Line immunoassay for detection of IgG antibodies to hepatitis E virus (Hepeviridae, Orthohepevirus, Orthohepevirus A)

Full Text

Введение

Гепатит Е (ГЕ) представляет глобальную проблему для здравоохранения, поэтому очень важно совершенствование его лабораторной диагностики. Серологическим маркером острого или недавно перенесённого ГЕ служат IgM антитела к вирусу ГЕ (ВГЕ), которые появляются в крови заболевших в течение первых 2 нед желтушного периода и могут обнаруживаться в течение 5 мес после начала заболевания [1]. Специфические IgG-антитела, которые в острой фазе ГЕ часто появляются одновременно или вскоре после IgM-антител и могут длительно персистировать в крови пациентов [2], часто рассматриваются как индикатор перенесённой инфекции и основной показатель серопревалентности ВГЕ. Тем не менее увеличение титра IgG-антител к ВГЕ более чем в 4 раза трактуется как показатель острого ГЕ. Например, Европейская ассоциация по изучению печени (European Association for the Study of the Liver) рекомендует для установления диагноза острого ГЕ учитывать одновременное присутствие в анализируемых пробах РНК ВГЕ и специфических IgM- и/или IgG-антител, а также повышение титров IgG-антител на фоне присутствия IgM-антител [3]. Сравнительные испытания коммерческих тест-систем разных производителей, проведённые на идентичных образцах сывороток крови больных острым ГЕ, показали, что по диагностической эффективности эти тесты различаются в широких пределах. Например, 4 набора для определения IgG-антител к ВГЕ различались по чувствительности в диапазоне от 40 до 1000 МЕ/мл, а получаемые с их применением результаты совпадали в 56–87% случаев [4]. Метаанализ результатов 73 исследований серопревалентности ВГЕ в Европе, проведённых с 2003 по 2015 г., показал, что данные сероэпидемиологических исследований решающим образом зависят от чувствительности применяемых тестов. Доля серопозитивной прослойки среди населения обследованных территорий, определённая с помощью пяти коммерческих тест-систем, варьировала в широком диапазоне: 17% (Wantai, Китай), 10% (Mikrogen, Германия), 7% (MP Diagnostics, США), 4% (DiaPro, Италия), 2% (Abbott, США). Среди причин выявленных несоответствий рассматриваются вариабельная кинетика синтеза антител к индивидуальным вирусным белкам при ГЕ, неполная гомология антигенной структуры у белков ВГЕ разных генотипов, приводящая к отличиям в составе эпитопов рекомбинантных белков, применяемых в тестах [5].

Для уточнения диагноза ГЕ рекомендуется комбинированное применение тест-систем различных форматов. Исключить ложноположительные результаты в инфекционной серодиагностике позволяет повторное исследование положительных образцов в подтверждающих тестах, один из них – линейный иммуноанализ (ЛИА), или лайн-блот, основанный на применении рекомбинантных вирусспецифических антигенов. Используемый при этом метод является вариантом мультиплексного анализа, позволяющим тестировать исследуемый образец в реакции одновременно с несколькими антигенами. Наряду с высокой чувствительностью и специфичностью достоинством метода является возможность его применения в отсутствие оборудования для проведения иммуноферментного анализа (ИФА). На сегодняшний день немецкая компания Mikrogen GmbH – единственный в мире производитель тест-системы для выявления антител к ВГЕ методом ЛИА [6].

Рекомбинантные антигены, на основе которых созданы коммерческие отечественные и зарубежные тест-системы для серодиагностики ГЕ, содержат различные фрагменты белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го, 2-го или 3-го генотипов. Известно, что для белков ВГЕ разных генотипов характерны отличия в антигенных свойствах [7]. В связи с этим для разработки диагностических тестов ранее были получены в системе экспрессии Escherichia coli рекомбинантные антигены, содержащие С-концевые фрагменты (406–660 а.о.) капсидных белков ORF2 и полноразмерные аналоги белков ORF3 штаммов ВГЕ 1-го и 3-го генотипов, циркулирующих на территории стран постсоветского пространства [8].

Цель данной работы – разработка тест-системы для выявления IgG-антител к ВГЕ в сыворотке крови человека методом ЛИА с применением рекомбинантных антигенов ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов.

Материал и методы

В работе использованы иммунореагенты: рекомбинантные антигены ORF2 и ORF3 1-го и 3-го генотипов [9][10][11][12], β-галактозидаза, выделенная из клеток штамма E coli PLT90, трансформированных плазмидой pEL5a без вставки фрагмента ДНК ВГЕ, из коллекции ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова [13][14]; полученные в лаборатории клонирования вирусных геномов ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова методом периодатного окисления пероксидазные конъюгаты моноклональных антител (МАТ) мыши к Fab-фрагменту IgG человека (ООО «Сорбент-Сервис», Россия) – МАТ2А11-ПХ, МАТ к Fc-фрагменту IgG человека (ООО «Сорбент-Сервис», Россия) – МАТСН1-ПХ, поликлональных кроличьих антител к IgG человека – ПАТIgG-ПХ.

Для отработки условий анализа и испытаний тест-системы «Блот-ВГЕ» использовали Международный стандарт Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) «Anti-hepatitis E Serum, Human» 95/584 NIBSC, контрольную панель сывороток (n=8), содержащих и не содержащих анти-HEV-G (кат. № Е-331, НПО «Диагностические системы», Россия), образцы (n=239) сывороток крови здоровых лиц и больных гепатитами А, В, С и Е и другими инфекционными патологиями печени, предоставленные кафедрой инфекционных болезней Белорусского государственного медицинского университета, НПО «Профилактическая медицина» Минздрава Кыргызской Республики, клинико диагностическим отделением ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова (Россия). Образцы хранили при температуре -20 °С.

Антитела IgG к ВГЕ в образцах сывороток крови выявляли с помощью иммуноферментной тест-системы «ДС-ИФА-Анти-HEV-G» (РУ № ФС 01262006/5408- 06, НПО «Диагностические системы», Россия). Каждый образец исследовали в повторах. Для каждого положительного образца рассчитывали коэффициент позитивности (КП) по формуле:

КП_обр. = ОП_обр./ОП_крит.,

где ОП_обр. – оптическая плотность образца, ОП_крит. – её пороговое значение, рассчитанное в соответствии с инструкциями производителя. Серологические маркеры инфицирования вирусами гепатитов А (ВГА), В (ВГВ), С (ВГС) и возбудителями инфекционной патологии печени иной вирусной этиологии определяли с помощью коммерческих иммуноферментных тест-систем «ДС-ИФА-Анти-HAV-G-РЕКОМБ» (кат. № А-151, ООО «НПО «Диагностические системы», Россия), БЛОТ ВИЧ ½+0 (РУ № ФСР 2009/04019, АО «Биосервис», Россия) и тест-систем производства АО «Вектор-Бест», Россия: «Вектогеп В-HBs-антиген» (РУ № РЗН 2015/2887,), «ГепаБест анти-HBcIgG» (РУ РЗН 2017/5606), «Бест анти-ВГС-авто» (РУ № РЗН 2015/2674), «Бест анти-ВГС-подтверждающий тест» (РУ № РЗН 2015/2895), «ВектоЦМВ-IgG-авидность» (РУ № РЗН 2014/2219), «ВектоВЭБ-EA-IgG» (РУ № РЗН 2013/1274), «ВектоВЭБ-NA-IgG» (РУ № РЗН 2013/1273). В качестве тест-системы сравнения использовали набор реагентов «RecomLine HEV IgG/ IgM» (РУ № ФСЗ 2012/13543 кат. № 5072, Mikrogen Diagnostik GmbH, Германия). Анализ выполняли в соответствии с инструкциями производителей соответствующих тест-систем.

Для проведения ЛИА на поверхности иммуносорбента (полосок нитроцеллюлозной мембраны) в виде поперечных линий сорбировали очищенные рекомбинантные антигены ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го (ORF2(1) и ORF3(1)) и 3-го (ORF2(3) и ORF3(3)) генотипов (линии № 1–4 на рис. 1) и контрольные антигены. Контрольным антигеном специфичности реакции (К_АГ, линия № 5) был синтезированный в E. coli рекомбинантный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента β-галактозидазы E. coli и не содержащий фрагментов белков ВГЕ. Для контроля правильности проведения реакции (К_Р, линия № 6) использовали иммунную сыворотку против IgG человека. Иммобилизацию антигенов проводили, выдерживая растворы с их разведениями в течение 16 ч при температуре 9 ºС в канальцах прибора для пассивной сорбции белков на поверхности мембран. В качестве положительного контрольного образца К⁺ использовали сыворотку крови человека, содержащую IgG-антитела к белкам ВГЕ и не содержащую антител к ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВГС, антигена р24 ВИЧ-1 и HBsAg. Отрицательным контрольным образцом К- была сыворотка крови человека, не содержащая антител к белкам ВГЕ, к ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВГС, антигена р24 ВИЧ-1 и HBsAg. Контрольные образцы инактивировали прогреванием при температуре от 54 до 56 ºС в течение 3 ч. Для выявления вступивших в реакцию с антигенами антител применяли пероксидазный конъюгат МАТ мыши или поликлональных антител кролика к IgG человека. Хромогеном был 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин, раствор для разведения хромогена содержал перекись водорода.

При проведении ЛИА в канавки реакционной ванночки погружали иммуносорбент – нитроцеллюлозные стрипы с иммобилизованными рекомбинантными антигенами ВГЕ, добавляли раствор для разведения образцов, содержащий лизат клеток E. coli, и испытуемые образцы в конечном разведении 1:50. Инкубировали в течение 2 ч (в варианте дневной постановки) или 16–18 ч (в варианте ночной постановки) при комнатной температуре, используя лабораторный орбитальный шейкер. Не вступившие в реакцию антитела сыворотки крови удаляли 3-кратным промыванием. По 1 мл рабочего разведения конъюгата вносили в каждую канавку реакционной ванночки, инкубировали 1 ч (в варианте дневной постановки) или 30 мин (в варианте ночной постановки) при комнатной температуре, затем 3-кратно промывали. В каждую ванночку вносили по 1 мл субстратного раствора и инкубировали в течение 15 мин в защищённом от света месте. Реакционную смесь удаляли, реакцию останавливали, внося в каждую канавку по 1 мл фосфатно-солевого буфера. Через 5 мин стрипы промывали дистиллированной водой, высушивали и проводили визуальный или цифровой учёт результатов по наличию окрашенных линий на полосках иммуносорбента. Для цифрового учёта окрашенные стрипы сканировали с помощью планшетного сканера и анализировали интенсивность окрашивания с помощью программы TotalLab. На каждом стрипе для отдельных линий антигенов определяли КП по отношению площадей пиков, соответствующих полосам индивидуального вирусспецифического антигена и К_АГ, на денситограмме.

Результаты

Перед разработкой тест-системы для определения антител к ВГЕ методом ЛИА была создана стандартная лабораторная панель сывороток крови человека, содержащих и не содержащих IgG-антитела к ВГЕ, из проб от здоровых и больных людей с предварительным диагнозом «вирусный гепатит» из лечебно-профилактических учреждений Республики Беларусь, Кыргызстана и России. Все полученные образцы исследовали на антитела к ВГС, T. pallidum, ВИЧ-1, ВИЧ-2 и антигены р24 ВИЧ и HBsAg ВГВ. В дальнейших исследованиях использовали только отрицательные по этим показателям образцы. Отобранные образцы протестировали в тест-системе «ДС-ИФА-Анти-HEV-G». Сформированная таким образом лабораторная панель (ЛП) включала 25 (№ 1–25) положительных образцов (восемь с КП от 6,0 до 8,5; десять – с КП от 3,7 до 5,7; семь – с КП от 2,0 до 3,6 и 50 (№ 26–75) отрицательных образцов с КП от 0,2 до 0,9. В соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 23640-2015 проведено предварительное испытание стабильности образцов ЛП в течение 21 сут в двух режимах: при температуре 4,0 ± 1 °С и в условиях моделирования ускоренного старения при температуре 37,0 ± 1 °С. Анализ результатов исследования образцов по истечении срока хранения в наборе «ДС-ИФА-Анти-HEV-G» показал, что КП образцов ЛП, хранившихся при 4,0 ± 1 °С, оставались неизменными, в то же время образцы, выдержанные при 37,0 ± 1 °С в течение 21 сут, не теряли специфичности, при этом их КП снижался не более чем на 20%, что соответствует стабильности в течение 1 года при температуре от 2 до 8 °С.

Критерием выбора при отработке оптимальных условий проведения ЛИА считали максимальное соотношение между значениями КП для положительных и отрицательных образцов при отсутствии окрашивания полосы К_АГ. Концентрацию каждого из рекомбинантных антигенов ВГЕ и К_АГ для сорбции на поверхности нитроцеллюлозных мембран определяли в сериях их разведений в концентрациях от 10 до 40 мкг/мл. По результатам анализа реакций с положительными и отрицательными образцами были установлены оптимальные концентрации антигенов ВГЕ для сорбции: ORF2(1) – 8,75 мкг/мл, ORF2(3) – 8,75 мкг/мл, ORF3(1) – 35 мкг/мл, ORF3(3) – 35 мкг/мл, К_АГ – 45 мкг/мл. С целью выбора наиболее специфичного препарата пероксидазного конъюгата антител к IgG человека и определения его рабочего разведения было протестировано 3 вида антител к IgG человека, меченных пероксидазой хрена: МАТ2А11-ПХ, МАТСН1-ПХ и ПАТIgG-ПХ. Конъюгаты тестировали в разведениях от 1 : 20 000 до 1 : 60 000 в режиме ночной постановки. Анализ полученных результатов позволил выбрать оптимальный вариант конъюгата – МАТ2А11-ПХ в разведении 1 : 60 000. Для отработки наиболее приемлемых режимов инкубации иммуносорбента с исследуемыми образцами сывороток и конъюгатом изучили влияние продолжительности инкубации сывороток с иммобилизованными рекомбинантными антигенами ВГЕ от 1 до 3 ч в при дневной постановке и длительности реакции с конъюгатом в течение 30, 60 и 90 мин после дневной и ночной реакции иммуносорбента с сыворотками. Установлено, что в дневном варианте постановки оптимальное время инкубации с образцами сывороток составляет 120 мин, с конъюгатом – 60 мин. В ночном варианте постановки необходимая продолжительность реакции с конъюгатом составила 30 мин. За более короткое время не происходило достаточного окрашивания стрипов в реакциях с положительными образцами ЛП, а увеличение продолжительности инкубаций приводило к фоновому неспецифическому окрашиванию нитроцеллюлозных мембран. В серии отдельных экспериментов также были определены оптимальный режим послеинкубационной промывки стрипов, условия и время взаимодействия с субстратной смесью, время остановки ферментативной реакции и составы соответствующих растворов.

Апробирован визуальный и цифровой учёт результатов и отработана их интерпретация.

Визуальный учёт результатов осуществляли по окрашиванию участков мембран с иммобилизованными вирусспецифическими и контрольными антигенами. Визуальный учёт результатов исследования проводили, если в реакции с контрольными сыворотками (К⁺ и К^-) происходило фиолетово-синее окрашивание линии № 6 (К_Р: контрольный антиген правильности проведения реакции) и отсутствовало в области линии № 5 (К_АГ: контрольный антиген специфичности реакции), а также, если линии № 1–4 чётко окрашены в реакции с К⁺ и не окрашены в реакции с К^-. Результат исследования образца учитывали как положительный, если окрасились две и более линий № 1–4; как неопределённый, если произошло окрашивание не более одной из линий № 1–4; как отрицательный, если не окрасилась ни одна из линий.

Окрашивание линии № 5 (К_АГ) в реакциях с испытуемыми образцами рассматривали как неспецифическое взаимодействие за счёт присутствия антител к бактериальным антигенам E. coli или вследствие несоблюдения правил приготовления и хранения образца сыворотки. В этом случае окрашивание любой из линий № 1–4 учитывали как специфическое, если его интенсивность заметно превышала интенсивность окрашивания полосы № 5. При одинаковом или менее выраженном окрашивании любой из линий № 1–4 в сравнении с линией № 5 результат окрашивания этой линии учитывали как отрицательный. Если при исследовании по варианту с 2-часовой инкубацией образцов происходило окрашивание только одной полосы (неопределённый результат) или наблюдалось столь слабое окрашивание линий № 1–4 мембраны, что это не давало возможности учитывать результат, то анализ такого образца сыворотки повторяли по схеме с 18-часовой инкубацией. Повторное получение неопределённого результата рассматривали как свидетельство необходимости дополнительного исследования образца другими методами.

По результатам тестирования массива отрицательных в тест-системе «ДС-ИФА-Анти-HEV-G» сывороток (n=140) пороговое значение КП (КП_пор.) по каждому из антигенов определено равным 2,1 (р < 0,05) для цифрового учёта результатов. Интерпретацию результатов окрашивания линий на стрипе проводили с соблюдением тех же условий и в том же порядке, что и при визуальном учёте, при этом окрашивание линий антигенов подлежало учёту при КП более КП_пор.

Для оценки аналитической чувствительности тест-системы выполняли титрование Международного стандарта ВОЗ «Anti-hepatitis E Serum, Human» 95/584 NIBSC на отдельных антигенах ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го (ORF2(1), ORF3(1)) и 3 го (ORF2(3), ORF3(3)) генотипов. Лиофильно высушенный препарат стандарта восстанавливали согласно инструкции производителя и готовили его последовательные двукратные разведения, начиная от 10 МЕ/мл, используя раствор для разведения образцов из тест-системы «Блот-ВГЕ». На рис. 2 представлены результаты титрования образца ВОЗ на рекомбинантных антигенах, сорбированных на стрипах нитроцеллюлозных мембран в двукратных разведениях от 70 до 0,5 мкг/мл. Аналитическая чувствительность разработанного экспериментального образца тест-системы составила 0,625 МЕ/мл при сорбции антигенов ORF2(1) и ORF2(3) в концентрации 8,75 мкг/мл и 2,5 МЕ/мл при сорбции антигенов ORF3(1) ORF3(3) в концентрации 35 мкг/мл.

Аналитическую специфичность исследовали как способность теста обнаруживать только исследуемый аналит при наличии в пробе потенциально интерферирующих веществ или антител к возбудителям вирусных гепатитов и патологий печени иной этиологии. На искусственно смоделированных образцах сыворотки крови, содержащих потенциальные эндогенные интерференты, исследовано влияние на результат анализа с положительными и отрицательными образцами ЛП их нормальных и повышенных концентраций: ревматоидный фактор – 20 (норма), 40–50 и 80–90 МЕ/мл; церулоплазмин – 0,6 (норма), 1–3 и 6–8 г/л; триглицериды – 0,75 (норма), 3,75 и 7,5 мг/мл; глюкоза – до 6,1 (норма), 16,5 и 33,5 ммоль/л; билирубин – 20 (норма), 30– 40 и 55–65 мкмоль/л. Анализ полученных результатов показал, что интенсивность окрашивания полос с рекомбинантными и контрольными антигенами не зависит от присутствия в образцах интерферирующихагентов (рис. 3).

Чувствительность экспериментального образца тест-системы «Блот-ВГЕ» вначале была оценена на положительных и отрицательных образцах контрольной панели производства ООО «НПО «Диагностические системы» (Россия). Из результатов, представленных в табл. 1, видно, что значения КП по отдельным антигенам, полученные в тест-системе «Блот-ВГЕ», в среднем превышают этот показатель при тестировании образцов методом ИФА.

При проведении испытаний с использованием сывороток ЛП была установлена 100% чувствительность и 100% специфичность экспериментального образца тест-системы «Блот-ВГЕ».

Диагностическую чувствительность и диагностическую специфичность тест-системы «Блот-ВГЕ» исследовали в сравнении с единственным коммерческим аналогом – зарегистрированной в России тест-системой «RecomLine HEV IgG/IgM», основанной на использовании рекомбинантных антигенов, содержащих С-концевые (антигены O2C(1) и O2C(3)), N-концевые (антигены O2N(1) и O2N(3)) фрагменты ORF2 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов, срединного участка белка ORF2 ВГЕ 1-го генотипа (антиген O2M) и аминокислотные последовательности белков ORF3 (антигены O3(1) и O3(2)) ВГЕ 1-го и 3-го генотипов. Всего в обеих тест-системах в соответствии с ГОСТ Р 51352-2013 было исследовано 75 образцов ЛП (№ 1–75) и 30 образцов контрольной группы, содержащих специфические IgG-антитела к другим возбудителям вирусных гепатитов и инфекционной патологии печени – ВГА (№ 76–80), ВГВ (№ 81–85), ВГС (№ 86–90), цитомегаловирусу (№ 91–95), вирусу Эпштейна–Барр (№ 96–100), ВИЧ-1 (№ 101–105) (табл. 2). Проведён визуальный учёт результатов, поскольку только он предусмотрен инструкцией к набору «RecomLine HEV IgG/IgM».

Таблица 1. Оценка чувствительности тест-системы «Блот-ВГЕ» на сыворотках контрольной панели
Table 1. Assessment of the sensitivity of the test system Blot-HEV on the sera of the control panel

Примечание. ЛИА – линейный иммуноанализ; ИФА – иммуноферментный анализ; КП – коэффициент позитивности.
Note. LIA – Line immunoassay, ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay, COI – cut-off index.

Таблица 2. Результаты испытаний тест-системы «Блот-ВГЕ» в сопоставлении с набором «RecomLine HEV IgG/IgM» на образцах лабораторной панели и контрольной группы
Table 2. Comparison of the test system Blot-HEV and a set “RecomLine HEV IgG/IgM” in testing of samples from LP and control group

Примечание. * Пол. – положительный; Отр. – отрицательный; Н/о – неопределенный результат.
Note. * Pos. – positive, Neg. – negative, U/d – undetermined result.

В группе сывороток ЛП, содержащих IgG-антитела к ВГЕ, доля положительных результатов анализа в обеих тест-системах была одинаковой и составила 100%. В контрольной группе сывороток в наборе Блот-ВГЕ был получен один неопределённый результат при отрицательном в наборе сравнения. Таким образом, диагностическая эффективность экспериментального образца тест-системы «Блот-ВГЕ», оценённая в соответствии с Методическими рекомендациями ФГБУ «ВНИИМТ» Росздравнадзора от 03.08.2016, при исследовании 105 образцов сыворотки крови человека (25 положительных и 80 отрицательных) относительно ограниченного количества экземпляров набора сравнения «RecomLine HEV IgG/IgM» соответствовала 92% чувствительности и 97% специфичности. О высокой диагностической специфичности разработанной тест-системы свидетельствует и отсутствие перекрёстных реакций с возбудителями гепатитов иной этиологии. Воспроизводимость тест-системы, рассчитанная на трёх лабораторных сериях её экспериментального образца по величине КП для каждого из антигенов на четырёх положительных образцах ЛП, соответствует коэффициенту вариации от 6,29 до 12,43%, что не превышает допустимых пределов (менее 15%).

Изучение стабильности экспериментального образца тест-системы в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 23640-2015 показало, что тест-система сохраняет свои диагностические характеристики в течение 3 нед хранения в условиях ускоренного старения, что соответствует 12 мес хранения при температуре от 4 до 8 ºС, остаётся стабильной в условиях лабораторного моделирования транспортирования в течение 3 сут при температуре от 9 до 30 °С, а все её готовые компоненты после вскрытия индивидуальной
упаковки сохраняют стабильность в течение 2 мес.

С целью уточнения практической значимости тест-системы «Блот-ВГЕ», протестированы 134 образца сывороток, из них 68 были положительными в тест-системе «ДС-ИФА-Анти-HEV-G». Подтверждено присутствие IgG-антител к ВГЕ во всех положительных образцах. При исследовании сывороток крови контрольной группы отрицательные результаты были получены в 65 случаях, с одним образцом получен слабоположительный результат, причём произошло окрашивание линий с антигенами ORF2(1) и ORF2(3). Cредние значения КП положительных образцов, определённые с помощью тест-системы «Блот-ВГЕ» по антигенам ORF2(1) и ORF2(3), превышали данный показатель, определённый методом ИФА (рис. 4). Для антигенов ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов показано более редкое и менее выраженное взаимодействие с положительными образцами.

Обсуждение

ЛИА является альтернативой классическому иммуноблоттингу, или вестерн-блоту. Известно, что по чувствительности и специфичности тесты, основанные на ЛИА, не уступают вестерн-блоту, а также превосходят по этим показателям ИФА за счёт анализа взаимодействия антител с несколькими индивидуальными антигенами инфекционного агента, представленными в большем содержании, чем позволяет сорбционная ёмкость планшета для ИФА. В настоящее время этот метод признан «золотым стандартом» для подтверждения результатов ИФА. Нами разработан первый отечественный экспериментальный образец тест-системы, предназначенной для определения IgG-антител к индивидуальным белкам ВГЕ в сыворотке крови человека методом ЛИА для подтверждения положительных или уточнения сомнительных результатов ИФА. В тест-системе используются очищенные рекомбинантные антигены, что гарантирует воспроизводимо высокую чувствительность и специфичность. Применение гомологичных белков двух разных генотипов вируса обеспечивает эффективность применения теста для анализа образцов не только из высокоэндемичных регионов, но и из регионов с невысокой спорадической заболеваемостью или преобладанием завозных случаев ГЕ.

Результаты сравнительных испытаний позволили заключить, что разработанная тест-система практически не уступает импортному коммерческому аналогу по показателям чувствительности и специфичности. Кроме того, она превосходит его по ряду потребительских свойств. В частности, все её компоненты представлены в жидком виде, в её составе есть положительный и отрицательный контрольные образцы, а также предусмотрена возможность 16–18 часовой ночной постановки, которая часто бывает более удобна при проведении клинических исследований. Важным преимуществом тест-системы является также цифровой учёт результатов с использованием общедоступного офисного оборудования.

Выявление специфических антител в отрицательном образце по результатам тестирования в ИФА-наборе может свидетельствовать о более высокой чувствительности тест-системы «Блот-ВГЕ». В пользу такой трактовки результатов свидетельствуют отсутствие в антигенной основе тест-системы, в которой были отобраны образцы, белков ВГЕ 3-го генотипа [15], а также особенности конструкции используемых в тест-системе «Блот-ВГЕ» рекомбинантных антигенов, содержащих более протяжённый участок белков ORF2, а следовательно, и дополнительные вирусспецифические эпитопы. Более редкое и менее выраженное взаимодействие с положительными образцами белков ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов можно объяснить тем, что данные антигены индуцируют преимущественно образование IgM- и ранних IgG-антител [7], а отбор образцов опытной группы проводили на тест-системе, содержащей в антигенной основе фрагменты белка ORF2 ВГЕ и предназначенной для выявления IgG-антител.

Учитывая различия в результатах, получаемых с применением производимых разными компаниями тест-систем [16][17], проблема разработки надёжных тестов для подтверждающей диагностики ГЕ и их стандартизации остаётся актуальной. В частности, пока не решена задача по созданию тестов, подтверждающих наличие специфических IgM-антител – важного маркера ранней стадии заболевания, когда IgGантител ещё на вырабатываются, а период вирусемии продолжается и больной ГЕ является источником инфекции. В качестве развития выбранного направления исследований запланирована разработка метода ЛИА для выявления антител класса IgM к белкам ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов.

Следует отметить, что корректная диагностика ГЕ должна обеспечиваться комплексным анализом всех лабораторных (биохимических, серологических, молекулярно-генетических) показателей и клинических проявлений заболевания [3].

Выводы

1. Разработана первая отечественная тест-система «Блот-ВГЕ» для выявления IgG-антител к индивидуальным белкам ВГЕ в сыворотке крови человека методом ЛИА с применением ранее полученных авторами рекомбинантных ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов.
2. Аналитическая чувствительность тест-системы по Международному стандарту ВОЗ «Anti-hepatitis E Serum, Human» 95/584 NIBSC составила 0,625 МЕ/мл для антигенов ORF2 и 2,5 МЕ/мл для антигенов ORF3. Чувствительность тест-системы в сравнении с коммерческим аналогом – набором «RecomLine HEV IgG/IgM» (Mikrogen Diagnostik GmbH, Германия) – составила 92%, специфичность – 97%.
3. Доказано отсутствие влияния эндогенных интерферентов и отсутствие перекрёстных реакций с антителами к возбудителям гепатитов иной этиологии на результаты анализа.
4. Определён срок годности тест-системы «БлотВГЕ» в заданных условиях хранения – 12 мес.
5. Разработанная тест-система может применяться для подтверждения результатов ИФА в лабораторной диагностике ГЕ.

About the authors

G. I. Alatortseva

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: alatortseva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9887-4061

Galina I. Alatortseva, PhD (Biol.), Lead Researcher, Нead of the laboratory for cloning of viral genomes

Moscow, 105064

Russian Federation

V. V. Dotsenko

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5866-944X

Vera V. Dotsenko

Moscow, 105064

Russian Federation

L. N. Nesterenko

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3825-3906

Lyubov N. Nesterenko

Moscow, 105064

Russian Federation

L. N. Luhverchik

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-2997-8892

Lyudmila N. Luhverchik

Moscow, 105064

Russian Federation

V. Yu. Kabargina

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8784-4497

Vera Yu Kabargina

Moscow, 105064

Russian Federation

I. I. Amiantova

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3483-0128

Irina I. Amiantova

Moscow, 105064

Russian Federation

M. V. Zhukina

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-2329-5089

Marina V. Zhukina

Moscow, 105064

Russian Federation

S. V. Zhavoronok

Belarusian State Medical University

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9727-1103

Sergey V. Zhavoronok

Minsk, 220116

Belarus

Z. S. Nurmatov

Scientific Production Association “Preventive Medicine” Ministry of Health of the Kyrgyz Republic

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3481-227X

Zuridin S. Nurmatov

Bishkek, 720005

Kyrgyzstan

A. Z. Nurmatov

Scientific Production Association “Preventive Medicine” Ministry of Health of the Kyrgyz Republic

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0717-4172

Asılbek Z. Nurmatov

Bishkek, 720005

Kyrgyzstan

V. V. Zverev

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0017-1892

Vitaliy V. Zverev

Moscow, 105064

Russian Federation

References

Supplementary files