV-A71 детектировались уже через день после появления клинических симптомов, а антитела класса IgG – на 3–6-й день. Продукция нейтрализующих антител в большинстве случаев приводит к выздоровлению. У пациентов с поражением центральной нервной системы титры нейтрализующих антител не отличались от соответствующих титров у пациентов с лёгким течением HFMD. После выздоровления антитела IgM сохранялись в сыворотке крови в течение месяцев, а IgG детектировались несколько лет [26]. Следует отметить, что антитела класса IgG против НПЭВ могут передаваться от матери к плоду и сохраняться в периферической крови ребёнка в течение нескольких месяцев после рождения [27].

Сероэпидемиологические исследования показали, что частота обнаружения антител к НПЭВ варьирует в зависимости от типа вируса, возрастной группы населения, времени и места проведения исследования. Общей закономерностью является увеличение частоты обнаружения антител к НПЭВ с увеличением возраста детей. У младенцев 5–12 мес частота обнаружения антител составляет 4–18%, а в возрастной группе 7–19 лет она возрастает до 30–50% с последующим сохранением данного показателя у взрослых [28].

Вакцины против неполиомиелитных энтеровирусов

В связи со значимостью в инфекционной патологии детей ведется разработка вакцин против разных эпидемических типов НПЭВ. Эпидемии, связанные с EV-А71, стали серьёзной угрозой для общественного здравоохранения в Азиатско-Тихоокеанском регионе, что определило усилия в первую очередь китайских исследователей по разработке типоспецифических вакцин для профилактики HFMD. Наибольшее распространение приобрела классическая технология получения вакцин путём инактивации цельных вирионов. Тремя разработчиками (Sinovac Biotech, Beijing Vigoo Biological и Китайской академией медицинских наук) были получены три инактивированные вакцины против EV-A71. В клинических испытаниях все три вакцины показали безопасность и высокую эффективность для профилактики заболеваний, ассоциированных с EV-A71. В настоящее время китайскими компаниями получена лицензия на производство инактивированных вакцин против EV-A71 для детей до 5 лет. При этом вакцина фирмы Sinovac Biotech, основанная на использовании вируса субгенотипа С4, показала 95% эффективность против HFMD, вызванной EV-А71, и 100% защиту от инфекции EV-А71 с неврологическими симптомами [29]. Вакцина вызывала устойчивый, в течение 5 лет, иммунитет против различных генотипов EV-A71. В связи с этим Всемирная организация здравоохранения полагает, что она может быть использована во всём мире [30]. На Тайване для ‎‎производства инактивированной вакцины против EV-A71 ‎‎использовали вирус генотипа B4. Вакцина вызывала продукцию нейтрализующих антител против EV-A71 разных генотипов и не обладала серьёзными побочными эффектами, а антитела сохранялись не менее 2 лет. В настоящий момент вакцина проходит 3-й этап испытаний [31]. Имеются сообщения о разработке типоспецифических моновалентных и комбинированных вакцин на основе инактивированных вирусов CVA16, CVA6, CVA10. По результатам доклинических испытаний хорошую иммуногенность и протективные свойства показали моновалентная вакцина против CVA16 и двухвалентная против EV-A71 и CVA16 [32].

Ведутся исследования, направленные на получение живых вакцин на основе аттенуированных вирусов. В процессе адаптации CVA16 к диплоидной линии эмбриональных клеток лёгких человека KMB17 был получен аттенуированный штамм K168-8Ac. При вакцинации макак резусов штаммом K168-8Ac была показана высокая эффективность защиты от инфекции CVA16 [33]. Для получения аттенуированных вирусов широко применяется создание инфекционных клонов комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты НПЭВ. На примере EV-A71 определено, что мутации в 5’-нетранслируемом регионе РНК или аминокислотные замены в белках вируса приводят к снижению вирулентности in vitro и in vivo. Установлено, что замена цитозина на урацил в позиции 158 РНК снижала скорость трансляции полипротеина и вирулентность EV-A71 [34]. Аминокислотные замены в VP1 (G64R или G64T) и 3D полимеразе (S264L и L123F) также снижали вирулентность EV-А71 [35, 36]. P.T.I. Yee и соавт. сконструировали штамм EV-A71 (pIY), в геном которого были встроены нуклеотидные последовательности, являющиеся мишенью для двух микроРНК (let-7a и miR-124a). Это приводило к уменьшению числа копий РНК вируса по сравнению с диким типом в клетках, имеющих различное тканевое происхождение. Вакцинация штаммом pIY защищала мышей от смертельной дозы EV-A71 [37]. В США группой учёных создан живой ослабленный штамм CVB3 (Mt10), имеющий аминокислотную замену в VP1 (H790A). Иммунизация мышей штаммом Mt10 защищала их как от миокардита, так и от панкреатита [38].

Следует отметить, что живые аттенуированные вакцины являются высокоиммуногенными препаратами, однако их использование для создания поливалентных энтеровирусных вакцин несёт риски. Для НПЭВ показано, что межвидовая и внутривидовая рекомбинации между геномами являются одним из факторов формирования новых эпидемических вариантов. При попадании вакцинных штаммов в организм, инфицированный диким вирусом, возникает риск формирования вариантов НПЭВ с непредсказуемыми свойствами [39].

В качестве альтернативы инактивированным и живым аттенуированным вакцинам разрабатываются субъединичные вакцины. К настоящему времени в аминокислотных последовательностях поверхностных белков НПЭВ обнаружено множество консервативных линейных эпитопов, являющихся мишенями для нейтрализующих антител. Использование пептида SP70 VP1 EV-A71 (208–222 аминокислоты) для вакцинации показало, что антисыворотка против SP70 пассивно защищала новорождённых мышей как от гомологичных, так и от гетерологичных штаммов EV-A71. Y.X. Li и соавт. разработали пептид, состоящий из трёх линейных эпитопов белка VP1 EV-A71, последовательно соединённых линкером (Gly4Ser). Однако, несмотря на применение адъювантов, титры нейтрализующих антител после иммунизации мышей пептидами были в 4 раза ниже, чем у мышей, иммунизированных инактивированной вакциной [40].

Для повышения иммуногенности субъединичных вакцин проводятся исследования по встраиванию пептидов поверхностных белков НПЭВ в другие вирусы и вирусоподобные частицы (ВпЧ). X. Tian и соавт. сообщили о включении эпитопа SP70 EV-A71 в экспонированные на поверхности домены гексона аденовируса III типа (Mastadenovirus: Human adenovirus B: Human adenovirus 3). Конструкция была способна вызывать гуморальный ответ, специфичный для эпитопа SP70 [41]. Основной антиген (HBc) вируса гепатита B (Orthohepadnavirus: Hepatitis B virus) был использован для формирования вирусоподобных частиц с экспонированным на поверхности эпитопом VP2 CVA10 (136–150 а.к.). Такие ВпЧ вызывали сильный гуморальный ответ у мышей, а антитела нейтрализовали как штамм-прототип, так и другие клинические изоляты CVA10 [42]. L. Jiang и соавт. сконструировали Р-частицы норовируса (Calicividae: Norovirus), экспонирующие на поверхности эпитопы капсидных белков EV-A71. Наибольшую эффективность показал эпитоп VP3 (176–190 аминокислоты), использование которого в составе Р-частицы для иммунизации самок мышей позволяло защитить рождённых ими мышат от летальной дозы EV-A71 в период лактации [43]. В нашей работе на основе белка VP1 норовируса были получены ВпЧ, презентирующие на поверхности полноразмерный VP1 Е30 [44].

При исследовании самосборки вирионов НПЭВ было установлено, что для формирования ВпЧ энтеровирусов достаточна совместная экспрессия только P1 и 3C областей генома. Причём самосборка происходила при экспрессии в клетках как насекомых [45], так и дрожжей [46]. Данное наблюдение было использовано для получения ВпЧ НПЭВ в качестве антигенов для вакцины. Группа исследователей из Китая на основе ВпЧ основных возбудителей HFMD (EV-А71, CVA16, CVA6, CVA10) создала четырехвалентную вакцину и продемонстрировала её способность вызывать у мышей протективный иммунитет против исследуемых вирусов. Титры нейтрализующих антител были сравнимы с соответствующими моновалентными вакцинами и защищали мышей как от единичного, так и от смешанного инфицирования вирусами EV-А71, CVA16, CVA6, CVA10 [47]. Подобным образом были получены ВпЧ EV-А71 генотипа С4а, явившегося причиной вспышки HFMD в Корее в 2009 г., при которой заболевание характеризовалось частыми поражениями центральной нервной системы [48]. Также с использованием клеток насекомых получены ВпЧ CVB3 и CVB1 и разработана технология их производства с повышенным выходом и чистотой продукта [49]. В целом показано, что такие ВпЧ индуцируют сильный и длительный гуморальный иммунный ответ и перспективны для разработки высокоэффективных вакцин против энтеровирусов.

Совместная экспрессия белка-предшественника P1 и протеазы 3CD также приводила к самосборке ВпЧ энтеровирусов в дрожжах. C. Zhang и соавт. получили высокий выход рекомбинантных ВпЧ EV-A71 в клетках Pichia pastoris. При иммунизации мышей такие ВпЧ индуцировали высокие титры антител, способных нейтрализовать различные штаммы EV-A71. Что ещё более важно, иммунизация самок защищала рождённых ими мышат от летального исхода при заражении EV-A71 [50]. Z. Yang и соавт. сообщили о получении штамма P. pastoris с высоким уровнем продукции ВпЧ, который составил 270 мг/л [51]. Опубликованы результаты успешных доклинических испытаний данной кандидатной вакцины на грызунах и приматах, что послужило основанием для проведения клинических испытаний [52]. Также в клетках P. pastoris получены ВпЧ EV-D68. Мыши, иммунизированные такими ВпЧ, продуцировали антитела, нейтрализующие вирус в условиях in vitro. Вакцинация самок защищала рождённых ими мышат-сосунков от летальных доз вируса. Пассивный перенос сывороток, содержащих антитела против полученных ВпЧ, обеспечивал полную защиту мышей-реципиентов [53]. L. Sherry и соавт. с использованием генетического материала термостабильного мутантного штамма PV-1 получили в P. pastoris ВпЧ, которые имели общие характеристики с ВпЧ, продуцируемыми клетками млекопитающих. Авторы заключили, что ВпЧ полиовируса, полученные в дрожжах, являются многообещающей системой для крупномасштабного производства полиовирусных вакцин [54].

Заключение

НПЭВ являются одними из основных склонных к эпидемическому распространению возбудителей заболеваний вирусной этиологии у детей младшего возраста, вызывающих заболевания с различной клинической картиной. В связи с этим в мире ведется разработка вакцин против разных эпидемических типов НПЭВ. Для предотвращения вспышек экзантемных заболеваний в Юго-Восточной Азии разработаны инактивированные типоспецифические вакцины для профилактики HFMD, связанной с ЭВ-А71, разрабатываются поливалентные вакцины на основе инактивированных вирусов CVA16, CVA6, CVA10. Также исследуется применимость альтернативных подходов, основанных на аттенуированных вирусах, субъединичных вакцинах и ВпЧ. Обзор литературных данных показал, что ВпЧ являются привлекательной платформой для разработки более безопасных вакцин против как заболеваний, вызванных НПЭВ, так и полиомиелита. В ВпЧ отсутствует вирусный геном, они безопасны в производстве и применении. Развитие биотехнологии на современном этапе позволяет использовать ВпЧ для разработки поливалентных энтеровирусных вакцин нового поколения, обладающих высокой иммуногенностью и возможностью непрерывной модернизации, позволяющей заменять антигены в составе вакцины на актуальные.

Участие авторов: Новиков Д.В., Мелентьев Д.А. – анализ литературы, написание текста статьи, утверждение окончательного варианта статьи.

Финансирование. Исследование проведено в рамках государственного задания Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор).

Конфликт интересов: Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Об авторах

Дмитрий Викторович Новиков

ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора

Email: novikov.dv75@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7049-6935

канд. биол. наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунохимии

Россия, 603950, Нижний Новгород

Дмитрий Александрович Мелентьев

ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора; ФГАОУ ВО «Нижегородский государственный университет имени Н.И. Лобачевского»

Автор, ответственный за переписку.
Email: dim-melente@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2441-6874

младший научный сотрудник лаборатории иммунохимии, аспирант

Россия, 603950, Нижний; 603022, Нижний Новгород

Список литературы

Дополнительные файлы