Производные адамантана, способные ингибировать репродукцию резистентного к римантадину штамма вируса гриппа А(H1N1)pdm09 (Influenza A virus, Alphainfluenzavirus, Orthomyxoviridae)

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Соединения адамантанового ряда, такие как римантадин и амантадин, долгое время применяли для лечения заболеваний, вызванных вирусом гриппа А. Однако в результате возникших мутаций вирусы гриппа приобрели резистентность к аминоадамантанам. Мишенью для этих препаратов служил белковый канал М2. Виропорин М2 в белковой оболочке вируса гриппа А образует достаточно специфичные ионные каналы диаметром около 11 Å, специализирующиеся на транспорте ионов водорода внутрь вирусной частицы (вириона). Восстановление противовирусных свойств препаратов адамантанового ряда заключается в подборе дополнительных функциональных групп, связанных карбоциклом, для поиска новых сайтов связывания с белком мишенью М2.

Цель исследования – выявление противовирусных свойств адамантановых производных в отношении пандемического штамма вируса гриппа А in vitro.

Материал и методы. Соединения аминоадамантанов с аминокислотами и другими органическими молекулами были получены методами классического пептидного синтеза. Структура соединения подтверждена современными физико-химическими методами. Противовирусные свойства синтетических соединений были изучены in vitro на монослое клеток MDCK, инфицированных пандемическим штаммом вируса гриппа А/California/07/2009 в двух схемах введения исследуемых соединений и вируса.

Результаты. Эталонный штамм вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) был в разной мере чувствителен к тестируемым соединениям. Противовирусную активность соединений выражали в виде 50% ингибирующей дозы (ИД50), которая составила от 0,5 до 2,5 мкМ, что в целом неплохой показатель в отношении штамма, резистентного к римантадину/амантадину.

Обсуждение. ИД50 для соединений, вносимых за 2 ч до контакта с вирусом, была несколько выше, чем при одномоментном внесении вещества и вируса. Эффект увеличения ингибирующей концентрации в профилактической схеме внесения соединений был справедлив для всех соединений эксперимента.

Заключение. Представленные синтетические соединения активны в отношении варианта вируса гриппа А, резистентного к римантадину и амантадину. Полученные соединения могут быть использованы в качестве модельных структур для создания нового препарата прямого действия против современных штаммов вируса гриппа А.

Полный текст

Введение

Виропорины – это небольшие пороформирующие вирусные белки, состоящие из 50–120 аминокислотных остатков преимущественно алифатического характера, способные к образованию белковых агрегатов из нескольких (обычно от 4 до 6) полипептидных цепей [1]. Трансмембранный (ТМ) домен виропоринов взаимодействует с липидным матриксом мембраны, олигомеризуется и образует гидрофильные поры. Олигомерные поры виропоринов способны к направленному и селективному ионному транспорту через вирусные и клеточные мембраны. В настоящее время наиболее изучены виропорины РНК-содержащих вирусов: вируса иммунодефицита человека 1-го типа – vpu, вируса гепатита С – p7, вируса гриппа А – M2 [2].

Виропорин М2 в белковой оболочке вируса гриппа А образует достаточно специфичные ионные каналы диаметром около 11 Å, специализирующиеся на транспорте протонов внутрь вирусной частицы (вириона). Протоны, попавшие внутрь вириона, понижают pH внутренней среды, что приводит к диссоциации комплекса матриксного белка М1 с рибонуклеопротеином и, как следствие, к высвобождению вирусной РНК в цитоплазму клетки хозяина. Наиболее важную роль в транспорте протонов через канал М2 играют аминокислотные остатки гистидина (His37) и триптофана (Trp41) в ТМ-домене [3][4].

Оболочечный протеин М2 вируса гриппа А является мишенью для противогриппозных коммерческих препаратов, таких как «Амантадин» (1-аминоадамантан гидрохлорид) и «Римантадин» (1-(1-адамантил)-этиламин гидрохлорид) [5].

Как утверждают некоторые источники, ингибирующее действие молекул римантадина и амантадина тесно связано с необходимостью образования водородной связи между аминоадамантаном и гидроксильной группой остатка серина в 31-м положении на внутренней поверхности канала М2 [3]. Однако ряд исследований показывает, что данное взаимодействие необязательно для закрепления ингибитора в поре канала [6]. Можно предположить, что введение в молекулу дополнительных функционально активных групп поможет расширить противовирусные свойства препаратов адамантанового ряда. Новые соединения в процессе взаимодействия с ТМ-доменом могли нарушать процесс транспорта ионов водорода через мембрану вируса. Аминокислоты обладают достаточно широким спектром боковых групп, которые могут привнести необходимые свойства будущей молекуле ингибитора. Более того, использование пептидов и некоторых других биологических молекул, введённых в адамантановый карбоцикл методами пептидного синтеза, может в значительной мере расширить поиск наиболее подходящего блокатора канала М2 вируса гриппа [7].

Ингибиторы М2 можно разделить на две группы. Первая включает соединения, содержащие карбоцикл адамантана, – амантадин, римантадин и их гидроксилированные производные. Вторая группа включает производные, содержащие вместо адамантана гетероциклические алканы, спиросопряжённые мультициклические алканы и силаны [8][9]. Эти соединения специально разработаны для преодоления некоторых важных мутаций в ионном канале М2 вируса гриппа А, таких как V27A и L26F [9][10].

На данный момент нельзя предсказать, в каких рамках могут происходить мутации аминокислотной последовательности полипептида М2, не нарушающие его транспортной функции, но стоит отметить, что они не безграничны. Предложенная стратегия восстановления противовирусных свойств может в значительной мере перекрыть спектр этих мутаций, исключая возникновение резистентных штаммов в ближайшее время.

Материал и методы

Рассматриваемые соединения были получены по методикам, описанным нами ранее [11][12]. Синтезированы семь модельных производных аминоадаманатана с аминокислотами и некоторыми другими биологически активными заместителями: N-(1-адамантилэтил)-3-(тиофен-2-ил)-проп-2-енамид (I); N-(1-адамантил)-3-(тиофен-2-ил)-проп-2-енамид (II); N-(1- адамантил)-4-(тиофен-2-ил)-бутанамид (III); гидрохлорид метионил(диоксид)-(1 адамантилэтил)амид (IV); трет-бутилоксикарбонил метионил(диоксид)-(1-адамантилэтил)амид (V); бензилоксикарбонил-L-триптофанил-1-адамантил-этиламид (VI); хинальдин-2- оил-l-аланил-l-пролил-(1-адамантилэтил)амид (VII).

Структурные формулы тестируемых соединений представлены на рисунке.

Вирус. В работе использовали пандемический штамм вируса гриппа A(H1N1)pdm09: эталонный А/California/07/2009, полученный из Центров по контролю и профилактике заболеваний (Атланта, США), резистентный к действию римантадина и амантадина.

Противовирусную активность синтезированных соединений изучали по снижению репродукции вируса в культуре клеток MDCK с детекцией результатов методом иммуноферментного анализа, как это было описано ранее [13][14]. В двух схемах введения: за 2 ч до внесения вируса (профилактическая схема) и одномоментно с вирусом.

Результаты

В таблице представлены 50% ингибирующие дозы (ИД50) синтезированных соединений в микромолярной (мкМ) концентрации, при которых погибает 50% клеток монослоя, а также 50% цитотоксические дозы (ЦД50), т. е. концентрации соединения, при которых погибает 50% клеток монослоя от действия соединений без вируса. Результаты, показанные в этих опытах, соответствовали нормальному распределению.

Из данных таблицы видно, что эталонный штамм вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) был в разной мере чувствителен к тестируемым соединениям. При использовании соединений I, II и III, содержащих остатки тиенилкарбоновых кислот, отмечен выраженный эффект ингибирования репродукции вируса гриппа A/California/07/2009, устойчивого к действию римантадина. При одномоментном внесении на монослой клеток MDCK веществ и вируса ИД50 для соединения I составила 2,38 мкМ, а для III ИД50 – 2,26 мкМ. Среди адамантановых производных тиенилкарбоновых кислот наиболее активным было соединение II, ИД50 которого составила 0,9 мкМ. Интересен тот факт, что в отличие от соединения I, в котором в качестве гидрофобного компонента выступает 1-(1-адамантил)этиламин, в соединении II был использован его более простой гомолог 1-адамантиламин (см. рисунок). В профилактической схеме введения соединений I, II и III за 2 ч до заражения монослоя клеток ингибирующая активность превысила 2,0 мкМ. Эффект увеличения ингибирующей концентрации в профилактической схеме был справедлив для всех остальных соединений эксперимента.

Среди соединений 1-(1-адамантил)этиламина с остатком метионинсульфона (IV и V) при одномоментном внесении соединений и вируса на монослой клеток наибольший противовирусный эффект оказывало соединение V с Boc блокированной аминогруппой (ИД50 составила 0,56 мкМ). При деблокировании аминогруппы соединения V было получено соединение IV со свободной аминогруппой метионинсульфона в виде гидрохлорида. ИД50 полученного соединения составила 1,89 мкМ. В профилактической схеме ИД50 для соединения V составила 1,69 мкМ, а для IV – 3,50 мкМ.

Для триптофансодержащего соединения VI ИД50 в одномоментной схеме внесения составила 1,02 мкМ, а для профилактической схемы – менее 1,40 мкМ.

Производное VII было эффективно в одномоментной схеме внесения (ИД50 составила 0,74 мкМ). В профилактической схеме ингибирующая концентрация была достигнута при 2,78 мкМ.

Активность синтетических соединений в отношении штаммов вируса гриппа A/California/07/2009
Activity of synthetic compounds with respect to influenza virus strains A/California/07/2009

 

Структуры соединений адамантана с аминокислотами и другими заместителями.
Structures of adamantanine compounds with amino acids and other derivatives.

Обсуждение

Эффект увеличения значения ингибирующей концентрации в профилактической схеме внесения соединений был справедлив почти для всех предложенных соединений. Это связано с предполагаемым механизмом их действия, который подразумевает блокировку функции канала М2 вируса гриппа А. В качестве функциональных групп были выбраны не только аминокислоты и пептиды, но и тиенилкарбоновые кислоты и 2-хинальдинкарбоновая кислота, которые были использованы в качестве источника функциональной гетероароматической группы. Многие исследователи полагают, что протонный канал можно рассматривать как ахиллесову пяту вируса гриппа [15]. Предложенный нами способ модернизации молекул аминоадамантанового ряда позволил преодолеть резистентность штаммов вируса гриппа A(H1N1)pdm09, которые с момента их циркуляции среди людей несли специфическую замену в белке М2, ответственную за низкую противовирусную активность римантадина и амантадина.

Заключение

Полученные соединения могут быть использованы в качестве модельных структур для создания нового препарата прямого действия против современных штаммов вируса гриппа А. На сегодняшний день это имеет большое практическое значение, учитывая очень ограниченный спектр противовирусных препаратов с прямым действием на вирус гриппа, а также возможность его производства в Российской Федерации.

×

Об авторах

Т. М. Гараев

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: tmgaraev@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3651-5730

Гараев Тимур Мансурович, канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики.

123098, г. Москва

Россия

А. И. Одноворов

ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9355-2522
117198, г. Москва Россия

Е. С. Кириллова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7977-7530
123098, г. Москва Россия

Е. И. Бурцева

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-2518-6801
123098, г. Москва Россия

М. П. Финогенова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3611-3897
123098, г. Москва Россия

Е. А. Мукашева

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5688-5309
123098, г. Москва Россия

Т. В. Гребенникова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6141-9361
123098, г. Москва Россия

Список литературы

  1. Андреева-Ковалевская Ж.И., Солонин А.С., Синева Е.В., Терновский В.И. Пороформирующие белки и адаптация организмов к условиям окружающей среды. Успехи биологической химии. 2008; 48: 267-318.
  2. Palese P., Shaw M.L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. In: Knipe D.M., Howley P.M., eds. Fields Virology. Volume 2. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2007: 1647-89.
  3. Cheng J., Zhu W., Wang Y., Yan X., Li Z., Tang Y., et al. The openclose mechanism of M2 channel protein in influenza A virus: A computational study on the hydrogen bonds and cation-π interactions among His37 and Trp41. Sci. China Ser. B-Chem. 2008; 51: 755-68. http://doi.org/10.1007/s11426-008-0087-3
  4. Tang Y., Zaitseva F., Lamb R.A., Pinto L.H. The gate of the influenza virus M2 proton channel is formed by a single tryptophan residue. J. Biol. Chem. 2002; 277(42): 39880-6. http://doi.org/10.1074/jbc.M206582200
  5. Deyde V.M., Xu X., Bright R.A., Shaw M., Smith C.B., Zhang Y., et al. Surveillance of resistance to adamantanes among influenza A(H3N2) and A(H1N1) viruses isolated worldwide. J. Infect. Dis. 2007; 196(2): 249-57. http://doi.org/10.1086/518936
  6. Pielak R.M., Schnell J.R., Chou J.J. Mechanism of drug inhibition and drug resistance of influenza A M2 channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106(18): 7379-84. http://doi.org/10.1073/pnas.0902548106
  7. Shibnev V.A., Garaev T.M., Finogenova M.P., Shevchenko E.S., Burtseva E.I. New adamantane derivatives can overcome resistance of influenza A(H1N1)pdm2009 and A(H3N2) viruses to remantadine. Bull. Exp. Biol. Med. 2012; 153(2): 233-5. http://doi.org/10.1007/s10517-012-1684-x
  8. Hu W., Zeng S., Li C., Jie Y., Li Z., Chen L. Identification of hits as matrix-2 protein inhibitors through the focused screening of a small primary amine library. J. Med. Chem. 2010; 53(9): 3831-4. http://doi.org/10.1021/jm901664a
  9. Wang J., Ma C., Balannik V., Pinto L.H., Lamb R.A., Degrado W.F. Exploring the Requirements for the Hydrophobic Scaffold and Polar Amine in inhibitors of M2 from Influenza A Virus. ACS Med. Chem. Lett. 2011; 2(4): 307-12. http://doi.org/10.1021/ml100297w
  10. Wang J., Ma C., Fiorin G., Carnevale V., Wang T., Hu F., et al. Molecular dynamics simulation directed rational design of inhibitors targeting drug-resistant mutants of influenza A virus M2. J. Am. Chem. Soc. 2011; 133(32): 12834-41. http://doi.org/10.1021/ja204969m
  11. Шибнев В.А., Дерябин П.Г., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Ботиков А.Г., Мишин Д.В. Пептидные производные карбоциклов как ингибиторы функции виропоринов РНК-содержащих вирусов. Биоорганическая химия. 2017; 43(5): 491-500. http://doi.org/10.7868/S0132342317050153
  12. Шибнев В.А., Дерябин П.Г., Бурцева Е.И., Гараев Т.М., Финогенова М.П., Кириллова Е.С. и др. Адамантиламиды серосодержащих кислот и их противогриппозная активность. Патент RF №2617850; 2015.
  13. Бурцева Е.И., Шевченко Е.С., Ленева И.А., Меркулова Л.Н., Оскерко Т.А., Шляпникова О.В. и др. Чувствительность к ремантадину и арбидолу вирусов гриппа, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в России в сезоне 2004-2005 гг. Вопросы вирусологии. 2007; 52(2): 24-9.
  14. Лeнeвa И.A., Фадеева Н.И., Федякина И.T., Гуськова Т.А., Христова М.Л., Соколова М.В. Применение иммуноферментной индикации вирусспецифических антигенов в изучении нового противовирусного препарата. Химико-фармацевтический журнал. 1994; 28(9): 4-15.
  15. Cady S.D., Wang T., Hong M. Membrane-dependent effects of a cytoplasmic helix on the structure and drug binding of the influenza virus M2 protein. J. Am. Chem. Soc. 2011; 133(30): 11572-9. http://doi.org/10.1021/ja202051n

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Гараев Т.М., Одноворов А.И., Кириллова Е.С., Бурцева Е.И., Финогенова М.П., Мукашева Е.А., Гребенникова Т.В., 2020

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах