Characterization of B1-cells during experimental leukomogenesis

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Background. Bovine leukemia causes a significant polyclonal expansion of CD5+ , IgM+ B lymphocytes, known as persistent lymphocytosis (PL), in approximately 30% of infected cattle. However, it is not yet clear what happens to this subpopulation of B cells in the early period of infection of animals.

Purpose. Quantitative characterization of IgM+ and CD5+ B cells during the immune response, which can provide important information on the mechanisms of lymphocyte priming in BLV infection.

Material and methods. The experiment used BLV-negative calves of black-motley breed at the age of 8 months (n = 11). Animals (n = 8) were intravenously injected with blood of a BLV-positive cow. Control calves (n = 3) were injected with saline. Studies were performed before and after infection on days 5, 7, 14, 21, 28 and 65 of the immune response. The determination of the number of B-lymphocytes in the blood was carried out by the method of immunoperoxidase staining based on monoclonal antibodies to IgM, CD5.

Results. As a result of the studies, it was found that the level of CD5+ B cells increases on the 14th day of the primary immune response, characterized by polyclonal proliferation of CD5+ B cells, which are the primary target for BLV. Our research data confirm that in the lymphocytes of experimentally infected cattle, surface aggregation of IgM and CD5 molecules on B-lymphocytes is absent.

Discussion. It is known that the wave-like nature of IgM synthesis, which was shown in previous studies, depends on a subpopulation of B1 cells. After 7 days of the immune response, IgM+ and CD5+ cells do not correlate, which shows their functional difference. The increase in CD5+ cells is probably not associated with B cells, but with T cells differentiating under the influence of the virus.

Conclusions. A subset of B1 cells is the primary target of cattle leukemia virus. The 65th day of the immune response is characterized by the expansion of IgM+ B cells, a decrease in the number of CD5+ cells and a uniform distribution of receptors around the perimeter of the cells.

Full Text

Введение

Вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV) – один из наиболее распространённых патогенов молочного скота. ВLV передаётся горизонтально между животными при контакте с биологическими жидкостями, содержащими инфицированные клетки, особенно c кровью и молоком. Также инфицирование может быть связано с травмой, загрязнёнными хирургическими инструментами и насекомыми (гематофаги), которые служат механическими переносчиками вируса. Чаще всего передача происходит от матери к потомству при выпойке молозивом и молоком от коров с высокой вирусной нагрузкой. Приблизительно у 30% зараженного крупного рогатого скота (КРС) в итоге развивается стойкий лимфоцитоз (постоянно больше 7500 лимфоцитов в 1 мкл крови), который обычно не имеет очевидных клинических признаков. У 1–3% инфицированных животных развивается лимфосаркома в возрасте 4–8 лет.

Несмотря на низкую частоту развития клинических признаков у КРС, заражённого BLV, инфекция может привести к экономическим потерям в результате выбраковки высокопродуктивных молочных коров [1]. Лейкоз КРС снижает как долголетие животных, так и выработку молока, и может нарушать иммунный статус. При высокой распространённости BLV в молочных стадах важно понимать механизмы патогенеза, при которых вирус отрицательно влияет на иммунную систему заражённого животного [2]. Известно, что вирус вне клетки менее инфекционен, чем вирус, связанный с клетками крови, поскольку ВLV использует межклеточные контакты для передачи информации между инфицированными клетками и неинфицированными клетками-мишенями, которыми являются В-клетки [3][4]. Для выявления субклинического прогрессирования инфекции BLV более эффективно определение относительного количества В-клеток, нежели абсолютного количества лимфоцитов [5].

Несмотря на большое количество исследований в данной области, многие механизмы адаптивного клеточного иммунного ответа до сих пор неизвестны [6][7]. Процесс проникновения вируса в клетку пока до конца не ясен. Некоторые авторы полагают, что вирусные белки нарушают внутриклеточные сигнальные пути [8][9]. Большинство известных в настоящее время поверхностных белков суперсемейства иммуноглобулинов, в том числе трансмембранный мономер молекулы иммуноглобулина М (IgМ), являются рецепторами контактного взаимодействия клеток, которые трансформируют антигенные сигналы в определённые клеточные реакции. Связывание рецептора с его лигандом сопровождается не только изменением конфигурации поверхностного белка, но и его латеральной диффузией [10]. Топография поверхности В-клеток модулирует активацию сигнального пути. Липидные рафты играют важную роль в передаче сигнала В-клеткам, способствуя локализации В-клеточного антигенного рецептора (BCR), ограничению его подвижности и образованию сигнальных комплексов. BCR, распознавший антиген, вместе с белками главного комплекса гистосовместимости класса ІІ кластеризуется и скрепляется актиновыми нитями со стороны цитоплазмы. В результате на мембране В-клетки могут собираться рецепторы в форме «ринг» (равномерное распределение в плоскости мембраны), «пэтч» (неравномерное распределение), «кэп» (скопление на одном из полюсов клетки) с последующим погружением в цитоплазму (эндоцитоз).

В проведённых ранее экспериментах установлено, что основной формой локализации Ig-рецепторов В-клеток крови КРС является «пэтч»/эндоцитоз (68,9%) [11]. Развитие этой популяции лимфоцитов зависит от экспрессии рецептора В-клеток для антигена (BCR), сформированного из молекул IgM и CD79. Предшественники В-клеток могут впоследствии проходить продуктивную реаранжировку генов лёгких цепей, чтобы стать IgM+ В-клетками. В формировании рецептора В-клеток (ВCR) принимают участие три компонента: мономер IgM и два полипептида – Igα, Igβ (CD79). В цитоплазме пре-В-клеток обнаруживается тяжёлая μ-цепь IgM. Наивная В-клетка на своей поверхности экспрессирует полные молекулы данного иммуноглобулина. Циркулирующая фолликулярная и экстра-фолликулярная В-клетки также несут на своей мембране IgM.

В настоящее время обсуждаются эксперименты, показавшие, что у популяции IgM+ В-клеток инфицированных животных изменяется механизм передачи сигналов и они приобретают устойчивость к апоптозу, что вызывает экспансию В-клеток. Связывание антигена В-клетками инициирует диффузию BCR в мембранные микродомены, обогащённые сфинголипидами и холестерином, называемые липидными рафтами. Липидные рафты включают представителей киназ семейства Src и исключают некоторые фосфатазы. Включение BCR в липидные рафты играет важную роль в регуляции ранних сигнальных событий и последующей интернализации антигена. Известно, что BLV вызывает значительную поликлональную экспансию CD5+, IgM+ B-лимфоцитов, известных как персистирующий лимфоцитоз приблизительно у 30% заражённого КРС [12]. Однако пока не ясно, что происходит с данной субпопуляцией В-клеток в ранний период инфицирования животных. Поэтому целью исследований была количественная характеристика субпопуляций IgM+ - и CD5+ -В-клеток в процессе иммунного ответа на заражение BLV, которая может дать важную информацию о механизмах прайминга лимфоцитов при инфицировании BLV.

Материал и методы

В эксперименте использовали BLV-отрицательных чёрно-пёстрой породы в возрасте 8 мес (n = 11). Вся работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России от 19.06.2003 № 267 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации». Животным опытной группы (n = 8) внутривенно вводили кровь BLV-положительной коровы. Телятам контрольной группы (n = 3) вводили физиологический раствор. Исследования проводили до и после заражения на 5, 7, 14, 21, 28 и 65-е сутки иммунного ответа. Лимфоциты крови выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности Histopaque-1077 при 3000 об/минв течение 45 мин. Концентрацию мононуклеарных клеток в суспензии доводили до 1,0–0,5·106 кл/мл. Количество В-лимфоцитов в крови определяли методом иммунопероксидазного окрашивания на основе моноклональных антител к IgM CD5.

Для удаления экзогенных иммуноглобулинов 100 мкл взвеси мононуклеарных клеток крови обрабатывали 1% раствором лимонной кислоты в течение 1 мин, центрифугировали 5-кратно в фосфатном буфере (рН 7,2) при 1100 об мин по 5 мин. Взвесь клеток фиксировали этанолом на предметном стекле. Блокаду пероксидазы проводили 1% раствором перекиси водорода в течение 10 мин. В качестве блокирующего раствора использовали 10% раствор сыворотки крови лошади. Инкубировали 60 мин при комнатной температуре и тщательно отмывали клетки фосфатным буфером (рН 7,2) К фиксированным клеткам добавляли моноклональные антитела к IgM рогатого скота (1 : 400). Затем добавляли антивидовой конъюгат в рабочем разведении (1 : 1500). Для визуализации комплекса антиген/антитело использовали 3-амино-9-этилкарбазол (AEC; Sigma, США). AEC-позитивные клетки идентифицировали по красно-коричневому окрашиванию при просмотре препаратов под микроскопом (×1000). Статистическую обработку выполняли с использованием стандартных программ SPSS – Statistical package for the social sciences. Уровень значимости вариационных рядов оценивали с использованием параметрического t-критерия Стьюдента.

Результаты

В результате проведённых исследований установлено, что корреляционная связь показателей субпопуляций В-клеток с фенотипом IgM+ и CD5+ имеет среднюю степень сопряжённости (r = 0,61). Это показывает относительную независимость данных субпопуляций.

Как видно на рис. 1, уровень CD5+ В-клеток повышается на 14-е сутки первичного иммунного ответа, характеризующегося поликлональной пролиферацией CD5+ В-клеток, которые являются первичной мишенью для BLV.

Поскольку большинство CD5+ B-клеток содержат провирус [13][14], повышение их уровня усиливает передачу вируса через кровь от инфицированных к здоровым животным. Персистирующий лейкоцитоз также является предиктором позднего развития лимфомы, состоящей в основном из CD5+ B-клеток. Следовательно, повышение CD5+ -субпопуляции имеет решающее значение для передачи и прогрессирования лейкомогенеза.

В предыдущих исследованиях было установлено, что к 7-м суткам иммунного ответа уровень IgMспецифических антител увеличивался, а это соответствует повышению относительного количества IgM+ CD5+ В-клеток [15]. После 7-х суток субпопуляционная характеристика первичного иммунного ответа изменяется. Уровень CD5+ -лимфоцитов увеличивается, а относительное количество IgM+ В-клеток уменьшается, но к 65-м суткам опять возрастает. У КРС молекула CD5 конститутивно диссоциирует от мембранного IgM, что связано с защитой от апоптоза после передачи антигенного сигнала. Кроме того, экспериментальная диссоциация молекулы CD5 и BCR B-клеток у BLV отрицательного КРС снижает BCR-стимулированный апоптоз [16]. Возможно, что увеличение с 7-х суток иммунного ответа окрашенных анти-CD5+ антителами клеток не связано с В-клетками, а характеризует пролиферацию Т-клеток, так как молекула CD5 является дифференцировочным маркёром Т-лимфоцитов.

На микрофотографиях (рис. 2) показано увеличение числа IgM+ В-клеток на 65-е сутки после заражения по сравнению с количеством этих клеток на 5-е сутки после введения BLV, что характерно для поликлональной экспансии IgM+ В-клеток при лейкозе КРС.

Недавние исследования показали, что ранняя регуляция ответа BCR на антиген, вероятно, контролируется путём проникновения BCR в специфические мембранные микродомены (липидные рафты). Липидные рафты концентрируют сигнальные молекулы IgM, Igα и Igβ в непосредственной близости от ранних сигнальных киназ после стимуляции антигеном (кэппинг-эффект).

В незрелых и толерантных В-клетках с более высокой поверхностной экспрессией CD5 после стимуляции происходит исключение BCR из липидных рафтов. То же происходит при лейкомогенезе, когда вирус ограничивает транслокацию в мембране и интернализацию в цитоплазму B-клеточного рецептора, в который входит IgM.

Пространственная координация мономера IgM внутри липидных рафтов играет важную роль в регуляции сигнальных путей в клетке. В настоящее время обсуждается вопрос о том, что наблюдаемые различия в результатах передачи сигналов BCR в изменённых вирусом В-клетках КРС можно объяснить неспособностью В-клеток у КРС с персистирующим лимфоцитозом формировать плотную агрегацию IgM на плазматической мембране после стимуляции антигеном. Данные наших исследований подтверждают, что в лимфоцитах экспериментально заражённого КРС поверхностная агрегация молекул IgM и CD5 практически отсутствует (рис. 3). На микрофотографиях видно, что IgM+ В-клетки и CD5+ - клетки окрашены по периметру в форме «ринг» без кэппинг-эффекта поверхностных рецепторов.

Рис. 1. Динамика количества IgM+ и CD5+ В-клеток.
По оси абсцисс – сроки отбора проб крови у опытной и контрольной групп телят, сут; по оси ординат – относительное количество IgM+- и CD5+ -клеток опытной и контрольной групп телят, %.
Fig. 1. Dynamics of the number of IgM+ and CD5+ B cells.
The abscissa shows the time (day) of blood sampling in the experimental and control groups of calves. The ordinate shows the relative number (%) of IgM+ and CD5+ cells of the experimental and control groups of calves.

Рис. 2. IgM+ В-клетки на 5-е (а) и 65-е (б) сутки после экспериментального заражения BLV.
Иммунопероксидазное окрашивание, ×1000.
Fig. 2. IgM+ B cells on days 5 (а) and 65 (в) after experimental infection with BLV.
Immunoperoxidase staining, × 1000.

Рис. 3. IgM+ В-клетки (а) и CD5+ -клетки (б) крови телят на 65-е сутки иммунного ответа. Иммунопероксидазное окрашивание, ×1000.
Fig. 3. IgM+ B cells (а) and CD5+ blood cells (в) of calves on the 65th day of the immune response. Immunoperoxidase staining, × 1000.

Обсуждение

Одним из отличительных признаков лейкомогенеза у животных является спонтанная пролиферация мононуклеарных клеток периферической крови, в основном В-лимфоцитов. Результаты наших исследований показали ассоциацию экспрессии поверхностных молекул IgM и CD5 в В-клетках крови экспериментально заражённых телят до 7-х суток иммунного ответа. Данные маркёры характерны для субпопуляции В1-клеток, которая является первичной мишенью для BLV. Эти лимфоциты предназначены для быстрого реагирования на наиболее распространённые антигены клеточных стенок бактерий в прибарьерных полостях.

Естественные антитела, секретируемые В1- клетками, – это IgМ и IgА, которые играют важную роль в противоинфекционной защите организма. Антитела, продуцируемые В1-лимфоцитами, преимущественно специфичнык тимуснезависимым антигенам. По нашему мнению, именно от этой субпопуляции В-клеток зависит волнообразный характер синтеза IgM, который был показан в предыдущих исследованиях. После 7-х суток иммунного ответа показатели IgM+ - и CD5+ -клеток не коррелируют, что показывает их функциональное различие. Возможно, увеличение числа CD5+ -клеток связано не с В-клетками, а с дифференцирующимися под влиянием вируса Т-лимфоцитами [17][18]. Для динамики IgM+ В-клеток характерно как повышение, так и уменьшение их числа в течение 2 мес наблюдения, что, вероятно, связано с влиянием вирусных белков на функциональную активность инфицированной клетки. Как было установлено, включение В-клеточного рецептора, составной частью которого является трансмембранный мономер IgM, в липидные рафты играет важную роль в регуляции сигналов и последующей интернализации антигена. Вирусные белки также могут влиять на процессы, происходящие в липидных рафтах [19]. Так, исключение BCR из липидных рафтов может частично объяснить различия в передаче сигналов, наблюдаемых между В-клетками BLV-инфицированного и BLV-отрицательного КРС. Наши результаты подтверждают эти исследования. Было показано, что через 2 мес после введения BLV рецепторы IgM и CD5 равномерно распределены по мембране клетки без образования «кэпов». Возможно, BLV, замедляя диффузию рецепторов в мембране клетки, таким образом блокирует апоптоз.

Выводы

  1. Увеличение количества В-клеток с фенотипом IgM+/CD5+ в 1-е сутки иммунного ответа на введение BLV показывает, что субпопуляция В1-клеток является первичной мишенью BLV.
  2. Повышение уровня CD5+ - клеток на 14-е сутки иммунного ответа, вероятно, происходит за счёт Т-клеток в стадии дифференцировки.
  3. Второй месяц иммунного ответа характеризуется экспансией IgM+ В-клеток, снижением числа CD5+- клеток и равномерным распределением рецепторов по периметру клеток.
×

About the authors

I. Yu. Ezdakova

All-Russian Scientific and Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after K.I. Scriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: ezdakova.i@viev.ru
ORCID iD: 0000-0002-8467-4920

Irina Yu. Ezdakova, Doctor of Biological Sciences, Head Laboratory of Immunology.

Moscow, 109428

Russian Federation

O. V. Kapustina

All-Russian Scientific and Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after K.I. Scriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7382-8656
Moscow, 109428 Russian Federation

M. I. Gulyukin

All-Russian Scientific and Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after K.I. Scriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7489-6175
Moscow, 109428 Russian Federation

T. V. Stepanova

All-Russian Scientific and Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after K.I. Scriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9092-8045
Moscow, 109428 Russian Federation

References

  1. Bartlett P.C., Norby B., Byrem T.M., Parmelee A., Ledergerber J.T., Erskine R.J. Bovine leukemia virus and cow longevity in Michigan dairy herds. J. Dairy Sci. 2013; 96(3): 1591-7. http://doi.org/10.3168/jds.2012-5930
  2. Frie M.C., Sporer K.R., Wallace J.C., Maes R.K., Sordillo L.M., Bartlett P.C., et al. Reduced humoral immunity and atypical cell-mediated immunity in response to vaccination in cows naturally infected with bovine leukemia virus. Vet. Immunol. Immunopathol. 2016; 182: 125-35. http://doi.org/10.1016/j.vetimm.2016.10.013
  3. Florins A., Boxus M., Vandermeers F., Verlaeten O., Bouzar A.B., Defoiche J., et al. Emphasis on cell turnover in two hosts infected by bovine leukemia virus: A rationale for host susceptibility to disease. Vet. Immunol. Immunopathol. 2008; 125(1-2): 1-7. http://doi.org/10.1016/j.vetimm.2008.04.007
  4. Brym P., Ruść A., Kamiński S. Evaluation of reference genes for qRT-PCR gene expression studies in whole blood samples from healthy and leukemia-virus infected cattle. Vet. Immunol. Immunopathol. 2013; 153(3-4): 302-7. http://doi.org/10.1016/j.vetimm.2013.03.004
  5. Mayr B., Vogel I., Graninger W., Schlerka G., Wöckl F., Schleger W. Circulating immune cells and immune complexes in peripheral blood of healthy and of bovine leukemia virus-infected cows and lymphosarcomatous calves. Vet. Immunol. Immunopathol. 1982; 3(5): 475-84. http://doi.org/10.1016/0165-2427(82)90013-7
  6. Murakami K., Sentsui H., Inoshima Y., Inumaru S. Increase in gammadelta T cells in the blood of cattle persistently infected with bovine leukemia virus following administration of recombinant bovine IFN-gamma. Vet. Immunol. Immunopathol. 2004; 101(1-2): 61-71. http://doi.org/10.1016/j.vetimm.2004.04.016
  7. Usui T., Konnai S., Ohashi K., Onuma M. Expression of tumor necrosis factor-α in IgM+ B-cells from bovine leukemia virus-infected lymphocytotic sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 2006; 112(3-4): 296-301. http://doi.org/10.1016/j.vetimm.2006.03.002
  8. Frie M.C., Coussens P.M. Bovine leukemia virus: A major silent threat to proper immune responses in cattle. Vet. Immunol. Immunopathol. 2015; 163(3-4): 103-14. http://doi.org/10.1016/j.vetimm.2014.11.014
  9. Murakami K., Inumaru S., Yokoyama T., Okada K., Sentsui H. Expression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) receptor on B-1a cell from persistent lymphocytosis (PL) cows and lymphoma cell induced by bovine leukemia virus. Vet. Immunol. Immunopathol. 1999; 68(1): 49-59. http://doi.org/10.1016/s0165-2427(99)00011-2
  10. Ездакова И.Ю., Капустина О.В., Попова Е.В. Модуляция Igрецепторов В-клеток крови крупного рогатого скота. Морфология. 2019; 156(6): 93-4.
  11. Попова Е.В., Ездакова И.Ю. Иммуноглобулиновые рецепторы В-лимфоцитов животных. Труды Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. 2015; 78: 199-206.
  12. Murakami H., Todaka H., Uchiyama J., Sato R., Sogawa K., Sakaguchi M., et al. A point mutation to the long terminal repeat of bovine leukemia virus related to viral productivity and transmissibility. Virology. 2019; 537: 45-52. http://doi.org/10.1016/j.virol.2019.08.015
  13. Mirsky M.L., Olmstead C.A., Da Y., Lewin H.A. The prevalence of proviral bovine leukemia virus in peripheral blood mononuclear cells at two subclinical stages infection. J. Virol. 1996; 70(4): 2178-83.
  14. Juliarena M.A., Barrios C.N., Ceriani C.M., Esteban E.N. Hot topic: Bovine leukemia virus (BLV)-infected cows with low proviral load are not a source of infection for BLV-free cattle. J. Dairy Sci. 2016; 99(6): 4586-9. http://doi.org/10.3168/jds.2015-10480
  15. Гулюкин М.И., Капустина О.В., Ездакова И.Ю., Вальциферова С.В., Степанова Т.В., Аноятбеков М. Выявление специфических антител классов G и М к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотках крови. Вопросы вирусологии. 2019; 64(4): 173-7. http://doi.org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-173-177
  16. Сantor C.H., Pritchard S.M., Dequiedt F., Willems I., Kettmann R., Davis W.C. CD5 is dissociated from the B-cell receptor in B cells from BLV-infected, PL cattle: consequences to B-cell receptor-mediated apoptosis. J. Virol. 2001; 75(4): 1689-96. http://doi.org/10.1128/JVI.75.4.1689-1696.2001
  17. Gillet N., Florins A., Boxus M., Burteau C., Nigro A., Vandermeers F., et al. Mechanisms of leukemogenesis induced by BLV: prospects for novel anti-retroviral therapies in human. Retrovirology. 2007; 4: 18. http://doi.org/10.1186/1742-4690-4-18
  18. Suzuki S., Konnai S., Okagawa T., Ikebuchi R., Nishimori A., Kohara J., et al. Increased expression of the regulatory T cellassociated marker CTLA-4 in bovine leukemia virus infection. Vet. Immunol. Immunopathol. 2015; 163(3-4): 115-24. http://doi.org/10.1016/j.vetimm.2014.10.006
  19. Hamilton V.T., Stone D.M., Cantor G.H. Translocation of the B cell receptor to lipid rafts is inhibited in B cells from BLV-infected, persistent lymphocytosis cattle. Virology. 2003; 315(1): 135-47. http://doi.org/10.1016/s0042-6822(03)00522-1

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2020 Ezdakova I.Y., Kapustina O.V., Gulyukin M.I., Stepanova T.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies