Construction of norovirus (Caliciviridae: Norovirus) virus-like particles containing VP1 of the Echovirus 30 (Picornaviridae: Enterovirus: Enterovirus B)

D. V. Novikov; Новиков Д. В.; D. A. Melentev; Мелентьев Д. А.; V. V. Mokhonov; Мохонов В. В.; A. Yu. Kashnikov; Кашников А. Ю.; N. A. Novikova; Новикова Н. А.; V. A. Lapin; Лапин В. А.; E. V. Mokhonova; Мохонова Е. В.; V. V. Novikov; Новиков В. В.

doi:10.36233/0507-4088-79

Construction of norovirus (Caliciviridae: Norovirus) virus-like particles containing VP1 of the Echovirus 30 (Picornaviridae: Enterovirus: Enterovirus B)

Authors: Novikov D.V.¹, Melentev D.A.¹^,2, Mokhonov V.V.¹, Kashnikov A.Y.¹, Novikova N.A.¹, Lapin V.A.¹^,2, Mokhonova E.V.¹, Novikov V.V.¹^,2
Affiliations:
1. FSBI «Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)
2. FSAEI HE «National Research Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod» of the Ministry of Education and Science of Russia
Issue: Vol 66, No 5 (2021)
Pages: 383-389
Section: ORIGINAL RESEARCH
Submitted: 04.11.2021
Accepted: 04.11.2021
Published: 04.11.2021
URL: https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/563
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-79
ID: 563

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Enterovirus (nonpolio) infection is widespread all over the world, registered as sporadic cases and large-scale outbreaks and can cause severe lesions such as serous meningitis. Epidemiological studies have shown that enterovirus (Picornaviridae; Enterovirus) variant Echovirus 30 (E30) is the most frequently detected variant in patients with enterovirus meningitis in the Russian Federation. However, no vaccines to prevent the disease caused by this pathogen have been developed so far. One of the promising modern trends in terms of creating vaccine preparations is the use of virus-like particles (VLPs), including chimeric ones containing the biological structures of viruses belonging to different species.

The aim of this work was to obtain norovirus (Caliciviridae; Norovirus) VLPs displaying enterovirus Echovirus E30 full-length VP1 on the surface.

Material and methods. The nucleotide sequences of VP1 protein of norovirus genotype GII.4 and VP1 E30 of genotype h circulating in Russia were used. The S_N-VP1_E30 protein was constructed, in which the shell (S) and the hinge regions of the norovirus VP1 are fused into one molecule with the full-length VP1 of the E30 virus. The protein was expressed in E. coli, purified using affinity chromatography, and characterized by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and immunoblotting. VLPs were visualized by electron microscopy.

Results. The S _N-VP1_E30 protein expressed in E. coli as insoluble form, so the conditions for S_N-VP1_E30 solublisation were defined. Sucrose has been shown to significantly increase the efficiency of renaturation. Electrophoretic mobility comparison of denatured and non-denatured S_N-VP1_E30 demonstrated that most monomers form high molecular weight compounds. Electron microscopy showed that renatured S_N-VP1_E30 spontaneously forms empty virus-like particles about 50 nm in diameter.

Conclusion. Chimeric protein S_N-VP1_E30 self-assemble into VLPs displaying the VP1 protein of E30 variant that is highly prevalent in Russia. Further immunological research is necessary to characterize VLPs potential for development of the vaccine for enteroviral meningitis prevention.

Keywords

virus-like particles, norovirus VP1 protein, Echovirus 30 VP1 protein, chimeric proteins, vaccines

Full Text

Введение

Энтеровирусы (ЭВ) (род Enterovirus, семейство Picornaviridae, порядок Picornavirales) – многочисленная группа безоболочечных РНК-содержащих вирусов, циркуляция которых показана во всём мире [1]. Неполиомиелитные ЭВ способны вызывать различные по клинической картине и степени тяжести заболевания преимущественно у детей первых лет жизни. Энтеровирусная инфекция может проявляться в форме экзантемы полости рта и конечностей (hand, foot and mouth disease, HFMD), герпангины, менингита, менингоэнцефалита, энцефалита, полинейропатии, вялого паралича, миокардита и др. Тяжесть течения болезни варьирует от умеренного ухудшения самочувствия с субфебрильным повышением температуры тела до мультисистемных проявлений с поражением сердечно-сосудистой и центральной нервной систем. Часто ЭВ имеют эпидемическое распространение, охватывающее большие группы детского населения [2].

На основе генетических характеристик и антигенных свойств ЭВ разделены на 4 вида (A–D), среди которых наиболее распространены вирусы, относящиеся к видам Enterovirus A (ЭВ-А) и Enterovirus В (ЭВ-В) [3]. Из них ЭВ-А (Enterovirus A71; Coxsackievirus A6, A10, A16 и др.) наиболее часто вызывают HFMD у детей младшего возраста. Подавляющее большинство заболевших полностью выздоравливают через 7–10 сут. Однако в некоторых случаях развиваются выраженные осложнения, вызванные поражением центральной нервной системы; описаны единичные летальные исходы. Представители вида ЭВ-В (Coxsackievirus B3, В5; Echovirus 25, 30) чаще связаны с такими серьёзными заболеваниями, как миокардит, асептический менингит, энцефалит и гепатит, нередко приводящими к инвалидности или смерти [4]. В этой группе особо выделяются вирусы ECHO (англ. enteric cytopathic human orphan viruses, букв. – кишечные цитопатогенные человеческие орфанные вирусы), поскольку они являются причиной асептического менингита и энцефалита не только у детей, но и у взрослых [5].

ЭВ регистрируются повсеместно, однако в странах Юго-Восточной Азии наибольшее эпидемическое значение имеют ЭВ-А, а в государствах, расположенных на территориях Европы и Северной Америки, – ЭВ-В [6][7]. Эпидемиологические исследования распространённости ЭВ на территории Российской Федерации показали, что в последнее время у детей и взрослых, больных энтеровирусным менингитом, наиболее часто выявляется Echovirus 30 (E30) [8].

В мировой практике с целью профилактики энтеровирусной инфекции разрабатываются вакцины главным образом для предотвращения экзантемных поражений, вызванных Enterovirus А71, Coxsackievirus А6, А10, А16. В отношении ЭВ-В подобные разработки направлены на Coxsackievirus В3, являющийся основной причиной миокардита [9]. В то же время в мире и в России часто регистрируются эпидемические подъёмы заболеваемости, обусловленные вариантом E30 [10], однако вакцина для профилактики вызываемых им заболеваний отсутствует.

Ранее была предложена универсальная платформа на основе белка VP1 норовируса (Caliciviridae; Norovirus) для презентации вирусных антигенов (АГ). Такой подход позволяет получать вирусоподобные частицы (ВпЧ), на поверхности которых представлены различные АГ, пригодные для использования в составе вакцинных препаратов. Показано, что полученные в E. coli белки, состоящие из аминокислотной последовательности S-домена VP1, слитого в одну молекулу с фрагментами аналогичных последовательностей VP8 ротавируса (Reoviridae; Sedoreovirinae: Rotavirus), гемагглютинина вируса гриппа А (Orthomyxoviridae: Influenza A virus) (H7N9) или капсидного белка вируса гепатита Е (Hepeviridae; Hepevirus: Hepatitis E virus), способны формировать ВпЧ, имеющие на своей поверхности добавленные пептиды. Иммунизация лабораторных животных химерными структурами, созданными согласно данному принципу, приводила к продукции нейтрализующих антител в высоких титрах [11][12]. Цель настоящей работы – получение ВпЧ норовируса, содержащих на поверхности белок VP1 Е30.

Материал и методы

Конструирование слитого белка. В работе использовали нуклеотидные последовательности генов белков VP1 норовируса генотипа GII.4 (GenBank No. MZ958411) и VP1 E30 генотипа h (GenBank No. КР090772), штаммов, циркулирующих на территории РФ. Конструирование слитого гена проводили на основе анализа нуклеотидных последовательностей с использованием пакета программ Lasergene (Dnastar, Inc., США). Оптимизацию кодонов осуществляли на основе информации, представленной в базе данных Codon usage database (http://www.kazusa.or.jp/codon/). ДНК синтезировали в ООО «Люмипроб РУС» (Россия) и клонировали в составе плазмиды pET22b (Novagen, США).

Экспрессия и очистка рекомбинантного белка. Для экспрессии рекомбинантного белка использовали штамм E. coli Rosetta 2 (DE3) (Novagen, США), клетки которой трансформировали плазмидой, кодирующей рекомбинантный белок, с применением мультипоратора Eppendorf (Германия). E. coli выращивали при 37 °С в среде LB (lysogeny broth) (1% триптон, 2% дрожжевой экстракт, 0,9% NaCl и 100 мкг/мл ампициллина) до оптической плотности 0,7. Экспрессию индуцировали добавлением изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до концентрации 0,5 мМ, после чего культуру инкубировали на протяжении 6 ч при 30 °С. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием, однократно отмывали в 0,9% NaCl и лизировали с использованием реагента BugBuster Protein Extraction Reagent (Novagen, США) согласно рекомендациям производителя. Лизат разделяли центрифугированием при 12 000 g в течение 15 мин на растворимую и осадочную белковые фракции. Последнюю с целью очистки рекомбинантного белка растворяли в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl, 6 М гуанидина гидрохлорида, 150 мМ NaCl (pH 7,5), и затем выполняли аффинную хроматографию с использованием сорбента IMAC Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, Швеция) согласно рекомендациям производителя для денатурирующих условий. Ренатурацию белка осуществляли методом диализа против 3000 объёмов буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl и 20%, 10% или 5% сахарозы (С12H22O11).

Определение концентрации белка. Концентрацию белка в растворе определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific, США) при длине волны 280 нм. Эффективность ренатурации белка оценивали путём сравнения концентрации растворимого белка до и после диализа. Значение концентрации до диализа принимали за 100%.

Электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг. Все этапы экспрессии и очистки рекомбинантного белка контролировали методом электрофореза белков в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Денатурацию белков проводили в течение 5 мин при 100 °С в буфере, содержащем 50 мМ трис-НСl (pH 6,8), 100 мМ дитиотреитола, 2% ДСН и 4 М мочевины. При исследовании олигомерного состояния белки наносили на гель в буфере, содержащем 50 мМ трис-НСl (pH 6,8), 2% ДСН и 20% глицерина. Результаты визуализировали окрашиванием геля с помощью красителя Coomassie brilliant blue R-250 (Imperial Chemical Industries PLC, Великобритания). Использовали маркёр молекулярных масс Thermo Scientific PageRuler Unstained Protein Ladder (10 to 200 kDa) (ThermoFisher Scientific). Интенсивность окрашивания белковых полос оценивали при помощи компьютерной программы C-DiGit (LI-СOR, США). Для проведения иммуноблоттинга белки переносили из геля на мембрану из поливинилиденфторида (ПВДФ; PVDF) (ThermoFisher Scientific) посредством системы влажного переноса (Bio-Rad, США). Контроль переноса и определения молекулярной массы осуществляли с использованием маркёра PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (ThermoFisher Scientific), представляющего собой смесь 9 белков (от 10 до 250 кДа), окрашенных синим, оранжевым и зелёным. Мембрану блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА; BSA) в фосфатно-солевом буфере (phosphate buffered saline, PBS) и инкубировали с антителами anti His-HRP:GG1-6F4.3.2 (Miltenyi Biotec, США). После этого мембрану окрашивали в растворе субстрата SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate kit (ThermoFisher Scientific) и измеряли хемилюминесценцию при помощи сканера C-DiGit Blot Scanner (LI-СOR), также в соответствии с рекомендациями производителей.

Электронная микроскопия. В экспериментах использовали трансмиссионную электронную микроскопию. На электронно-микроскопическую медную сетку, покрытую парлодиевой плёнкой, наносили 5 мкл раствора белка в концентрации 100 мкг/мл, отмывали водой от несвязавшихся компонентов и окрашивали водным раствором 2% уранилацетата (рН 4,5). Образцы просматривали с помощью электронного микроскопа просвечивающего типа НТ7700 (Hitachi, Япония).

Результаты

На основе нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих белки VP1 норовируса генотипа GII.4 и VP1 вируса E30 генотипа h, создана генетическая конструкция S_N-VP1_E30, состоящая из слитых в одну молекулу последовательностей, кодирующих оболочечный (S) и шарнирный (hinge) регионы VP1 норовируса, полноразмерный белок VP1 E30 и последовательности, кодирующей 6 молекул гистидина (His, H). Структурная организация слитого белка S_N-VP1_E30схематически показана на рис. 1. Для более эффективного образования ВпЧ триплеты, кодирующие аминокислоты в позициях 57, 58 и 136 S-региона VP1 норовируса, заменены на нуклеотиды, кодирующие цистеин (Cys, C), как предложено ранее [11]. Нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в E. coli и помещена под контроль регуляторных элементов бактериофага Т7 в составе плазмиды рЕТ22b.

Рис. 1. Схема организации слитого белка SN-VP1E30.
Shell (S) – амино-терминальный домен белка VP1 норовируса; Hinge – шарнирный регион VP1 норовируса; VP1 – полноразмерный белок VP1 вируса Е30; His – последовательность из 6 гистидинов.
Fig. 1. Scheme of the fusion protein.
Shell (S), norovirus VP1 amino-terminal domain; Hinge, norovirus VP1 hinge region; VP1, E30 virus full-length VP1 protein; His, sequence of six six histidines.

Результаты экспрессии белка S_N-VP1_E30 в E. coli представлены на рис. 2. После индукции в E. coli нарабатывался дополнительный белок (рис. 2, а). Методом иммуноблоттинга с использованием моноклональных антител против последовательности из 6 молекул гистидина подтверждена экспрессия S_N-VP1_E30 (рис. 2, б). При сравнении набора белков E. coli в растворимой и осадочной фракциях установлено, что S_N-VP1_E30 присутствовал в нерастворимой форме (рис. 2, в). В связи с этим осадочную белковую фракцию растворяли в буфере, содержащем 6 М гуанидина гидрохлорида, и выделяли S_NVP1_E30, содержащий гистидиновый «хвост», методом аффинной хроматографии. Электрофоретическая подвижность очищенного искомого белка совпадала с расчётной (рис. 2, г).

Рис. 2. Экспрессия белка S_N-VP1_E30 в E. coli.
а) – сравнение белков E. coli до (1) и через 6 ч после (2) индукции экспрессии; б) – подтверждение экспрессии белка S_N-VP1_E30 иммуноблоттингом; в) – состав белков E. coli в растворимой (1) и нерастворимой (2) фракциях; г) – электрофоретическая подвижность очищенного SN-VP1_E30 (1); М – маркёры молекулярной массы.
Fig. 2. Expression of S_N-VP1_E30 protein in E. coli.
a), comparison of E. coli proteins before (1) and 6 hours after induction of expression (2); b), confirmation of S_N-VP1_E30 protein expression by immunoblotting; c), E. coli protein composition in soluble (1) and insoluble (2) fractions; d), electrophoretic mobility of purified S_N-VP1_E30 (1); M, molecular weight markers.

Для ренатурации белка S_N-VP1_E30 использовали предложенный ранее метод стабилизации ВпЧ норовируса. J. Kissmann и соавт. показали, что высокие концентрации различных сахаров оказывают стабилизирующий эффект на вторичную и третичную структуру мономеров ВпЧ этого вируса [13]. В нашем исследовании наблюдался сходный эффект высоких концентраций сахаров по отношению к белку S_N-VP1_E30. Диализ против содержащего 20% сахарозы буферного раствора позволил ренатурировать до 97% количества S_N-VP1_E30 (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость эффективности ренатурации белка S_N-VP1_E30 от концентрации сахарозы.
Fig. 3. The efficiency of S_N-VP1_E30 protein renaturation depending on the sucrose concentration.

Ренатурированный в 20% сахарозе препарат исследовали на способность мономеров S_N-VP1_E30 к образованию межмолекулярных связей. Сравнение электрофоретической подвижности денатурированного и неденатурированного препаратов исследуемого белка показало, что большинство мономерных структур образуют соединения со значительной молекулярной массой, детектируемые в начале геля (рис. 4, а). Способность мономеров S_N-VP1_E30 формировать ВпЧ изучали методом электронной микроскопии, при проведении которой в препарате белка обнаружены сферические ВпЧ размером ~50 нм. Данные частицы были окрашены изнутри (рис. 4, б), что характерно для полых образований. Полученные результаты свидетельствуют о способности химерной белковой структуры, состоящей из S-фрагмента VP1 норовируса и полноразмерного белка VP1 энтеровируса E30, к самосборке.

Рис. 4. Самосборка белка S_N-VP1_E30.
а) – сравнение электрофоретической подвижности денатурированного (1) и неденатурированного (2) S_N-VP1_E30; б) – вирусоподобные частицы, образованные белком S_N-VP1_E30; электронная микрофотография, увеличение ×12 000.
Fig. 4. Self-assembly of the S_N-VP1_E30 protein.
a), comparison of the electrophoretic mobility of denatured (1) and non-denatured (2) S_N-VP1_E30; b), virus-like particles formed by the S_N-VP1_E30 protein; electron microphotograph, 12,000× magnification.

Обсуждение

Несмотря на широкое распространение вируса Е30 и его доказанную связь с возникновением энтеровирусного менингита и других заболеваний, данный вирус является одним из наименее изученных представителей ЭВ. Основные представления о строении их вириона и жизненном цикле получены на примере Enterovirus А71, Coxsackievirus А16 и А6. К настоящему времени известно, что основной капсидный белок VP1 этих вирусов формирует поверхностные структуры вириона, отвечающие за распознавание рецептора на клетке. На поверхности VP1 ЭВ обнаружены как конформационные, так и линейные нейтрализующие эпитопы, что делает данный белок основным кандидатом для разработки типоспецифических вакцин [14].

Поскольку основной группой риска заболеваний, вызванных ЭВ, являются дети младшего возраста, разработка безопасных вакцинных препаратов на основе пептидов, содержащих нейтрализующие эпитопные последовательности, считается привлекательным и многообещающим подходом. Однако по сравнению с вакцинами на основе убитых или аттенуированных вирусов небольшие синтетические пептиды обладают слабой иммуногенностью [15]. В то же время ВпЧ имеют морфологию вириона и являются оптимальными системами доставки, обеспечивающими презентацию нейтрализующих эпитопов иммунной системе. Обладая способностью эффективно взаимодействовать с антигенпрезентирующими клетками, указанные частицы максимизируют иммуногенный потенциал и защитные свойства антител [16].

На сегодняшний день разработано множество подходов использования ВпЧ в качестве векторов для презентации АГ [12][17][18]. Нами сконструированы химерные ВпЧ, построенные на основе белка капсида норовирусов. Выбор данной модели связан со способностью норовирусных ВпЧ вызывать сильный иммунный ответ на слизистой оболочке, что даёт перспективу для разработки эффективной мукозальной вакцины [19]. Путём генетических манипуляций в белке VP1 норовируса представленный на поверхности вириона Р-домен (англ. protruding – выступающий) заменён на полноразмерный VP1 вируса Е30. Поскольку поверхностные белки вириона ЭВ не гликозилируются, экспрессия рекомбинантного белка осуществлялась в клетках E. coli. Полученный слитый белок использован для сборки ВпЧ in vitro.

Стратегия получения подобных частиц ЭВ in vivo в клетках насекомых (Insecta) или дрожжей (Ascomycota, Basidiomycota) для последующего использования в качестве АГ в составе вакцин описана для Enterovirus А71, вируса Coxsackievirus А16 и Enterovirus D68 [20][21]. При использовании такого подхода капсидные белки собираются в ВпЧ внутри клеток-хозяев. Это приводит к инкапсулированию внутрь ВпЧ ассоциированных с клеткой-хозяином загрязнений, потенциально способных вызвать нежелательный иммунный ответ, в т.ч. аллергические реакции [22]. В нашей работе показана возможность самосборки in vitro химерных ВпЧ, презентирующих на своей поверхности VP1 Е30. Для сборки используется очищенный белок, что препятствует встраиванию в частицу нежелательных примесей. Кроме этого, методология сборки in vitro предоставляет возможность смешивать в составе частицы различные белки, что в перспективе позволит получать ВпЧ, содержащие АГ от разных генотипов Е30 либо смесь белков ЭВ разных типов в одной частице. Апробированная в данной работе методика создания химерных ВпЧ на основе платформы из капсидного белка норовируса открывает возможности разработки поливалентной энтеровирусной вакцины, а также быстрой замены АГ в случае появления новых эпидемических вариантов ЭВ.

Заключение

В настоящей работе получены ВпЧ, состоящие из химерной рекомбинантной белковой структуры, включающей слитые с полноразмерным белком VP1 энтеровируса E30 S-домен и шарнирную часть белка VP1 норовируса. Поскольку поверхностные белки вириона ЭВ не гликозилируются, для наработки рекомбинантного белка применена одна из самых простых и недорогих систем экспрессии – E. coli. Использование способности химерного белка к самосборке в условиях in vitro открывает перспективы формирования ВпЧ, содержащих АГ от разных генотипов вируса Е30 или смесь белков ЭВ разных типов. Последующее изучение свойств сконструированных химерных ВпЧ позволит оценить их потенциал в качестве возможного прототипа вакцины.

About the authors

D. V. Novikov

Author for correspondence.
Email: novikov.dv75@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7049-6935

Dmitry V. Novikov, Ph.D. (Biol.), Associate Professor, Lead Researcher of the Immunochemistry Laboratory