Интерфероногенная активность штамма ВН-3 вируса гепатита уток I типа (Picornaviridae: Avihepatovirus: Avihepatovirus A)

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Вирусный гепатит утят типа I (ВГУ-I) – малоизученное контагиозное заболевание, возбудителем которого является РНК-содержащий вирус гепатита уток (Anatinae) I типа (Picornaviridae: Avihepatovirus: Avihepatovirus A). Болезнь широко распространена во многих странах, включая Россию, и наносит значительный ущерб промышленному утководству. В решении проблемы разработки эффективных средств для борьбы с этой инфекцией среди прочего большое значение имеет изучение интерфероногенной активности штаммов её возбудителя.
Материал и методы. В исследованиях использован штамм ВН-3 вируса гепатита уток I типа, выделенный из печени больных утят. Он адаптирован к развивающимся 10–12-суточным утиным эмбрионам, культурам куриных и утиных фибробластов. Данный штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (ФНИЦЭМ). Эксперименты проводились с применением стандартного метода тканевых культур.
Результаты и обсуждение. Представлены данные относительно способности вакцинного штамма ВН-3 к индукции интерферона (ИФН) и его чувствительности к действию экзогенного ИФН в культуре утиных фибробластов. Показано, что интерфероногенная активность штамма находится в прямой зависимости от множественности заражения. Максимальный показатель индукции (1 : 256 ЦЭПД50) отмечен при внесении вируса в дозе 1,0 ТЦД50/кл через 72–96 ч после инокуляции культуры клеток. Экзогенный ИФН в титре 1 : 128 полностью подавлял цитопатический эффект возбудителя и предотвращал гибель утиных эмбрионов при инфицировании дозой, равной 100 ТЦД50/кл.
Заключение. Полученные результаты позволяют утверждать, что вакцинный штамм ВН-3 вируса гепатита уток I типа обладает выраженной интерфероногенной активностью и чувствительностью к действию экзогенного ИФН. Это может иметь значение для работ по созданию эффективных терапевтических препаратов против ВГУ-I.

Полный текст

Введение

Вирусный гепатит утят типа I (ВГУ-I) – малоизученная сверхострая контагиозная болезнь утят до 6-недельного возраста (латентно протекающая у взрослых особей), характеризующаяся поражением печени и высокой смертностью среди молодняка (95%) [1][2][3]. Возбудителем её является РНК-содержащий вирус гепатита уток (Anatinae) I типа (Avihepatovirus A), относящийся к семейству Picornaviridae, роду Avihepatovirus. Заболевание широко распространено во многих странах мира, в том числе в Российской Федерации. Оно серьёзно угрожает промышленному утководству, вызывая большие экономические потери [4][5][6]. Санитарным кодексом Всемирной организации по охране здоровья животных (МЭБ) ВГУ-I включён в перечень особо опасных болезней.

Для специфической профилактики этой инфекции применяются аттенуированные вирусные вакцины и инактивированные препараты. Однако в последние годы на фоне относительно стабильного благополучия по ВГУ-I постоянно возникают спорадические вспышки, что связано с нарушением ветеринарных, зоотехнических и особенно противоэпизоотических мероприятий без учёта биологических особенностей патогена.

В отечественной и зарубежной литературе имеются данные по изменчивости возбудителя заболевания как при циркуляции в естественных условиях, так и при длительных пассажах в организме восприимчивых особей [7][8][9].

Известно, что метод тканевых культур служит важным звеном в изучении биологических свойств вируса и в ходе многократных лабораторных пассажей позволяет провести оценку стабильности вакцинных штаммов инфекционного агента. Способность индуцировать in vivo или in vitro в определённых типах клеток выработку интерферона (ИФН) является генетически закреплённым признаком вируса [10][11] и наряду с другими наследственными характеристиками позволяет оценить однородность популяции аттенуированных штаммов, используемых в производстве вакцинных препаратов. В связи с этим исследования, направленные на изучение биологических (в том числе интерфероногенных) и культуральных свойств новых регистрируемых вакцинных штаммов вируса гепатита уток I типа, остаются в настоящее время актуальными.

С учётом изложенного целью работы явилось изучение интерфероногенной активности вакцинного штамма ВН-3 рассматриваемого инфекционного агента наряду с определением его чувствительности к действию экзогенного ИФН.

Материал и методы

Вирус. В экспериментах использовали вакцинный штамм ВН-3 вируса гепатита уток I типа, выделенный из печени больных утят. Он адаптирован к развивающимся 10–12-суточным утиным эмбрионам, культурам фибробластов утиных эмбрионов (ФЭУ). Данный штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (ФНИЦЭМ). Исходный титр вируса был равен 6,75 lg ТЦД50/см3 (ТЦД – тканевая цитопатическая доза).

Интерферон получали на 48-часовом монослое культуры клеток утиных эмбрионов, выращенном в пробирках и пластиковых стерильных (PS) флаконах объёмом по 2 и 220 см3 соответственно, в стационарных условиях при температуре (37,0 ± 0,5) ºС. Начальная концентрация клеточных элементов в суспензии составляла 600–650 тыс. кл/см3. Культуру заражали вакцинным штаммом вируса гепатита уток I типа в дозах 0,01; 0,1; 1,0 ТЦД50/кл. Через каждые 24 ч после инокуляции вируса отбирали пробы культуральной жидкости одновременно с контрольным образцом, после чего центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин и термоинактивировали на протяжении 60 мин при температуре 60 ºC. Обработанные таким образом пробы использовали в качестве готовых препаратов ИФН. Полноту инактивации возбудителя проверяли заражением культуры ФЭУ неразведённым препаратом ИФН.

Определение титра интерферона выполняли в указанной культуре методом двукратных разведений на питательной среде Игла МЕМ при температуре (37,5 ± 0,5) ºС. ИФН в каждом из разведений в объёме 1,0 см3 вносили в 4 пробирки с культурой клеток, предварительно удалив ростовую среду. Контролем служила нормальная культуральная жидкость. Через 24 ч в опытные и контрольные пробирки с клеточной культурой вносили по 0,2 см3 (100 ТЦД50) индикаторного вируса везикулярного стоматита (VSV, vesicular stomatitis virus). Активность ИФН учитывали спустя 48 ч после внесения вируса-индикатора на фоне полной дегенерации контрольных культур. Наблюдение вели с использованием инвертируемого микроскопа ЛОМО XC0928 («ЛОМО», Россия) при увеличениях от ×40 до ×400. Ингибирующее действие ИФН характеризовали по подавлению вирусного цитопатогенного действия (ЦПД) в опытных и контрольных пробирочных культурах с отчётливо выраженной клеточной дегенерацией.

Титром ИФН считали последнее разведение, ингибирующее ЦПД индикаторного вируса в 50% клеточных культур. Чувствительность вакцинного штамма ВН-3 вируса гепатита уток I типа к экзогенному ИФН определяли по ингибирующему действию последнего в отношении данного штамма в культуре ФЭУ и 10–12-суточных утиных эмбрионах.

Полученные результаты подвергали статистическому анализу с применением критерия Стьюдента, считая их достоверными при p <0,05 [12]. Графическое построение данных выполняли при помощи программного обеспечения Microsoft Office Excel.

Результаты и обсуждение

Для проведения инокуляции штамма ВН-3 вируса гепатита уток I типа в культуру утиных фибробластов вируссодержащий материал был разведён до значений 0,01; 0,1; 1,0 ТЦД50/кл. Через каждые 24 ч эксперимента из PS флаконов с испытуемым штаммом брали по 3,0 см3 культуральной жидкости, которую замещали равным объёмом поддерживающей среды (Игла МЕМ + питательная среда 199), после чего определяли титр ИФН.

Результаты оценки способности вакцинного штамма ВН-3 к индукции ИФН представлены в таблице. Как можно видеть, выработка этого вещества зависит от множественности заражения вирусного штамма-индуцента и времени от момента инокуляции культуры. При этом имеющаяся зависимость носит прямой корреляционный характер. Через 24 ч после инокуляции при множественности заражения 0,01 и 0,1 ТЦД50/кл продукция ИФН отсутствовала, а в дозе 1,0 ТЦД50/кл его титр составил 1 : 8 ЦЭПД50/см3 (ЦЭПД50 – средняя доза вещества, подавляющая цитопатический эффект вируса). С увеличением временно́го промежутка показатель концентрации ИФН возрастал, находясь спустя 48 ч в диапазоне от 1 : 16 до 1 : 64 ЦЭПД50/см3.

Интерфероногенная активность штамма ВН-3 вируса гепатита уток I типа
Interferonogenic activity of the duck hepatitis virus type I strain BH-3


Примечание. ЦЭПД50 – средняя доза интерферона, подавляющая вирусный цитопатический эффект.
Note. CEPD50 is the average dose of interf eron that suppresses the viral cytopathic effect.

Через 72 ч после инфицирования индукция ИФН была максимальной; в зависимости от дозы внесённого вируса (0,01; 0,1; 1,0 ТЦД50/кл) титр вещества был равен 1 : 64; 1 : 128 и 1 : 256 ЦЭПД50/см3 соответственно, что находится в рамках латентной фазы вирусного ЦПД. Активность выработки ИФН спустя 96 ч культивирования не изменялась, а затем по мере дегенерации и гибели клеток монослоя его образование уменьшалось. В ходе исследований показано, что наибольшее количество ИФН продуцируется через 72–96 ч от момента заражения клеточной культуры, а интерфероногенная активность штамма ВН-3 вируса гепатита уток I типа находится в прямой зависимости от дозы возбудителя (см. рисунок).


Интерфероногенная активность вируса гепатита уток I типа в культуре утиных фибробластов в зависимости от его множественности и времени после инфицирования: а – 48 ч; б – 120 ч; в – 72–96 ч.
Примечание. ЦЭПД50 – средняя доза интерферона, подавляющая вирусный цитопатический эффект.

Interferonogenic activity of duck hepatitis virus type I in the culture of duck fi broblasts depending on the virus plurality and the time after infection: a – 48 hrs; b – 120 hrs; c – 72–96 hrs.
Note. CEPD50 is the average dose of interferon that suppresses the viral cytopathic effect.

Установленный характер процесса образования ИФН в культуре утиных фибробластов совпадает с полученными ранее данными относительно продукции максимального его количества через 48–72 ч после инокуляции клеток другими штаммами вируса гепатита уток [13].

При определении чувствительности штамма ВН3 к ингибирующему действию экзогенного ИФН в монослой культуры утиных фибробластов вещество вносили в дозе 1 : 128 ЦЭПД50/см3 и после 24-часовой экспозиции добавляли вирус (100 ТЦД50). Результаты экспериментов показали, что экзогенный ИФН в указанно м титре полностью подавлял цитопатический эффект внесённой дозы возбудителя с предотвращением гибели утиных эмбрионов. Это, в свою очередь, свидетельствует о чувствительности вакцинного штамма ВН-3 вируса гепатита уток I типа к ингибирующему действию экзогенного ИФН.

Заключение

На основании результатов проведённых исследований можно заключить, что вакцинный штамм ВН-3 вируса гепатита уток I типа обладает выраженной интерфероногенной активностью в культуре утиных фибробластов и высокой чувствительностью к действию экзогенного ИФН. Установлена прямая зависимость степени индуцированного вирусным штаммом накопления вещества от множественности инфицирования клеток и времени после инокуляции культуры. Итоги экспериментов могут иметь значение для работ по созданию эффективных терапевтических препаратов против ВГУ-I.

×

Об авторах

Н. В. Никитина

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства» – филиал ФГБНУ ФНЦ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: vnivip.nikitina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7500-3172

Никитина Нина Васильевна, канд. биол. наук, доцент, ведущий научный сотрудник отдела вирусологии и опухолевых болезней птиц им. Р.Н. Коровина

198412, Санкт-Петербург – Ломоносов

Россия

И. К. Леонов

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства» – филиал ФГБНУ ФНЦ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» Российской академии наук

Email: leonov_ila@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5342-1912

Леонов Илья Константинович, канд. вет. наук, старший научный сотрудник отдела вирусологии и опухолевых болезней птиц им. Р.Н. Коровина

198412, Санкт-Петербург – Ломоносов

Россия

Л. И. Явдошак

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства» – филиал ФГБНУ ФНЦ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» Российской академии наук

Email: yavdoshak2014@yandex.ru

Явдошак Лариса Ивановна, старший научный сотрудник отдела вирусологии и опухолевых болезней птиц им. Р.Н. Коровина

198412, Санкт-Петербург – Ломоносов

Россия

Список литературы

  1. Gu C.Q., Xie C.Q., Hu X.Y., Zhang W.P., Bi D.R., Cheng G.F. Cytokine gene expression in the liver of ducklings infected with duck hepatitis virus – 1JX strain. Poult. Science. 2012; 91(3): 583–91. https://doi.org/10.3382/ps.2011-01743.
  2. Князев В.П. Вирусный гепатит утят (уток). В кн.: Князев В.П. Болезни водоплавающих птиц. Владимир; 2013: 70–87.
  3. Mao S., Wang M., Ou X., Sun D., Cheng A., Zhu D., et al. Virologic and immunologic characteristics in mature ducks with acute duck hepatitis A virus 1 infection. Front. Immunol. 2017; 8: 1574. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01574.
  4. Li J., Bi Y., Chen C., Yang L., Ding C., Liu W. Genetic characterization of duck hepatitis A viruses isolated in China. Virus Res. 2013; 178(2): 211–6. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2013.10.007.
  5. Erfan A.M., Selim A.A., Moursi M.K., Nasef S.A., Abdelwhab E.M. Epidemiology and molecular characterisation of duck hepatitis A virus from different duck breeds in Egypt. Vet. Microbiol. 2015; 177(3–4): 347–52. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2015.03.020.
  6. Bayoumie H.A.A., Abd-El Samie L.K. Molecular characterization of a duck virus hepatitis isolated from Sharkia governorate. Assiut. Vet. Med. J. 2015; 61(147): 56–65.
  7. Норкина С.Н., Гребенникова Т.В., Плотников Н.А., Алипер Т.И. Вирусный гепатит утят. В кн.: Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. Москва: МИА; 2013; 1197–8.
  8. Chen L.L., Xu Q., Zhang R.H., Yang L., Li J.X., Xie Z.J., et al. Improved duplex RP-PCR assay for differential diagnosis of mixed infection of duck hepatitis A virus type 1 and type 3 in ducklings. J. Virol. Methods. 2013; 192(1–2): 12–7. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2013.04.012.
  9. Wen X.J., Cheng A.C., Wang M.S., Jia R.Y., Zhu D.K., Chen S., et al. Detection, differentiation, and VP1 sequencing of duck hepatitis A virus type 1 and type 3 by a 1- step duplex reverse-transcription PCR assay. Poult. Sci. 2014; 93(9): 2184–92. https://doi.org/10.3382/ps.2014-04024.
  10. Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н. Использование индукторов интерферона при вирусных инфекциях. Вопросы вирусологии. 2015; 60(2): 5–10.
  11. Полосков В.В., Ершов Ф.И. Активаторы синтеза эндогенных интерферонов (обзор). Разработка и регистрация лекарственных средств. 2017; 1(18): 188–92.
  12. Белоусова Р.В., Троценко Н.И., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. Москва: Колос; 2013.
  13. Бубашко О.А. Маркерные свойства штамма вирусного гепатита утят КМИЭВ-16. Эпизоотология, иммунология, фармакология и санитария. 2005; (1): 46–9.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Никитина Н.В., Леонов И.К., Явдошак Л.И., 2021

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах