Interferonogenic activity of the strain BH-3 duck hepatitis virus type I (Picornaviridae: Avihepatovirus: Avihepatovirus A)

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Introduction. Duck viral hepatitis type I (DVH-I) is a poorly studied contagious disease caused by RNA-containing duck (Anatinae) hepatitis virus type I (Picornaviridae: Avihepatovirus: Avihepatovirus A). This infection is widespread in many countries, including Russia, and causes significant damage to industrial duck breeding. The study of interferonogenic activity of its etiologic agent strains is of great importance in solving the problem of developing effective means to control the disease.
Material and methods. Strain BH-3 of duck hepatitis virus type I isolated from the liver of sick ducklings was used in the study. The strain was adapted to developing 10–12 day old duck embryos, to the cell culture of chicken and duck fibroblasts and deposited in the State Collection of Viruses of the D.I. Ivanovsky Institute of Virology of FSBI «National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya» of the Ministry of Health of Russia. Experiments were performed using the standard tissue culture method.
Results and discussion. Data on the ability of the viral strain BH-3 to induce interferon (IFN) and its sensitivity to the action of exogenous interferon in the culture of duck fibroblasts are presented. It has been shown that the interferonogenic activity of this strain of the hepatitis virus is in direct proportion to the multiplicity of infection. The maximum induction of IFN (1 : 256 CEPD50) was observed at a dose of 1.0 TCD50/cell in 72–96 hrs after inoculation of the cell culture. Exogenous IFN at a dose of 1 : 128 completely suppressed the cytopathic effect and death of duck embryos infected with hepatitis virus at a dose of 100 TCD50/cell.
Conclusion. The data obtained allow us to state that the vaccine strain BH-3 of duck hepatitis virus type I has a pronounced interferonogenic activity and sensitivity to the action of exogenous IFN. This may have implications for the development of effective therapeutic agents against DVH-I.

Full Text

Введение

Вирусный гепатит утят типа I (ВГУ-I) – малоизученная сверхострая контагиозная болезнь утят до 6-недельного возраста (латентно протекающая у взрослых особей), характеризующаяся поражением печени и высокой смертностью среди молодняка (95%) [1][2][3]. Возбудителем её является РНК-содержащий вирус гепатита уток (Anatinae) I типа (Avihepatovirus A), относящийся к семейству Picornaviridae, роду Avihepatovirus. Заболевание широко распространено во многих странах мира, в том числе в Российской Федерации. Оно серьёзно угрожает промышленному утководству, вызывая большие экономические потери [4][5][6]. Санитарным кодексом Всемирной организации по охране здоровья животных (МЭБ) ВГУ-I включён в перечень особо опасных болезней.

Для специфической профилактики этой инфекции применяются аттенуированные вирусные вакцины и инактивированные препараты. Однако в последние годы на фоне относительно стабильного благополучия по ВГУ-I постоянно возникают спорадические вспышки, что связано с нарушением ветеринарных, зоотехнических и особенно противоэпизоотических мероприятий без учёта биологических особенностей патогена.

В отечественной и зарубежной литературе имеются данные по изменчивости возбудителя заболевания как при циркуляции в естественных условиях, так и при длительных пассажах в организме восприимчивых особей [7][8][9].

Известно, что метод тканевых культур служит важным звеном в изучении биологических свойств вируса и в ходе многократных лабораторных пассажей позволяет провести оценку стабильности вакцинных штаммов инфекционного агента. Способность индуцировать in vivo или in vitro в определённых типах клеток выработку интерферона (ИФН) является генетически закреплённым признаком вируса [10][11] и наряду с другими наследственными характеристиками позволяет оценить однородность популяции аттенуированных штаммов, используемых в производстве вакцинных препаратов. В связи с этим исследования, направленные на изучение биологических (в том числе интерфероногенных) и культуральных свойств новых регистрируемых вакцинных штаммов вируса гепатита уток I типа, остаются в настоящее время актуальными.

С учётом изложенного целью работы явилось изучение интерфероногенной активности вакцинного штамма ВН-3 рассматриваемого инфекционного агента наряду с определением его чувствительности к действию экзогенного ИФН.

Материал и методы

Вирус. В экспериментах использовали вакцинный штамм ВН-3 вируса гепатита уток I типа, выделенный из печени больных утят. Он адаптирован к развивающимся 10–12-суточным утиным эмбрионам, культурам фибробластов утиных эмбрионов (ФЭУ). Данный штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (ФНИЦЭМ). Исходный титр вируса был равен 6,75 lg ТЦД50/см3 (ТЦД – тканевая цитопатическая доза).

Интерферон получали на 48-часовом монослое культуры клеток утиных эмбрионов, выращенном в пробирках и пластиковых стерильных (PS) флаконах объёмом по 2 и 220 см3 соответственно, в стационарных условиях при температуре (37,0 ± 0,5) ºС. Начальная концентрация клеточных элементов в суспензии составляла 600–650 тыс. кл/см3. Культуру заражали вакцинным штаммом вируса гепатита уток I типа в дозах 0,01; 0,1; 1,0 ТЦД50/кл. Через каждые 24 ч после инокуляции вируса отбирали пробы культуральной жидкости одновременно с контрольным образцом, после чего центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин и термоинактивировали на протяжении 60 мин при температуре 60 ºC. Обработанные таким образом пробы использовали в качестве готовых препаратов ИФН. Полноту инактивации возбудителя проверяли заражением культуры ФЭУ неразведённым препаратом ИФН.

Определение титра интерферона выполняли в указанной культуре методом двукратных разведений на питательной среде Игла МЕМ при температуре (37,5 ± 0,5) ºС. ИФН в каждом из разведений в объёме 1,0 см3 вносили в 4 пробирки с культурой клеток, предварительно удалив ростовую среду. Контролем служила нормальная культуральная жидкость. Через 24 ч в опытные и контрольные пробирки с клеточной культурой вносили по 0,2 см3 (100 ТЦД50) индикаторного вируса везикулярного стоматита (VSV, vesicular stomatitis virus). Активность ИФН учитывали спустя 48 ч после внесения вируса-индикатора на фоне полной дегенерации контрольных культур. Наблюдение вели с использованием инвертируемого микроскопа ЛОМО XC0928 («ЛОМО», Россия) при увеличениях от ×40 до ×400. Ингибирующее действие ИФН характеризовали по подавлению вирусного цитопатогенного действия (ЦПД) в опытных и контрольных пробирочных культурах с отчётливо выраженной клеточной дегенерацией.

Титром ИФН считали последнее разведение, ингибирующее ЦПД индикаторного вируса в 50% клеточных культур. Чувствительность вакцинного штамма ВН-3 вируса гепатита уток I типа к экзогенному ИФН определяли по ингибирующему действию последнего в отношении данного штамма в культуре ФЭУ и 10–12-суточных утиных эмбрионах.

Полученные результаты подвергали статистическому анализу с применением критерия Стьюдента, считая их достоверными при p <0,05 [12]. Графическое построение данных выполняли при помощи программного обеспечения Microsoft Office Excel.

Результаты и обсуждение

Для проведения инокуляции штамма ВН-3 вируса гепатита уток I типа в культуру утиных фибробластов вируссодержащий материал был разведён до значений 0,01; 0,1; 1,0 ТЦД50/кл. Через каждые 24 ч эксперимента из PS флаконов с испытуемым штаммом брали по 3,0 см3 культуральной жидкости, которую замещали равным объёмом поддерживающей среды (Игла МЕМ + питательная среда 199), после чего определяли титр ИФН.

Результаты оценки способности вакцинного штамма ВН-3 к индукции ИФН представлены в таблице. Как можно видеть, выработка этого вещества зависит от множественности заражения вирусного штамма-индуцента и времени от момента инокуляции культуры. При этом имеющаяся зависимость носит прямой корреляционный характер. Через 24 ч после инокуляции при множественности заражения 0,01 и 0,1 ТЦД50/кл продукция ИФН отсутствовала, а в дозе 1,0 ТЦД50/кл его титр составил 1 : 8 ЦЭПД50/см3 (ЦЭПД50 – средняя доза вещества, подавляющая цитопатический эффект вируса). С увеличением временно́го промежутка показатель концентрации ИФН возрастал, находясь спустя 48 ч в диапазоне от 1 : 16 до 1 : 64 ЦЭПД50/см3.

Интерфероногенная активность штамма ВН-3 вируса гепатита уток I типа
Interferonogenic activity of the duck hepatitis virus type I strain BH-3


Примечание. ЦЭПД50 – средняя доза интерферона, подавляющая вирусный цитопатический эффект.
Note. CEPD50 is the average dose of interf eron that suppresses the viral cytopathic effect.

Через 72 ч после инфицирования индукция ИФН была максимальной; в зависимости от дозы внесённого вируса (0,01; 0,1; 1,0 ТЦД50/кл) титр вещества был равен 1 : 64; 1 : 128 и 1 : 256 ЦЭПД50/см3 соответственно, что находится в рамках латентной фазы вирусного ЦПД. Активность выработки ИФН спустя 96 ч культивирования не изменялась, а затем по мере дегенерации и гибели клеток монослоя его образование уменьшалось. В ходе исследований показано, что наибольшее количество ИФН продуцируется через 72–96 ч от момента заражения клеточной культуры, а интерфероногенная активность штамма ВН-3 вируса гепатита уток I типа находится в прямой зависимости от дозы возбудителя (см. рисунок).


Интерфероногенная активность вируса гепатита уток I типа в культуре утиных фибробластов в зависимости от его множественности и времени после инфицирования: а – 48 ч; б – 120 ч; в – 72–96 ч.
Примечание. ЦЭПД50 – средняя доза интерферона, подавляющая вирусный цитопатический эффект.

Interferonogenic activity of duck hepatitis virus type I in the culture of duck fi broblasts depending on the virus plurality and the time after infection: a – 48 hrs; b – 120 hrs; c – 72–96 hrs.
Note. CEPD50 is the average dose of interferon that suppresses the viral cytopathic effect.

Установленный характер процесса образования ИФН в культуре утиных фибробластов совпадает с полученными ранее данными относительно продукции максимального его количества через 48–72 ч после инокуляции клеток другими штаммами вируса гепатита уток [13].

При определении чувствительности штамма ВН3 к ингибирующему действию экзогенного ИФН в монослой культуры утиных фибробластов вещество вносили в дозе 1 : 128 ЦЭПД50/см3 и после 24-часовой экспозиции добавляли вирус (100 ТЦД50). Результаты экспериментов показали, что экзогенный ИФН в указанно м титре полностью подавлял цитопатический эффект внесённой дозы возбудителя с предотвращением гибели утиных эмбрионов. Это, в свою очередь, свидетельствует о чувствительности вакцинного штамма ВН-3 вируса гепатита уток I типа к ингибирующему действию экзогенного ИФН.

Заключение

На основании результатов проведённых исследований можно заключить, что вакцинный штамм ВН-3 вируса гепатита уток I типа обладает выраженной интерфероногенной активностью в культуре утиных фибробластов и высокой чувствительностью к действию экзогенного ИФН. Установлена прямая зависимость степени индуцированного вирусным штаммом накопления вещества от множественности инфицирования клеток и времени после инокуляции культуры. Итоги экспериментов могут иметь значение для работ по созданию эффективных терапевтических препаратов против ВГУ-I.

×

About the authors

N. V. Nikitina

FSBRI «All-Russian Research Veterinary Institute of Poultry Science» – Branch of the FSBRI FSC «All-Russian Research and Technological Poultry Institute» of Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: vnivip.nikitina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7500-3172

Nikitina Nina Vasil’evna, Ph.D. (Biol.), Associate Professor, Leading Researcher of the Department of Virology and Tumor Diseases of Poultry named after R.N. Korovin

198412, St. Petersburg – Lomonosov

Russian Federation

I. K. Leonov

FSBRI «All-Russian Research Veterinary Institute of Poultry Science» – Branch of the FSBRI FSC «All-Russian Research and Technological Poultry Institute» of Russian Academy of Sciences

Email: leonov_ila@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5342-1912

Leonov Il’ya Konstantinovich, Ph.D. (Vet.), Senior Researcher of the Department of Virology and Tumor Diseases of Poultry named after R.N. Korovin

198412, St. Petersburg – Lomonosov

Russian Federation

L. I. Yavdoshak

FSBRI «All-Russian Research Veterinary Institute of Poultry Science» – Branch of the FSBRI FSC «All-Russian Research and Technological Poultry Institute» of Russian Academy of Sciences

Email: yavdoshak2014@yandex.ru

Yavdoshak Larisa Ivanovna, Senior Researcher of the Department of Virology and Tumor Diseases of Poultry named after R.N. Korovin

198412, St. Petersburg – Lomonosov

Russian Federation

References

  1. Gu C.Q., Xie C.Q., Hu X.Y., Zhang W.P., Bi D.R., Cheng G.F. Cytokine gene expression in the liver of ducklings infected with duck hepatitis virus – 1JX strain. Poult. Science. 2012; 91(3): 583–91. https://doi.org/10.3382/ps.2011-01743.
  2. Князев В.П. Вирусный гепатит утят (уток). В кн.: Князев В.П. Болезни водоплавающих птиц. Владимир; 2013: 70–87.
  3. Mao S., Wang M., Ou X., Sun D., Cheng A., Zhu D., et al. Virologic and immunologic characteristics in mature ducks with acute duck hepatitis A virus 1 infection. Front. Immunol. 2017; 8: 1574. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01574.
  4. Li J., Bi Y., Chen C., Yang L., Ding C., Liu W. Genetic characterization of duck hepatitis A viruses isolated in China. Virus Res. 2013; 178(2): 211–6. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2013.10.007.
  5. Erfan A.M., Selim A.A., Moursi M.K., Nasef S.A., Abdelwhab E.M. Epidemiology and molecular characterisation of duck hepatitis A virus from different duck breeds in Egypt. Vet. Microbiol. 2015; 177(3–4): 347–52. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2015.03.020.
  6. Bayoumie H.A.A., Abd-El Samie L.K. Molecular characterization of a duck virus hepatitis isolated from Sharkia governorate. Assiut. Vet. Med. J. 2015; 61(147): 56–65.
  7. Норкина С.Н., Гребенникова Т.В., Плотников Н.А., Алипер Т.И. Вирусный гепатит утят. В кн.: Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. Москва: МИА; 2013; 1197–8.
  8. Chen L.L., Xu Q., Zhang R.H., Yang L., Li J.X., Xie Z.J., et al. Improved duplex RP-PCR assay for differential diagnosis of mixed infection of duck hepatitis A virus type 1 and type 3 in ducklings. J. Virol. Methods. 2013; 192(1–2): 12–7. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2013.04.012.
  9. Wen X.J., Cheng A.C., Wang M.S., Jia R.Y., Zhu D.K., Chen S., et al. Detection, differentiation, and VP1 sequencing of duck hepatitis A virus type 1 and type 3 by a 1- step duplex reverse-transcription PCR assay. Poult. Sci. 2014; 93(9): 2184–92. https://doi.org/10.3382/ps.2014-04024.
  10. Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н. Использование индукторов интерферона при вирусных инфекциях. Вопросы вирусологии. 2015; 60(2): 5–10.
  11. Полосков В.В., Ершов Ф.И. Активаторы синтеза эндогенных интерферонов (обзор). Разработка и регистрация лекарственных средств. 2017; 1(18): 188–92.
  12. Белоусова Р.В., Троценко Н.И., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. Москва: Колос; 2013.
  13. Бубашко О.А. Маркерные свойства штамма вирусного гепатита утят КМИЭВ-16. Эпизоотология, иммунология, фармакология и санитария. 2005; (1): 46–9.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2021 Nikitina N.V., Leonov I.K., Yavdoshak L.I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies