Antiviral activity of the organic germanium complex with aciclovir against herpes simplex virus (Herpesviridae: Alphaherpesvirinae: Simplexvirus: Human alphaherpesvirus 1/2) in the in vitro and in vivo systems

Full Text

Введение

Вирусы простого герпеса (ВПГ) (герпесвирусы человека, ГВЧ) 1 и 2 типов широко распространены в человеческой популяции и способны вызывать разные по степени тяжести заболевания (назальный/лабиальный герпес, herpes nasalis/labialis; генитальный герпес (ГГ), herpes genitalis; офтальмогерпес; энцефалит; полиорганные поражения и др.) [1][2]. По эпидемиологическим оценкам, в мире ВПГ-1 (ГВЧ-1) инфицировано 66,6% населения в возрасте от 0 до 49 лет, или 3,4 млрд человек, и ВПГ-2 (ГВЧ-2) – 13,2% населения в возрасте от 15 до 49 лет, или 491,5 млн человек [3][4].

Среди всех противовирусных средств, используемых в клинической практике, препаратом 1 линии при лечении различных форм герпесвирусной инфекции (ГВИ) является ацикловир (АЦВ) (Aciclovir, ACV; 9-([ 2 гидроксиэтокси]метил]-гуанин, C₈H₁₁N₅O₃) – синтетический аналог пуринового нуклеозида [2][5]. Механизм действия АЦВ основан на том, что он, конкурентно взаимодействуя с ДНК-полимеразой ВПГ, включается вместо дезоксигуанозина в вирусную ДНК, блокирует её синтез и репликацию вируса [5][6]. Однако применение АЦВ (пероральное в эпизодическом или супрессивном режимах, парентеральное либо местное) в ряде случаев не приводит к ожидаемому результату [2][5–8]. Отсутствие эффекта может быть обусловлено рядом факторов, в т.ч. связанных с биофармацевтическими параметрами препарата и его лекарственных форм: низкая всасываемость в желудочно кишечном тракте в результате гидрофильности и малой пероральной биодоступности (~20%); незначительная растворимость в воде (1,3 мг/мл при 25° C и 2,5 мг/мл – при 37° C); сниженная трансдермальная диффузия при использовании топических форм [2][5][7]. На эффективность также могут оказывать влияние индивидуальные характеристики пациента (особенности функционирования органов и систем, прежде всего иммунной [2]) и биологические особенности вируса (способность к латенции, персистенции, формирование штаммов ВПГ, устойчивых к действию АЦВ) [2][6–8].

Повышение эффективности терапии больных с разными формами ГВИ диктует необходимость поиска новых путей модификации АЦВ и его лекарственных форм с целью улучшения их биофармацевтических характеристик [2][5][9]. Так, одним из подходов к решению указанной проблемы в отношении топической терапии является разработка комбинированных препаратов, например содержащих АЦВ и противовоспалительные соединения [9][10] или интерферон (IFN) [2]. Другим подходом к улучшению биодоступности АЦВ является синтез новых молекул по принципу «me-too drug». Примерами таких производных, полученных химической модификацией АЦВ, служат валацикловир и фамцикловир, которые легче проникают в клетку и превращаются в ней в целевое вещество, подавляющее размножение ВПГ [6][11]. Валацикловир, представляя собой пролекарство, трансформирующееся в организме в валин (Val, V) и АЦВ, обладает по сравнению с ним лучшей биодоступностью (55%) и более высокой скоростью всасывания в кишечнике. Тем не менее он, так же как и АЦВ, эффективен в больших дозах (до 1000–2000 мг/сут) [2][6][11]. Фамцикловир (пролекарство пенцикловира (2-амино-1,9-дигидро-9-[ 4-гидрокси-3-(гидроксиметил)бутил]-6Н-пурин-6-он)) характеризуется более высокими показателями биодоступности (до 77%) и эффективности, однако его водная растворимость ограничена быстрым образованием преципитирующих труднорастворимых моногидратов (2–3%) [2][6][11].

Перспективным в данном аспекте является новое комплексное германийорганическое соединение ацикловира (КГОСА), синтезированное в соответствии с принципом «me-too drug» и состоящее из 2 атомов германия (Ge), координированных 4 остатками лимонной кислоты, молекулы АЦВ и аминокислоты аргинина (Arg, R) [12]. Введение в состав вещества германийорганического соединения обусловлено наличием у последнего противоопухолевой, иммуноадъювантной, противовирусной, анальгезирующей, антиоксидантной, противовоспалительной, регенерирующей активностей, а также способности благоприятно влиять на деятельность различных органов и систем [13]. Известно, что Ge, являясь эссенциальным микроэлементом, необходим для нормального функционирования иммунной системы человека [13][14]. Установлено, что в составе германийорганических соединений он может оказывать воздействие на CD4+ клетки, NK-клетки, моноциты/макрофаги, В-лимфоциты, опосредованно влиять на выработку ряда цитокинов (интерлейкинов (IL) -3, -4, -13; фактора некроза опухоли (tumor necrosis factor) альфа (TNF-α); IFN-γ), а также антител [13][15].

Цель настоящей работы – изучение противовирусной активности КГОСА в отношении ВПГ на моделях ГВИ in vitro и in vivo.

Материал и методы

Вирусы. В исследовании использовали вирусы ВПГ2 (штамм «ВН») и ВПГ-1 (штамм «Кл»), полученные из Государственной коллекции вирусов ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Биологическую активность вирусов определяли стандартным методом титрования [16] в клеточной культуре Vero и рассчитывали по методу Рида и Менча [17], выражая в логарифмических единицах (lg ТЦИД₅₀/0,1 мл; ТЦИД₅₀ – тканевая цитопатическая инфекционная доза).

Культура клеток. Выделение возбудителей из образцов биологического материала, пассирование и титрование проводили на перевиваемой культуре клеток почек африканских зелёных мартышек (Chlorocebus sabaeus) Vero, полученной из коллекции культур тканей ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи». В качестве ростовой и поддерживающей сред использовали среду Игла (ПанЭко, Россия), содержащую 10 и 2% эмбриональной телячьей сыворотки (fetal bovine serum, FBS) (ПанЭко) соответственно, а также 2 мМ L-глутамина (Sigma, США) и антибиотики: 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 40 мкг/мл гентамицина (ПанЭко). Клеточную культуру в концентрации ~1,0 × 10⁵ кл/мл рассеивали в 96-луночные пластиковые культуральные планшеты (Сostar, Великобритания) и культивировали в термостате при температуре +37 ± 0,5 °С во влажной атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода (СO₂). Эксперименты проводили на суточных культурах Vero.

Препараты. КГОСА (Ge₂[C₆H₅O₇]₄[C₈H₁₁N₅O₃][C₆H₁₄N₄O₂]) представляет собой комплексное германийорганическое соединение АЦВ (рис. 1). На долю последнего в составе молекулы вещества приходится 15% (в массовом отношении).

КГОСА (Россия) – гель 3% для наружного применения. В качестве плацебо использовали основу геля КГОСА; в качестве референс-препаратов – коммерческие противовирусные препараты в соответствии с инструкциями их производителей: ацикловир (Великобритания) – лиофилизат для приготовления инфузий и крем 5% для наружного применения, в 1 г которого содержится 50 мг ацикловирa; Пенцикловир (Германия) – крем 1% для наружного применения, 1 г которого содержит 10 мг пенцикловира; АИЛ (Россия) – мазь для наружного применения, содержащая ацикловир 3% + IFNα-2b рекомбинантный человеческий 20 000 МЕ/г + лидокаин 1%.

При изучении противовирусной активности in vitro 5 мг каждого из исследуемых соединений (КГОСА, АЦВ) растворяли в 1 мл дистиллированной воды (H₂O) для получения маточных растворов с концентрацией 5 мг/мл. Данные растворы фильтровали через фильтры Swinnex (Merck Millipore, Германия) с размером пор 0,22 мкм, разливали по аликвотам и сохраняли при −70 °С. Непосредственно перед проведением исследований in vitro из маточных растворов готовили разведения тестируемых веществ на питательной среде Игла.

Животные. Исследования выполняли на самцах морских свинок (Canis porcellus) массой 250–350 г. Все особи были получены из питомника лабораторных животных «Столбовая» (филиал ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», Московская область, Россия) и содержались на стандартном рационе в условиях вивария. При выполнении лабораторных экспериментов придерживались требований правил Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, принятой в Страсбурге 18 марта 1986 г. и подтверждённой там же 1 июня 2006 г. (ETS N 123), (https://www.coe.int/t/e/legal_affairs/legal_cooperation/biological_safety_and_use_of_animals/laboratory_animals/GT123(2002)63%20E%20PART%20B%20Ferrets%20rev2.pdf).

Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23 July 2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом организации (Протокол № 2/1 от 04.02.2016).

Дизайн исследования. Изучение активности препаратов in vitro и in vivo проводили в соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета МЗ РФ [16].

Исследование in vitro включало 2 схемы: определение цитотоксического действия препаратов в интактной культуре Vero, а также оценку их противовирусной активности.

Цитотоксическое действие препаратов оценивали на культуре неинфицированных клеток Vero по влиянию на их морфологию и жизнеспособность по стандартной методике [6][18], описанной ранее [19]. Количество жизнеспособных клеток определяли методом исключения витального красителя трипанового синего (0,4% раствор). Число жизнеспособных (неокрашенных) и нежизнеспособных (окрашенных голубым цветом) клеток подсчитывали в камере Горяева. Жизнеспособность клеток в популяции (V) рассчитывали по формуле:

 V (в %) = N/N_t × 100 (1), 

где N – число жизнеспособных (неокрашенных) клеток; N_t – общее число клеток.

Значение СС₅₀ (cytotoxicity concentration) – 50% цитотоксической концентрации препарата, снижающей жизнеспособность обработанных клеток на 50% по сравнению с необработанными, рассчитывали по стандартной методике [20].

Противовирусную активность препаратов in vitro оценивали по подавлению цитопатического действия (ЦПД) вируса в культуре клеток, а также их влиянию на репликацию вируса в клеточных культурах в соответствии с методиками, разработанными M. Cotarelo и соавт. [21], J. Kruppenbacher и соавт. [22], как описано нами ранее [19].

Культуру клеток Vero культивировали согласно приведённому выше описанию, после чего среду роста удаляли, клетки отмывали раствором Хенкса и заражали тест-вирусом в дозе 100 ТЦИД₅₀. Далее культуры инкубировали в течение 1 ч в термостате при +37,0 ± 0,5 °С, супернатант удаляли, клетки повторно отмывали раствором Хенкса, добавляли к ним исследуемые препараты в разных концентрациях в составе поддерживающей среды и инкубировали в термостате при +37,0 ± 0,5 °С на протяжении 96 ч. Эксперименты сопровождали соответствующими контролями. В качестве позитивного и негативного контролей использовали соответственно инфицированные и неинфицированные клеточные культуры, к которым добавляли поддерживающую среду Игла. Контролем цитотоксичности служили неинфицированные культуры клеток, инкубируемые в присутствии тестируемых препаратов. Учёт результатов осуществляли методом световой микроскопии по общепринятому способу на 4 сут после контакта клеток с инфекционным материалом, после появления выраженного (100%) ЦПД в контрольных пробах (позитивный контроль) [19]. Для получения статистически достоверных результатов эксперименты выполняли трижды.

Эффективность препарата количественно выражали как IC50 (inhibitory concentration) – 50% ингибирующая концентрация препарата, снижающая на 50% развитие вирусиндуцированного ЦПД. IC₅₀ рассчитывали посредством регрессионного анализа дозозависимых кривых [20]. Селективный индекс (selective index, SI) препарата рассчитывали как отношение 50% цитотоксической концентрации (СС₅₀) к 50% ингибирующей концентрации (IC₅₀).

Экспериментальная герпесвирусная инфекция у морских свинок. ГГ у самцов морских свинок моделировали по стандартной методике, также описанной нами ранее [23]. Животных заражали вируссодержащей жидкостью (ВПГ-2, штамм «ВН» в дозе 100 ТЦИД₅₀), которую наносили при помощи пипетки (с последующим втиранием) на предварительно скарифицированную кожу пениса. Скарифицирование производили хирургическим ланцетом после анестезии лидокаином (1%); площадь скарификации составляла 4–7 мм². Противовирусную активность препаратов изучали по терапевтической схеме начиная через 1 или 48 ч после инфицирования. Препараты наносили методом аппликации местно на кожу пениса ежедневно 5 раз в день в течение 5 сут.

В первом эксперименте 20 инфицированных особей методом случайной выборки рандомизировали на 4 группы (по 5 морских свинок в каждой). Инфицированные животные через 3 ч после заражения получали: в первой группе – КГОСА (гель); во второй группе – препарат сравнения АЦВ (крем); в третьей группе – плацебо (основу геля КГОСА). Четвертая группа (позитивный контроль) содержала животных, инфицированных ВПГ-2 в дозе, эквивалентной таковой в опытных группах, и не получавших лечения.

Во втором опыте 30 морских свинок инфицировали ВПГ-2, после чего у них взяли смывы с урогенитальной области на предмет выделения вируса, оценки уровня его репликации и подтверждения специфичности симптомов ГГ. Затем животных рандомизировали методом случайной выборки на 6 групп (по 5 особей в каждой). Инфицированные особи спустя 48 ч после заражения получали: в первой группе – КГОСА (гель), во второй группе – препарат сравнения АЦВ (крем), в третьей – пенцикловир (крем), в четвёртой – АИЛ (мазь); в пятой группе – плацебо (основу геля КГОСА). Шестая группа (позитивный контроль) содержала животных, инфицированных ВПГ-2 в той же дозе, что и в опытных группах, но не получавших лечения. В качестве контроля токсичности использовали интактных морских свинок (седьмая и восьмая группы), которых содержали в тех же условиях, что и животных в вышеупомянутых группах, и обрабатывали гелем КГОСА или его основой (плацебо) по аналогичной схеме. Наблюдение за животными осуществляли в течение 21 сут после заражения, ежедневно оценивая динамику развития и тяжесть ГГ с использованием шкалы баллов поражения в диапазоне от 0 до 4. При этом определяли выраженность специфических поражений (везикулы, пустулы, изъязвления, эрозии, корочки), наличие отёчности, гиперемии, признаков орхита, неврологической симптоматики (менингоэнцефалит, паралич), а также регистрировали изменения в общем состоянии и поведенческих реакциях животных, как описано нами ранее [23].

Эффективность КГОСА и препаратов сравнения оценивали на момент наибольшей выраженности патологического процесса по стандартной методике [16], также описанной нами ранее [23]. Учитывали следующие параметры: интенсивность клинических проявлений (в баллах); индекс лечебного действия (ИЛД); среднюю продолжительность заболевания (СПЗ); показатели инфекционной активности вируса в биоматериалах. Величину ИЛД вычисляли по формуле:

ИЛД (в %) = (А − В)/А × 100    (2),

где А – сумма баллов в контрольной группе, В – сумма баллов в группе животных, леченных препаратом.

При изучении влияния препаратов на уровень накопления вируса у инфицированных животных на 2, 5, 7, 9 и 11 сут после заражения брали смывы с урогенитальной области с использованием 0,5 мл
стерильного физиологического фосфатного буфера (ФБР; PBS) с антибиотиками (100 ЕД/мл пенициллина и 80 мкг/мл гентамицина). Далее образцы биоматериала центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин для осаждения клеточных элементов и слизи. Супернатант отбирали и до исследования хранили при −70 ± 10,0 °С. Затем из него готовили серийные 10-кратные разведения (от 10⁻¹ до 10⁻⁷) на ФБР, которыми заражали клетки культуры Verо. На каждое 1 разведение исследуемого материала использовали 4 лунки. Инфекционную активность патогена в биоматериале определяли по общепринятым стандартам на культуре Verо в соответствии с описанным ранее протоколом [19].

Статистическая обработка данных. Результаты опытов подвергали статистической обработке общепринятыми для биологических исследований методами [20][24] с применением пакетов прикладных программ Microsoft Excel 5.0 и STATISTICA 7.0. Полученные данные выражали в виде среднего значения (M) и стандартной ошибки (Sm) и подвергали тесту на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро–Уилка. В случае нормального распределения для сравнения средних показателей применяли t-критерий Стьюдента. При ненормальном распределении результатов эксперимента обработку данных в дальнейшем осуществляли с использованием U-критерия Манна–Уитни. Различия считали достоверными при величине р-уровня значимости <0,05.

Результаты

Результаты изучения цитотоксического действия КГОСА на перевиваемой линии неинфицированных клеток Vero представлены в табл. 1. По данным световой микроскопии и теста с трипановым синим установлено, что вещество не оказывало цитотоксического действия на неинфицированные клетки. Жизнеспособность клеток Vero, выращенных на средах, содержащих КГОСА в диапазоне концентраций от 1000 до 0,1 мкг/мл, составила 91,3–99,9% и достоверно не отличалась от таковой для клеточных элементов, инкубируемых в питательной среде Игла без препарата (р > 0,05).

Значение СС₅₀ для КГОСА составило >1000 ± 110 мкг/мл по сравнению с >600 ± 95 мкг/мл для референс-препарата АЦВ.

В следующей серии экспериментов мы оценивали противовирусную активность КГОСА в отношении ГВИ в культуре Vero. Установлено, что препарат ингибирует репликацию как ВПГ-1, так и ВПГ-2. Параметры, характеризующие противовирусную активность исследуемого соединения и референс-препарата (СС₅₀, IC₅₀ и IC₉₀, а также SI), представлены в табл. 2.

Эффективность противовирусного действия КГОСА на модели генитального герпеса у морских свинок. Анализ результатов свидетельствует о том, что КГОСА (3% гель) при использовании у морских свинок по лечебной схеме (местно пятикратно в течение 5 сут) обладает активностью в отношении ВПГ-2 штамма «ВН», выраженность которой зависит от сроков применения.

Наиболее выраженные результаты получены в группе инфицированных животных, получавших КГОСА (3% гель) в ранние сроки – через 3 ч после инфицирования (табл. 3, рис. 2). Применение препарата приводило у них к значимому (приблизительно в 2,3 раза) снижению суммарного индекса выраженности симптоматики (СИВС) по сравнению с особями, не получавшими лечения или получавшими плацебо, а также к достоверному укорочению СПЗ на 6,3 сут в сравнении с группой без лечения (р < 0,001) и на 4,5 сут – с группой плацебо (р < 0,05).

Несмотря на то что КГОСА обладал более быстрым началом действия относительно ацикловира (уменьшение СИВС наблюдалось уже через 1 сут после начала применения, рис. 2), на 5 сут после инфицирования выраженность симптоматики у животных, получавших исследуемые препараты, достоверно не различалась (20 против 19 баллов у АЦВ, р > 0,05). Эффективность применения КГОСА была сопоставима с таковой для 5% крема АЦВ (ИЛД – 56,5 и 58,7% соответственно, р > 0,05).

У животных, получавших КГОСА или АЦВ, зарегистрированы уменьшение частоты и сокращение числа дней выделения вируса, а также снижение уровня его инфекционной активности в сравнении с группами контроля и плацебо. Так, на 5 сут наблюдения на фоне лечения обоими препаратами возбудитель был выделен только у 40% (2/5) животных, в то время как в группах контроля – у 100% (5/5). КГОСА, так же как и АЦВ, эффективно ингибировал репликацию ВПГ-2 у инфицированных особей, о чём свидетельствовало снижение титров вируса в урогенитальных смывах на 1,75–2,0 lg ТЦИД₅₀ (р < 0,001) по сравнению с таковыми в группах без лечения и на 1,25–1,5 lg ТЦИД₅₀ (р < 0,05) – среди получавших плацебо. На 7 сут после заражения происходило дальнейшее снижение титров вируса во всех группах, в т.ч. у 80% (4/5) контрольных животных и у 60% (3/5) – в группе плацебо до 3,0 ± 0,2 lg ТЦИД₅₀/0,1 мл и у 20% (1/5) особей, получавших КГОСА или АЦВ, – до 1,5 ± 0,1 lg ТЦИД₅₀/0,1 мл (р < 0,05 в сравнении с контролем). Позже 7 сут от момента инфицирования вирус не был выделен ни у одного животного, получавшего КГОСА или АЦВ.

Несмотря на то, что применение основы геля КГОСА 5 раз в день на протяжении 5 сут приводило к снижению СПЗ на 1,8 сут и определённому терапевтическому эффекту (ИЛД 18,47 баллов) по сравнению с аналогичными показателями у инфицированных животных, не получавших лечения, его выраженность не достигала статистической значимости (p > 0,05). Также не установлено достоверного влияния плацебо на уровень репликации вируса в урогенитальной области (р > 0,05). Данный факт свидетельствует о том, что основа геля КГОСА не обладает противовирусной активностью. В то же время её использование приводило к уменьшению выраженности воспалительных изменений у инфицированных животных, что, по-видимому, обусловлено входящими в её рецептуру компонентами.

Лечение с использованием КГОСА, начатое спустя 48 ч после заражения, у животных с выраженными симптомами ГГ (наличие везикул, гиперемии, отёка) воспроизводит клиническую ситуацию, при которой пациент с теми или иными признаками заболевания обращается за медицинской помощью. В условиях данного эксперимента у 30 инфицированных особей перед рандомизацией был проведён анализ смывов с очагов поражения, подтвердивший специфичность симптомов ГГ и позволивший разделить подопытных на равнозначные группы. Результаты отсроченного применения КГОСА и референс-препаратов у инфицированных животных представлены в табл. 3 и на рис. 3.

На фоне терапии КГОСА у животных с выраженными проявлениями ГГ отмечено замедление прогрессирования симптомов заболевания уже через 1 сут от начала медикаментозного вмешательства (рис. 3) по сравнению как с получавшими референс-препараты/плацебо, так и с особями без лечения. На 5 сут после заражения КГОСА превосходил по влиянию на выраженность симптоматики и значению ИЛД все используемые в опыте референс-препараты. Несмотря на то что величина ИЛД в случае КГОСА превышала таковую для препарата АЦВ на 8,94%, а для пенцикловира – на 7,59%, данные различия не были достоверными (р > 0,05), в то время как различия по этому параметру с комбинированным препаратом АИЛ на 13,02% оказались статистически значимыми (р < 0,05). Следует отметить, что КГОСА по влиянию на СПЗ у инфицированных особей был сопоставим с референс-препаратами. Так, 3% крем АЦВ и мазь АИЛ достоверно снижали СПЗ с 15,3 ± 1,25 сут (без лечения) в среднем до 10,4 сут, а 1% крем Пенцикловир – до 9,5 ± 1,5 сут. Значимых различий между показателями эффективности КГОСА в виде геля для наружного применения и референс-препаратов (АЦВ, пенцикловир) по влиянию на динамику инфекционного процесса и СПЗ не было выявлено. Несмотря на то что применение основы геля КГОСА приводило к определённому терапевтическому воздействию (ИЛД 14,1%) и снижению СПЗ до 14,0 ± 1,5 сут, по выраженности лечебного эффекта оно уступало как КГОСА, так и референс-препаратам.

Для оценки влияния отсроченной терапии КГОСА на частоту и продолжительность выделения ВПГ-2, а также уровень его репликации у инфицированных животных проведено изучение образцов смывов, взятых с очагов поражения, с использованием стандартной методики на культуре клеток Vero. Результаты представлены в табл. 4 и на рис. 4.

Установлено, что через 5 сут после заражения у животных в группах контроля и плацебо частота выделения вируса не изменилась по сравнению со 2-ми сут после заражения и составила 100% (рис. 4). В то же время среди подопытных, получавших КГОСА или содержащие АЦВ препараты, этот показатель снизился со 100 до 60%, а у получавших пенцикловир – до 40%. Через 7 сут после инфицирования во всех группах наблюдали дальнейшее снижение частоты выделения вируса, наиболее выраженное у особей, получавших КГОСА или референс-препараты (20% против 80 и 60% у животных в группах контроля или плацебо соответственно, p < 0,05).

Способность препарата сокращать период вирусовыделения служит одним из важных факторов контроля за распространением инфекционного агента. Исследование показало, что терапия как КГОСА, так и референс-препаратами приводила к достоверному сокращению (на 2 сут) времени выделения вируса у инфицированных животных по сравнению с не получавшими лечения/получавшими плацебо, у которых вирус обнаруживался в очагах поражения на протяжении 9 сут.

При отсроченном применении КГОСА эффективно ингибировал репликацию ВПГ-2 у инфицированных особей, о чём свидетельствуют данные, представленные в табл. 4.

Поскольку ГГ является самолимитирующейся инфекцией, то через 5 сут после заражения частота выделения вируса и его инфекционная активность снизились во всех группах. У животных, получавших КГОСА, значение последнего параметра уменьшилось по сравнению со 2-ми сут после заражения в среднем в 5 раз (с 4,25 до 3,5 lg ТЦИД₅₀/0,1 мл) и было сопоставимо с таковым у референс-препаратов АЦВ и АИЛ. Наиболее существенное снижение инфекционной активности вируса – на 1,25 lg ТЦИД₅₀ – выявлено среди особей, получавших Пенцикловир.

Через 7 сут после заражения инфекционная активность вируса у морских свинок на фоне лечения КГОСА снизилась более чем в 10 раз по сравнению с предыдущим периодом исследования и была сопоставима с определяемой в образцах смывов у инфицированных животных, получавших референс-препараты. Спустя 9 сут возбудитель был выделен из смывов с урогенитальной области только у 40% (2/5) животных в группе контроля и у 20% (1/5) – в группе плацебо с инфекционной активностью, равной в среднем 1,83 ± 0,18 lg ТЦИД₅₀/0,1 мл (табл. 4, рис. 4). Изучение образцов смывов с очагов поражений, взятых у инфицированных особей позже указанного срока, как и в первом эксперименте, не выявило наличия вируса ни у одного животного во всех группах.

Таким образом, в опытах по изоляции и титрованию вируса из образцов биоматериала у инфицированных животных с ГГ в культуре клеток Vero нами получены данные о наличии у 3% геля КГОСА противовирусной активности в отношении ВПГ-2. Эти результаты сопоставимы с интенсивностью проявлений ГГ у инфицированных моделей.

Контроль токсичности. Ежедневный осмотр неинфицированных животных, которым наносили на кожу пениса исследуемый гель КГОСА или его основу 5 раз в день в течение 5 сут, показал, что исследуемый препарат и его гелевая основа не обладали раздражающим действием и не оказывали каких-либо видимых побочных эффектов на протяжении всего периода наблюдения. Изменений в поведении и общем состоянии не выявлено ни у одного животного; ни в одном случае не зарегистрировано также наличия покраснения, отёка, зуда, явлений дерматита.

Обсуждение

В настоящее время основное направление в лечении ГВИ, в том числе и ГГ, подразумевает применение этиотропных препаратов из группы ациклических нуклеозидов [2][5][6]. Одним из наиболее используемых является АЦВ, применяемый в зависимости от клинической формы инфекции и степени её тяжести перорально, парентерально либо местно [2][5–8]. Хотя АЦВ – эффективное средство терапии ГВИ, его эмпирическое назначение не всегда оказывается успешным [2][5][6], так как не исключает рецидивирования заболевания, бессимптомного вирусовыделения, не позволяет провести эрадикацию возбудителя, устранить иммунные нарушения [2] или предотвратить формирование штаммов ВПГ с изменёнными свойствами, устойчивыми к действию препарата [2][6–8]. Среди значимых причин недостаточной эффективности терапии АЦВ следует отметить его низкую всасываемость в желудочно кишечном тракте в результате гидрофильности и невысокой пероральной биодоступности, малую растворимость в воде, сниженную трансдермальную диффузию при использовании топических форм и т.д. [2][5][7].

Одним из перспективных подходов к повышению биофармацевтических характеристик АЦВ является синтез его производных по принципу «me-too drug», которые легче проникают в клетку и превращаются в ней в целевое вещество, подавляющее размножение ВПГ, а также имеют повышенную биодоступность. Примером таких химически модифицированных пролекарств АЦВ являются валацикловир и фамцикловир [2][6][11]. В данной работе нами представлены результаты изучения активности КГОСА (синтезированного в соответствии с указанным принципом) – нового комплексного германийорганического соединения АЦВ.

Из данных литературы известно, что возбудителем ГГ может быть не только ВПГ-2, но и в 30% случаев – ВПГ1 [3][4], поэтому в настоящем исследовании мы оценивали противовирусную активность КГОСА с использованием нескольких типов ВПГ. Установлено, что вещество in vitro эффективно ингибирует вирусную репликацию ВПГ-1 и ВПГ-2, обладая сравнимой с референс-препаратом АЦВ активностью и не проявляя явной цитотоксичности в концентрации >1000 мкг/мл. Результаты, полученные in vitro в отношении ВПГ, в дальнейшем были подтверждены in vivo у самцов морских свинок на модели ГГ, вызванного ВПГ-2. Такая модель в настоящее время считается клинически релевантной ситуации у человека, поскольку имитирует различные периоды развития заболевания [16]. Нами показано, что КГОСА (гель 3%) при местном использовании по лечебной схеме обладает достоверной противовирусной активностью в отношении ВПГ-2, выраженность которой зависит от времени его применения. Наиболее значимые результаты получены при его использовании в ранние сроки – через 3 ч после заражения. У инфицированных животных препарат приводил к значимому замедлению прогрессирования симптомов ГГ и снижению СИВС, сокращению продолжительности заболевания по сравнению как с инфицированными особями без лечения, так и с получавшими плацебо (основу геля КГОСА). Установлено также, что КГОСА эффективно снижал репликацию ВПГ, уменьшал частоту и сокращал продолжительность выделения вируса из урогенитальных путей, что согласуется с исходами заболевания у морских свинок, а также может иметь значение для контроля за распространением возбудителя. По эффективности КГОСА оказался сопоставимым с препаратом сравнения АЦВ (крем 5%). Следует отметить, что полученные нами результаты согласуются с данными E. Kern и соавт. [25], показавших, что у мышей, интравагинально инфицированных ВПГ-2, лечение 1% и 5% АЦВ в виде мази или геля, начатое в ранние сроки (через 3, 6 или 24 ч) после заражения, снижало репликацию вируса, уменьшало тяжесть первичного заболевания и смертность. Описаны положительные эффекты местной терапии ГГ комбинированным препаратом АЦВ в сочетании с IFN (АИЛ) также при использовании в ранние сроки после инфицирования [2]. Кроме того, у пациентов с этой локализацией герпетического поражения эффективность терапии намного выше, если она начата в первые 24–48 ч от появления начальных признаков заболевания [2].

Лечение с использованием КГОСА, начатое через 48 ч после заражения, у животных с выраженными симптомами ГГ воспроизводило клиническую ситуацию, когда пациент с теми или иными проявлениями заболевания обращается за медицинской помощью. При отсроченном применении (через 48 ч после заражения) препарат подавлял симптомы ГГ и ингибировал репликацию ВПГ-2 у морских свинок так же эффективно, как и препараты сравнения, содержащие АЦВ (АЦВ крем, АИЛ мазь), или пролекарство пенцикловира (Пенцикловир крем). На фоне терапии КГОСА выявлены снижение уровня инфекционной активности вируса, уменьшение частоты и сокращение продолжительности его выделения, что, в свою очередь, подтверждает наличие у препарата противовирусной активности в отношении ВПГ-2.

Что же касается эффективности отсроченного лечения АЦВ, то, по данным E. Kern и соавт. [25] у мышей, интравагинально инфицированных ВПГ-2, применение 5% АЦВ в виде мази или геля спустя 48–72 ч после заражения приводило к значительному снижению вирусной нагрузки, уменьшению тяжести заболевания, но не влияло на исход ГГ в плане показателей смертности. В то же время в другой работе [26] показана выраженная активность 5% ацикловира монофосфата, 5% крема АЦВ и в меньшей степени 1% крема пенцикловира в отношении ВПГ-1 при орофациальной инфекции у мышей и АЦВ-чувствительного/АЦВ-резистентного ВПГ-2 у инфицированных морских свинок, когда лечение было начато через 24, 48 или 72 ч после заражения.

Как известно, у инфицированных ВПГ людей возможно спонтанное выделение вируса независимо от наличия активной симптоматики; таким образом, вероятность передачи возбудителя является важной проблемой для пациентов с ГГ и их партнёров, в особенности в дискордантных парах [2]. Хотя АЦВ уменьшает репликацию вируса в половых путях, он не способен полностью прекратить его выделение даже на фоне проведения супрессивной терапии [2]. Ранее В.Л. Андроновой и соавт. [27] на модели ВПГ-1-генитальной инфекции у морских свинок показано, что титры вируса в урогенитальных смывах не изменялись после лечения мазью АЦВ или мазью фосфит ациклогуанозина [27]. В настоящем исследовании мы установили, что КГОСА значимо уменьшал инфекционную активность ВПГ-2 и частоту его выделения.

Несмотря на то что в последние годы ведётся активный поиск новых лекарственных средств для лечения ГВИ, интерес к совершенствованию методик и схем применения АЦВ (в частности, топической формы), а также создание его новых модификаций и фармакологических форм не теряют своей актуальности. Мишенью для АЦВ (при местном применении) служит базальный эпидермис. Тем не менее традиционная топическая терапия препаратом имеет низкую эффективность, обусловленную отсутствием проникновения достаточного его количества в целевой участок кожи. Известно, что количество АЦВ, попадающее после применения 5% крема в базальный слой эпидермиса, составляет всего 30–50% от концентрации, достижимой приёмом внутрь [2]. Одной из причин снижения трансдермальной диффузии АЦВ является охарактеризованная ранее его низкая растворимость в воде. В настоящее время наряду с получением различных модификаций АЦВ проводятся исследования по созданию его новых топических форм (микро-, нанонизированных и т.д.), способных повысить биодоступность вещества, обеспечить его адекватную концентрацию в целевом участке кожи для эффективного подавления репликации ВПГ [29]. На основе указанной технологии разработаны комбинированные препараты, в частности содержащие АЦВ и противовоспалительные соединения – гидрокортизон (крем) [9], кетоконазол (крем, гель, бальзам для губ) [10] либо АЦВ и IFN (мазь) [2], которые применяются в основном для лечения herpes labialis. Ведутся работы по созданию трансмукозальных лекарственных форм АЦВ (гель, крем, бальзам для губ), способных обеспечить проникновение достаточного количества препарата в целевой участок кожи [10]. Рядом исследователей продемонстрировано преимущество использования гелевой основы для разработки топической формы АЦВ в связи с её наибольшей (по сравнению с кремом или бальзамом) проницаемостью через слизистую оболочку [10][27].

В исследовании K. Rajpoot [28] предлагается новый подход к повышению пенетрации АЦВ путём синтеза наноэмульсионной органогелевой системы (органогеля на основе сложных эфиров сорбита, нагруженного молекулами АЦВ), которая в эксперименте показала высокую гелеобразующую способность и эффективность по отношению к ВПГ. В креме Пенцикловир улучшение пенетрации активного вещества достигнуто введением в рецептуру пропиленгликоля и цетомакрогола 1000, которые облегчают проникновение пенцикловира через кожу, стабилизируют компоненты препарата и пролонгируют их действие в инфицированной клетке на протяжении >12 ч [2][11]. Поэтому при местном нанесении лекарственное средство быстро диффундирует через верхние слои кожи. Пенцикловир быстро переходит в пенцикловира трифосфат, обладающий фармакологической активностью и блокирующий репликацию ВПГ [2][11]. Данные, полученные в нашей работе относительно активности крема Пенцикловир в отношении ВПГ-2 при использовании через 48 ч после заражения у морских свинок, объясняются именно этим феноменом.

В геле КГОСА проблема повышения биодоступности и проникновения активного вещества решена несколько иначе, чем в приведённых выше случаях. Гель представляет собой пространственно-структурированную водную систему, содержащую 3% комплексного германийорганического соединения АЦВ. Введение в молекулу германийорганического комплекса позволило снизить концентрацию исходного вещества (АЦВ) и изменить биофармацевтические характеристики препарата. В частности, достигнуто увеличение растворимости КГОСА в воде (>25% против 0,13% у АЦВ) во всём физиологическом диапазоне рН (в отличие от низкой растворимости АЦВ при рН 4,4–4,5 и 6,8), а также в биорелевантных средах. Вспомогательные вещества, входящие в рецептуру геля (пропиленгликоль, ксилитол, гидроксиэтилцеллюлоза, натрия альгинат, полисорбат, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) и др.), обеспечивают ускорение пенетрации КГОСА через верхние слои кожи, стабильность специфической активности и надлежащую микробиологическую чистоту препарата. Включение в состав геля пропиленгликоля позволило ускорить проникновение молекул активного вещества вглубь кожи. Пропиленгликоль представляет собой двухатомный спирт; он нетоксичен, используется как гигроскопическое вещество (увлажнитель), растворитель, стабилизатор и консервант, обладает бактерицидными свойствами, что позволяет минимизировать количественный состав ингредиентов основы. Гелевая основа (не обладающая способностью ингибировать репликацию ВПГ) способствует ускорению пенетрации КГОСА в средние слои эпидермиса, потенцирует лечебное действие вещества, а также снижает выраженность экссудативно-воспалительных проявлений ГГ. Благодаря составляющим гелевой основы КГОСА при нанесении на кожу образует защитную прозрачную микроплёнку, создающую воздухопроницаемую микросреду для ускоренной регенерации повреждённых тканей, а также способствует уменьшению жжения, зуда, выраженности отёчности и других симптомов.

Заключение

Результаты исследования показывают, что комплексное германийорганическое соединение АЦВ ингибирует репликацию ВПГ-1 и ВПГ-2 в клетках культуры Vero и обладает анти-ВПГ-2-активностью на модели ГГ у морских свинок, приводящей к снижению выраженности симптоматики, тяжести и продолжительности заболевания, снижению инфекционной активности вируса и продолжительности его выделения. Полученные данные позволяют рассматривать КГОСА в качестве основы для разработки средств для лечения ГВИ, обладающих противовирусной активностью.

About the authors

L. M. Alimbarova

FSBI «National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya» of the Ministry of Health of Russia

Author for correspondence.
Email: virology@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8972-3111

Ludmila M. Alimbarova, Ph.D. (Med.), Associate Professor, Lead Researcher of the Comparative Virology Laboratory with the Russian Centre for Herpes

123098, Moscow, Russia

Россия

I. V. Ambrosov

«VDS Pharma» LLC

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7418-8171

123592, Moscow, Russia

Россия

S. K. Matelo

«VDS Pharma» LLC

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1752-042X

123592, Moscow, Russia

Россия

I. F. Barinsky

FSBI «National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya» of the Ministry of Health of Russia

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6959-9988

123098, Moscow, Russia

Россия

References

Supplementary files