Характеристика В1-клеток в процессе экспериментального лейкомогенеза

Полный текст

Введение

Вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV) – один из наиболее распространённых патогенов молочного скота. ВLV передаётся горизонтально между животными при контакте с биологическими жидкостями, содержащими инфицированные клетки, особенно c кровью и молоком. Также инфицирование может быть связано с травмой, загрязнёнными хирургическими инструментами и насекомыми (гематофаги), которые служат механическими переносчиками вируса. Чаще всего передача происходит от матери к потомству при выпойке молозивом и молоком от коров с высокой вирусной нагрузкой. Приблизительно у 30% зараженного крупного рогатого скота (КРС) в итоге развивается стойкий лимфоцитоз (постоянно больше 7500 лимфоцитов в 1 мкл крови), который обычно не имеет очевидных клинических признаков. У 1–3% инфицированных животных развивается лимфосаркома в возрасте 4–8 лет.

Несмотря на низкую частоту развития клинических признаков у КРС, заражённого BLV, инфекция может привести к экономическим потерям в результате выбраковки высокопродуктивных молочных коров [1]. Лейкоз КРС снижает как долголетие животных, так и выработку молока, и может нарушать иммунный статус. При высокой распространённости BLV в молочных стадах важно понимать механизмы патогенеза, при которых вирус отрицательно влияет на иммунную систему заражённого животного [2]. Известно, что вирус вне клетки менее инфекционен, чем вирус, связанный с клетками крови, поскольку ВLV использует межклеточные контакты для передачи информации между инфицированными клетками и неинфицированными клетками-мишенями, которыми являются В-клетки [3][4]. Для выявления субклинического прогрессирования инфекции BLV более эффективно определение относительного количества В-клеток, нежели абсолютного количества лимфоцитов [5].

Несмотря на большое количество исследований в данной области, многие механизмы адаптивного клеточного иммунного ответа до сих пор неизвестны [6][7]. Процесс проникновения вируса в клетку пока до конца не ясен. Некоторые авторы полагают, что вирусные белки нарушают внутриклеточные сигнальные пути [8][9]. Большинство известных в настоящее время поверхностных белков суперсемейства иммуноглобулинов, в том числе трансмембранный мономер молекулы иммуноглобулина М (IgМ), являются рецепторами контактного взаимодействия клеток, которые трансформируют антигенные сигналы в определённые клеточные реакции. Связывание рецептора с его лигандом сопровождается не только изменением конфигурации поверхностного белка, но и его латеральной диффузией [10]. Топография поверхности В-клеток модулирует активацию сигнального пути. Липидные рафты играют важную роль в передаче сигнала В-клеткам, способствуя локализации В-клеточного антигенного рецептора (BCR), ограничению его подвижности и образованию сигнальных комплексов. BCR, распознавший антиген, вместе с белками главного комплекса гистосовместимости класса ІІ кластеризуется и скрепляется актиновыми нитями со стороны цитоплазмы. В результате на мембране В-клетки могут собираться рецепторы в форме «ринг» (равномерное распределение в плоскости мембраны), «пэтч» (неравномерное распределение), «кэп» (скопление на одном из полюсов клетки) с последующим погружением в цитоплазму (эндоцитоз).

В проведённых ранее экспериментах установлено, что основной формой локализации Ig-рецепторов В-клеток крови КРС является «пэтч»/эндоцитоз (68,9%) [11]. Развитие этой популяции лимфоцитов зависит от экспрессии рецептора В-клеток для антигена (BCR), сформированного из молекул IgM и CD79. Предшественники В-клеток могут впоследствии проходить продуктивную реаранжировку генов лёгких цепей, чтобы стать IgM⁺ В-клетками. В формировании рецептора В-клеток (ВCR) принимают участие три компонента: мономер IgM и два полипептида – Igα, Igβ (CD79). В цитоплазме пре-В-клеток обнаруживается тяжёлая μ-цепь IgM. Наивная В-клетка на своей поверхности экспрессирует полные молекулы данного иммуноглобулина. Циркулирующая фолликулярная и экстра-фолликулярная В-клетки также несут на своей мембране IgM.

В настоящее время обсуждаются эксперименты, показавшие, что у популяции IgM⁺ В-клеток инфицированных животных изменяется механизм передачи сигналов и они приобретают устойчивость к апоптозу, что вызывает экспансию В-клеток. Связывание антигена В-клетками инициирует диффузию BCR в мембранные микродомены, обогащённые сфинголипидами и холестерином, называемые липидными рафтами. Липидные рафты включают представителей киназ семейства Src и исключают некоторые фосфатазы. Включение BCR в липидные рафты играет важную роль в регуляции ранних сигнальных событий и последующей интернализации антигена. Известно, что BLV вызывает значительную поликлональную экспансию CD5⁺, IgM⁺ B-лимфоцитов, известных как персистирующий лимфоцитоз приблизительно у 30% заражённого КРС [12]. Однако пока не ясно, что происходит с данной субпопуляцией В-клеток в ранний период инфицирования животных. Поэтому целью исследований была количественная характеристика субпопуляций IgM+ - и CD5⁺ -В-клеток в процессе иммунного ответа на заражение BLV, которая может дать важную информацию о механизмах прайминга лимфоцитов при инфицировании BLV.

Материал и методы

В эксперименте использовали BLV-отрицательных чёрно-пёстрой породы в возрасте 8 мес (n = 11). Вся работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России от 19.06.2003 № 267 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации». Животным опытной группы (n = 8) внутривенно вводили кровь BLV-положительной коровы. Телятам контрольной группы (n = 3) вводили физиологический раствор. Исследования проводили до и после заражения на 5, 7, 14, 21, 28 и 65-е сутки иммунного ответа. Лимфоциты крови выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности Histopaque-1077 при 3000 об/минв течение 45 мин. Концентрацию мононуклеарных клеток в суспензии доводили до 1,0–0,5·106 кл/мл. Количество В-лимфоцитов в крови определяли методом иммунопероксидазного окрашивания на основе моноклональных антител к IgM CD5.

Для удаления экзогенных иммуноглобулинов 100 мкл взвеси мононуклеарных клеток крови обрабатывали 1% раствором лимонной кислоты в течение 1 мин, центрифугировали 5-кратно в фосфатном буфере (рН 7,2) при 1100 об мин по 5 мин. Взвесь клеток фиксировали этанолом на предметном стекле. Блокаду пероксидазы проводили 1% раствором перекиси водорода в течение 10 мин. В качестве блокирующего раствора использовали 10% раствор сыворотки крови лошади. Инкубировали 60 мин при комнатной температуре и тщательно отмывали клетки фосфатным буфером (рН 7,2) К фиксированным клеткам добавляли моноклональные антитела к IgM рогатого скота (1 : 400). Затем добавляли антивидовой конъюгат в рабочем разведении (1 : 1500). Для визуализации комплекса антиген/антитело использовали 3-амино-9-этилкарбазол (AEC; Sigma, США). AEC-позитивные клетки идентифицировали по красно-коричневому окрашиванию при просмотре препаратов под микроскопом (×1000). Статистическую обработку выполняли с использованием стандартных программ SPSS – Statistical package for the social sciences. Уровень значимости вариационных рядов оценивали с использованием параметрического t-критерия Стьюдента.

Результаты

В результате проведённых исследований установлено, что корреляционная связь показателей субпопуляций В-клеток с фенотипом IgM⁺ и CD5⁺ имеет среднюю степень сопряжённости (r = 0,61). Это показывает относительную независимость данных субпопуляций.

Как видно на рис. 1, уровень CD5⁺ В-клеток повышается на 14-е сутки первичного иммунного ответа, характеризующегося поликлональной пролиферацией CD5⁺ В-клеток, которые являются первичной мишенью для BLV.

Поскольку большинство CD5⁺ B-клеток содержат провирус [13][14], повышение их уровня усиливает передачу вируса через кровь от инфицированных к здоровым животным. Персистирующий лейкоцитоз также является предиктором позднего развития лимфомы, состоящей в основном из CD5⁺ B-клеток. Следовательно, повышение CD5⁺ -субпопуляции имеет решающее значение для передачи и прогрессирования лейкомогенеза.

В предыдущих исследованиях было установлено, что к 7-м суткам иммунного ответа уровень IgMспецифических антител увеличивался, а это соответствует повышению относительного количества IgM⁺ CD5⁺ В-клеток [15]. После 7-х суток субпопуляционная характеристика первичного иммунного ответа изменяется. Уровень CD5⁺ -лимфоцитов увеличивается, а относительное количество IgM⁺ В-клеток уменьшается, но к 65-м суткам опять возрастает. У КРС молекула CD5 конститутивно диссоциирует от мембранного IgM, что связано с защитой от апоптоза после передачи антигенного сигнала. Кроме того, экспериментальная диссоциация молекулы CD5 и BCR B-клеток у BLV отрицательного КРС снижает BCR-стимулированный апоптоз [16]. Возможно, что увеличение с 7-х суток иммунного ответа окрашенных анти-CD5⁺ антителами клеток не связано с В-клетками, а характеризует пролиферацию Т-клеток, так как молекула CD5 является дифференцировочным маркёром Т-лимфоцитов.

На микрофотографиях (рис. 2) показано увеличение числа IgM⁺ В-клеток на 65-е сутки после заражения по сравнению с количеством этих клеток на 5-е сутки после введения BLV, что характерно для поликлональной экспансии IgM⁺ В-клеток при лейкозе КРС.

Недавние исследования показали, что ранняя регуляция ответа BCR на антиген, вероятно, контролируется путём проникновения BCR в специфические мембранные микродомены (липидные рафты). Липидные рафты концентрируют сигнальные молекулы IgM, Igα и Igβ в непосредственной близости от ранних сигнальных киназ после стимуляции антигеном (кэппинг-эффект).

В незрелых и толерантных В-клетках с более высокой поверхностной экспрессией CD5 после стимуляции происходит исключение BCR из липидных рафтов. То же происходит при лейкомогенезе, когда вирус ограничивает транслокацию в мембране и интернализацию в цитоплазму B-клеточного рецептора, в который входит IgM.

Пространственная координация мономера IgM внутри липидных рафтов играет важную роль в регуляции сигнальных путей в клетке. В настоящее время обсуждается вопрос о том, что наблюдаемые различия в результатах передачи сигналов BCR в изменённых вирусом В-клетках КРС можно объяснить неспособностью В-клеток у КРС с персистирующим лимфоцитозом формировать плотную агрегацию IgM на плазматической мембране после стимуляции антигеном. Данные наших исследований подтверждают, что в лимфоцитах экспериментально заражённого КРС поверхностная агрегация молекул IgM и CD5 практически отсутствует (рис. 3). На микрофотографиях видно, что IgM⁺ В-клетки и CD5⁺ - клетки окрашены по периметру в форме «ринг» без кэппинг-эффекта поверхностных рецепторов.

Обсуждение

Одним из отличительных признаков лейкомогенеза у животных является спонтанная пролиферация мононуклеарных клеток периферической крови, в основном В-лимфоцитов. Результаты наших исследований показали ассоциацию экспрессии поверхностных молекул IgM и CD5 в В-клетках крови экспериментально заражённых телят до 7-х суток иммунного ответа. Данные маркёры характерны для субпопуляции В1-клеток, которая является первичной мишенью для BLV. Эти лимфоциты предназначены для быстрого реагирования на наиболее распространённые антигены клеточных стенок бактерий в прибарьерных полостях.

Естественные антитела, секретируемые В1- клетками, – это IgМ и IgА, которые играют важную роль в противоинфекционной защите организма. Антитела, продуцируемые В1-лимфоцитами, преимущественно специфичнык тимуснезависимым антигенам. По нашему мнению, именно от этой субпопуляции В-клеток зависит волнообразный характер синтеза IgM, который был показан в предыдущих исследованиях. После 7-х суток иммунного ответа показатели IgM⁺ - и CD5⁺ -клеток не коррелируют, что показывает их функциональное различие. Возможно, увеличение числа CD5⁺ -клеток связано не с В-клетками, а с дифференцирующимися под влиянием вируса Т-лимфоцитами [17][18]. Для динамики IgM⁺ В-клеток характерно как повышение, так и уменьшение их числа в течение 2 мес наблюдения, что, вероятно, связано с влиянием вирусных белков на функциональную активность инфицированной клетки. Как было установлено, включение В-клеточного рецептора, составной частью которого является трансмембранный мономер IgM, в липидные рафты играет важную роль в регуляции сигналов и последующей интернализации антигена. Вирусные белки также могут влиять на процессы, происходящие в липидных рафтах [19]. Так, исключение BCR из липидных рафтов может частично объяснить различия в передаче сигналов, наблюдаемых между В-клетками BLV-инфицированного и BLV-отрицательного КРС. Наши результаты подтверждают эти исследования. Было показано, что через 2 мес после введения BLV рецепторы IgM и CD5 равномерно распределены по мембране клетки без образования «кэпов». Возможно, BLV, замедляя диффузию рецепторов в мембране клетки, таким образом блокирует апоптоз.

Выводы

1. Увеличение количества В-клеток с фенотипом IgM⁺/CD5⁺ в 1-е сутки иммунного ответа на введение BLV показывает, что субпопуляция В1-клеток является первичной мишенью BLV.
2. Повышение уровня CD5⁺ - клеток на 14-е сутки иммунного ответа, вероятно, происходит за счёт Т-клеток в стадии дифференцировки.
3. Второй месяц иммунного ответа характеризуется экспансией IgM+ В-клеток, снижением числа CD5⁺- клеток и равномерным распределением рецепторов по периметру клеток.

Об авторах

И. Ю. Ездакова

ФГБНУ «Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук»

Автор, ответственный за переписку.
Email: ezdakova.i@viev.ru
ORCID iD: 0000-0002-8467-4920

Ездакова Ирина Юрьевна, д-р биол. наук, зав. лабораторией иммунологии.

109428, г. Москва

Россия

О. В. Капустина

ФГБНУ «Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7382-8656
109428, г. Москва Россия

М. И. Гулюкин

ФГБНУ «Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7489-6175
109428, г. Москва Россия

Т. В. Степанова

ФГБНУ «Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9092-8045
109428, г. Москва Россия

Список литературы

Дополнительные файлы