Adamantan derivatives capable of inhibiting the reproduction of a Rimantadine resistant strain of influenza A(H1N1)pdm09 virus (Influenza A virus, Alphainfluenzavirus, Orthomyxoviridae)

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Introduction. Adamantanthane-type drugs such as rimantadine and amantadine have long been used to treat diseases caused by influenza A virus. However, as a result of the mutations, influenza viruses have become resistant to aminoadamantans. The target for these drugs was the protein channel M2. Influenza A virus M2 viroporin in the protein shell forms fairly specific ion channels with a diameter of about 11 Å, specializing in transporting protons inside the viral particle (virion). Restoration of the antiviral properties of adamantanthane-type drugs consists in the selection of advanced functional groups bound by the carbocycle to find new sites of binding to the protein target M2.

The рurpose of the study is to identify the antiviral properties of new adamantanum derivatives to the pandemic strain of influenza A virus in vitro.

Material and methods. Compounds of aminoadamantans with amino acids and other organic molecules were obtained by classical peptide synthesis methods. The structure of the compound was tested by means of physical and chemical methods. Antiviral properties of synthetic compounds were studied in vitro on monolayer MDCK cells infected with pandemic strain of influenza A/California/07/2009 virus in two schemes of administration of investigated compounds and virus.

Results. The reference strain of the influenza virus A/California/07/2009(H1N1) was sensitive to the compounds under test in varying degrees. The antiviral activity of the compounds was expressed in a 50% inhibitory concentration (IС50) ranging from 0.5 to 2.5 мкM, which is generally a good indicator for the Rimantadine/Amantadine resistant strain.

Discussion. The values of the IС50 for compounds introduced two hours before contact with the virus were slightly higher than those for single-moment introduction of the substance and virus. The effect of increasing the inhibitory concentration in the prophylactic scheme of compounds was valid for all compounds of the experiment.

Conclusion. The presented synthetic compounds are active against the variant of influenza A virus resistant to Rimantadine and Amantadine preparations. The obtained compounds can be used as model structures for creation of a new drug of direct action against advanced strains of influenza A virus.

Full Text

Введение

Виропорины – это небольшие пороформирующие вирусные белки, состоящие из 50–120 аминокислотных остатков преимущественно алифатического характера, способные к образованию белковых агрегатов из нескольких (обычно от 4 до 6) полипептидных цепей [1]. Трансмембранный (ТМ) домен виропоринов взаимодействует с липидным матриксом мембраны, олигомеризуется и образует гидрофильные поры. Олигомерные поры виропоринов способны к направленному и селективному ионному транспорту через вирусные и клеточные мембраны. В настоящее время наиболее изучены виропорины РНК-содержащих вирусов: вируса иммунодефицита человека 1-го типа – vpu, вируса гепатита С – p7, вируса гриппа А – M2 [2].

Виропорин М2 в белковой оболочке вируса гриппа А образует достаточно специфичные ионные каналы диаметром около 11 Å, специализирующиеся на транспорте протонов внутрь вирусной частицы (вириона). Протоны, попавшие внутрь вириона, понижают pH внутренней среды, что приводит к диссоциации комплекса матриксного белка М1 с рибонуклеопротеином и, как следствие, к высвобождению вирусной РНК в цитоплазму клетки хозяина. Наиболее важную роль в транспорте протонов через канал М2 играют аминокислотные остатки гистидина (His37) и триптофана (Trp41) в ТМ-домене [3][4].

Оболочечный протеин М2 вируса гриппа А является мишенью для противогриппозных коммерческих препаратов, таких как «Амантадин» (1-аминоадамантан гидрохлорид) и «Римантадин» (1-(1-адамантил)-этиламин гидрохлорид) [5].

Как утверждают некоторые источники, ингибирующее действие молекул римантадина и амантадина тесно связано с необходимостью образования водородной связи между аминоадамантаном и гидроксильной группой остатка серина в 31-м положении на внутренней поверхности канала М2 [3]. Однако ряд исследований показывает, что данное взаимодействие необязательно для закрепления ингибитора в поре канала [6]. Можно предположить, что введение в молекулу дополнительных функционально активных групп поможет расширить противовирусные свойства препаратов адамантанового ряда. Новые соединения в процессе взаимодействия с ТМ-доменом могли нарушать процесс транспорта ионов водорода через мембрану вируса. Аминокислоты обладают достаточно широким спектром боковых групп, которые могут привнести необходимые свойства будущей молекуле ингибитора. Более того, использование пептидов и некоторых других биологических молекул, введённых в адамантановый карбоцикл методами пептидного синтеза, может в значительной мере расширить поиск наиболее подходящего блокатора канала М2 вируса гриппа [7].

Ингибиторы М2 можно разделить на две группы. Первая включает соединения, содержащие карбоцикл адамантана, – амантадин, римантадин и их гидроксилированные производные. Вторая группа включает производные, содержащие вместо адамантана гетероциклические алканы, спиросопряжённые мультициклические алканы и силаны [8][9]. Эти соединения специально разработаны для преодоления некоторых важных мутаций в ионном канале М2 вируса гриппа А, таких как V27A и L26F [9][10].

На данный момент нельзя предсказать, в каких рамках могут происходить мутации аминокислотной последовательности полипептида М2, не нарушающие его транспортной функции, но стоит отметить, что они не безграничны. Предложенная стратегия восстановления противовирусных свойств может в значительной мере перекрыть спектр этих мутаций, исключая возникновение резистентных штаммов в ближайшее время.

Материал и методы

Рассматриваемые соединения были получены по методикам, описанным нами ранее [11][12]. Синтезированы семь модельных производных аминоадаманатана с аминокислотами и некоторыми другими биологически активными заместителями: N-(1-адамантилэтил)-3-(тиофен-2-ил)-проп-2-енамид (I); N-(1-адамантил)-3-(тиофен-2-ил)-проп-2-енамид (II); N-(1- адамантил)-4-(тиофен-2-ил)-бутанамид (III); гидрохлорид метионил(диоксид)-(1 адамантилэтил)амид (IV); трет-бутилоксикарбонил метионил(диоксид)-(1-адамантилэтил)амид (V); бензилоксикарбонил-L-триптофанил-1-адамантил-этиламид (VI); хинальдин-2- оил-l-аланил-l-пролил-(1-адамантилэтил)амид (VII).

Структурные формулы тестируемых соединений представлены на рисунке.

Вирус. В работе использовали пандемический штамм вируса гриппа A(H1N1)pdm09: эталонный А/California/07/2009, полученный из Центров по контролю и профилактике заболеваний (Атланта, США), резистентный к действию римантадина и амантадина.

Противовирусную активность синтезированных соединений изучали по снижению репродукции вируса в культуре клеток MDCK с детекцией результатов методом иммуноферментного анализа, как это было описано ранее [13][14]. В двух схемах введения: за 2 ч до внесения вируса (профилактическая схема) и одномоментно с вирусом.

Результаты

В таблице представлены 50% ингибирующие дозы (ИД50) синтезированных соединений в микромолярной (мкМ) концентрации, при которых погибает 50% клеток монослоя, а также 50% цитотоксические дозы (ЦД50), т. е. концентрации соединения, при которых погибает 50% клеток монослоя от действия соединений без вируса. Результаты, показанные в этих опытах, соответствовали нормальному распределению.

Из данных таблицы видно, что эталонный штамм вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) был в разной мере чувствителен к тестируемым соединениям. При использовании соединений I, II и III, содержащих остатки тиенилкарбоновых кислот, отмечен выраженный эффект ингибирования репродукции вируса гриппа A/California/07/2009, устойчивого к действию римантадина. При одномоментном внесении на монослой клеток MDCK веществ и вируса ИД50 для соединения I составила 2,38 мкМ, а для III ИД50 – 2,26 мкМ. Среди адамантановых производных тиенилкарбоновых кислот наиболее активным было соединение II, ИД50 которого составила 0,9 мкМ. Интересен тот факт, что в отличие от соединения I, в котором в качестве гидрофобного компонента выступает 1-(1-адамантил)этиламин, в соединении II был использован его более простой гомолог 1-адамантиламин (см. рисунок). В профилактической схеме введения соединений I, II и III за 2 ч до заражения монослоя клеток ингибирующая активность превысила 2,0 мкМ. Эффект увеличения ингибирующей концентрации в профилактической схеме был справедлив для всех остальных соединений эксперимента.

Среди соединений 1-(1-адамантил)этиламина с остатком метионинсульфона (IV и V) при одномоментном внесении соединений и вируса на монослой клеток наибольший противовирусный эффект оказывало соединение V с Boc блокированной аминогруппой (ИД50 составила 0,56 мкМ). При деблокировании аминогруппы соединения V было получено соединение IV со свободной аминогруппой метионинсульфона в виде гидрохлорида. ИД50 полученного соединения составила 1,89 мкМ. В профилактической схеме ИД50 для соединения V составила 1,69 мкМ, а для IV – 3,50 мкМ.

Для триптофансодержащего соединения VI ИД50 в одномоментной схеме внесения составила 1,02 мкМ, а для профилактической схемы – менее 1,40 мкМ.

Производное VII было эффективно в одномоментной схеме внесения (ИД50 составила 0,74 мкМ). В профилактической схеме ингибирующая концентрация была достигнута при 2,78 мкМ.

Активность синтетических соединений в отношении штаммов вируса гриппа A/California/07/2009
Activity of synthetic compounds with respect to influenza virus strains A/California/07/2009

 

Структуры соединений адамантана с аминокислотами и другими заместителями.
Structures of adamantanine compounds with amino acids and other derivatives.

Обсуждение

Эффект увеличения значения ингибирующей концентрации в профилактической схеме внесения соединений был справедлив почти для всех предложенных соединений. Это связано с предполагаемым механизмом их действия, который подразумевает блокировку функции канала М2 вируса гриппа А. В качестве функциональных групп были выбраны не только аминокислоты и пептиды, но и тиенилкарбоновые кислоты и 2-хинальдинкарбоновая кислота, которые были использованы в качестве источника функциональной гетероароматической группы. Многие исследователи полагают, что протонный канал можно рассматривать как ахиллесову пяту вируса гриппа [15]. Предложенный нами способ модернизации молекул аминоадамантанового ряда позволил преодолеть резистентность штаммов вируса гриппа A(H1N1)pdm09, которые с момента их циркуляции среди людей несли специфическую замену в белке М2, ответственную за низкую противовирусную активность римантадина и амантадина.

Заключение

Полученные соединения могут быть использованы в качестве модельных структур для создания нового препарата прямого действия против современных штаммов вируса гриппа А. На сегодняшний день это имеет большое практическое значение, учитывая очень ограниченный спектр противовирусных препаратов с прямым действием на вирус гриппа, а также возможность его производства в Российской Федерации.

×

About the authors

T. M. Garaev

National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya

Author for correspondence.
Email: tmgaraev@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3651-5730

Timur M. Garaev, PhD, Lead Researcher of the laboratory of molecular diagnostics.

Moscow, 123098

Russian Federation

A. I. Odnovorov

Russian Peoples’ Friendship University of Russia

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9355-2522
Moscow, 117198 Russian Federation

E. S. Kirillova

National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7977-7530
Moscow, 123098 Russian Federation

E. I. Burtseva

National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-2518-6801
Moscow, 123098 Russian Federation

M. P. Finogenova

National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3611-3897
Moscow, 123098 Russian Federation

E. A. Mukasheva

National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5688-5309
Moscow, 123098 Russian Federation

T. V. Grebennikova

National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6141-9361
Moscow, 123098 Russian Federation

References

  1. Андреева-Ковалевская Ж.И., Солонин А.С., Синева Е.В., Терновский В.И. Пороформирующие белки и адаптация организмов к условиям окружающей среды. Успехи биологической химии. 2008; 48: 267-318.
  2. Palese P., Shaw M.L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. In: Knipe D.M., Howley P.M., eds. Fields Virology. Volume 2. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2007: 1647-89.
  3. Cheng J., Zhu W., Wang Y., Yan X., Li Z., Tang Y., et al. The openclose mechanism of M2 channel protein in influenza A virus: A computational study on the hydrogen bonds and cation-π interactions among His37 and Trp41. Sci. China Ser. B-Chem. 2008; 51: 755-68. http://doi.org/10.1007/s11426-008-0087-3
  4. Tang Y., Zaitseva F., Lamb R.A., Pinto L.H. The gate of the influenza virus M2 proton channel is formed by a single tryptophan residue. J. Biol. Chem. 2002; 277(42): 39880-6. http://doi.org/10.1074/jbc.M206582200
  5. Deyde V.M., Xu X., Bright R.A., Shaw M., Smith C.B., Zhang Y., et al. Surveillance of resistance to adamantanes among influenza A(H3N2) and A(H1N1) viruses isolated worldwide. J. Infect. Dis. 2007; 196(2): 249-57. http://doi.org/10.1086/518936
  6. Pielak R.M., Schnell J.R., Chou J.J. Mechanism of drug inhibition and drug resistance of influenza A M2 channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106(18): 7379-84. http://doi.org/10.1073/pnas.0902548106
  7. Shibnev V.A., Garaev T.M., Finogenova M.P., Shevchenko E.S., Burtseva E.I. New adamantane derivatives can overcome resistance of influenza A(H1N1)pdm2009 and A(H3N2) viruses to remantadine. Bull. Exp. Biol. Med. 2012; 153(2): 233-5. http://doi.org/10.1007/s10517-012-1684-x
  8. Hu W., Zeng S., Li C., Jie Y., Li Z., Chen L. Identification of hits as matrix-2 protein inhibitors through the focused screening of a small primary amine library. J. Med. Chem. 2010; 53(9): 3831-4. http://doi.org/10.1021/jm901664a
  9. Wang J., Ma C., Balannik V., Pinto L.H., Lamb R.A., Degrado W.F. Exploring the Requirements for the Hydrophobic Scaffold and Polar Amine in inhibitors of M2 from Influenza A Virus. ACS Med. Chem. Lett. 2011; 2(4): 307-12. http://doi.org/10.1021/ml100297w
  10. Wang J., Ma C., Fiorin G., Carnevale V., Wang T., Hu F., et al. Molecular dynamics simulation directed rational design of inhibitors targeting drug-resistant mutants of influenza A virus M2. J. Am. Chem. Soc. 2011; 133(32): 12834-41. http://doi.org/10.1021/ja204969m
  11. Шибнев В.А., Дерябин П.Г., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Ботиков А.Г., Мишин Д.В. Пептидные производные карбоциклов как ингибиторы функции виропоринов РНК-содержащих вирусов. Биоорганическая химия. 2017; 43(5): 491-500. http://doi.org/10.7868/S0132342317050153
  12. Шибнев В.А., Дерябин П.Г., Бурцева Е.И., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Кириллова Е.С. и др. Адамантиламиды серосодержащих кислот и их противогриппозная активность. Патент RF №2617850; 2015.
  13. Бурцева Е.И., Шевченко Е.С., Ленева И.А., Меркулова Л.Н., Оскерко Т.А., Шляпникова О.В. и др. Чувствительность к ремантадину и арбидолу вирусов гриппа, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в России в сезоне 2004-2005 гг. Вопросы вирусологии. 2007; 52(2): 24-9.
  14. Лeнeвa И.A., Фадеева Н.И., Федякина И.T., Гуськова Т.А., Христова М.Л., Соколова М.В. Применение иммуноферментной индикации вирусспецифических антигенов в изучении нового противовирусного препарата. Химико-фармацевтический журнал. 1994; 28(9): 4-15.
  15. Cady S.D., Wang T., Hong M. Membrane-dependent effects of a cytoplasmic helix on the structure and drug binding of the influenza virus M2 protein. J. Am. Chem. Soc. 2011; 133(30): 11572-9. http://doi.org/10.1021/ja202051n

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2020 Garaev T.M., Odnovorov A.I., Kirillova E.S., Burtseva E.I., Finogenova M.P., Mukasheva E.A., Grebennikova T.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies