Antibodies against VP3 protein of echovirus 30 (Picornaviridae: Enterovirus: Enterovirus betacoxsackie) neutralize virus in vitro

Cover Image


Cite item

Full Text

Abstract

Introduction. The widespread occurrence of enterovirus echovirus 30 (E30) and cases of severe disease indicate the need for vaccine development. Epitopes for neutralizing antibodies and T-cell response have been found in VP3 proteins of some enteroviruses. However, the immunogenic properties of VP3 E30 have not been studied. The aim of this work is to characterize the immunogenic properties of VP3 E30 and testing the virus-neutralizing properties of antibodies against VP3 E30.

Materials and methods. VP3E30 and the chimeric protein SN-VP3E30, consisting of the S region of norovirus VP1 and VP3 E30 were expressed in Escherichia coli. SN-VP3E30 was used to form virus-like particles (VLPs). The effect on human dendritic cells (DCs) was assessed by flow cytometry to measure changes in HLA-DR, CCR7, CD80, CD83 and CD86 expression. BALB/c mice and guinea pig were used for immunization with SN-VP3E30. Antibody titers and avidity were determined by ELISA. The interaction of antibodies with VP3 E30 was studied by immunoelectron microscopy and virus neutralization in embryonal rhabdomyosarcoma (RD) cell culture.

Results. Recombinant VP3 E30 caused incomplete DCs maturation, characterized by the understimulation of the CCR7 chemokine receptor expression. Inclusion of VP3 in the chimeric VLPs resulted in complete DCs maturation and a strong humoral immune response in laboratory animals. Antibodies against VP3 were characterized by high avidity, the ability to induce agglomeration of viral particles and neutralization of E30 in RD cell culture.

Conclusion. The obtained results indicate that VP3 can be used as an antigen in the composition of a subunit vaccine against enterovirus E30.

Full Text

Введение

Echovirus 30 (E30), являющийся одним из представителей вида Enterovirus betacoxsackie (Enterovirus B), широко распространен по всему миру и представляет серьезную проблему для здравоохранения [1]. Вирус Е30 является нейротропным, инфицирование может проявляться в форме менингита реже менингоэнцефалита, энцефалита или системного заболевания. Наиболее часто E30 детектируется при вирусном менингите у детей и у лиц с ослабленным иммунитетом [2]. У инфицированных пациентов отмечаются сильные приступы мигрени, высокая температура, светобоязнь и другие клинические проявления. Обследование детей с вызванным E30 менингитом показало, что инфицирование ассоциируется с нарушениями регионарного кровотока, вероятно связанными с цереброваскулярным воспалением [3]. Энтеровирус Е30 является частой причиной вспышек и подъемов заболеваемости менингитом. В Европе в 2015–2018 гг. Е30 составил 14,5% всех подтвержденных случаев энтеровирусной инфекции [4]. Имеются сообщения о том, что Е30 генетически разнообразен. Филогенетический анализ на основе нуклеотидных последовательностей гена капсидного белка VP1 показал существование 8 монофилетических групп или линий вируса [5]. Таким образом, широкая распространенность и случаи тяжелого течения болезни указывают на необходимость разработки средств иммунопрофилактики E30-инфекции.

Вирус Е30, как и другие энтеровирусы, имеет мелкие безоболочечные вирионы, поверхность капсида которых образована тремя белками – VP1, VP2 и VP3. Взаимодействие этих белков между собой приводит к образованию участка связывания вируса с рецептором клетки. Наиболее исследованным у энтеровирусов является белок VP1, в котором обнаружено множество линейных эпитопов для нейтрализующих вирус антител. Это определяет выбор большинства исследователей в пользу VP1 для создания вакцин против энтеровирусов [6]. Свойства других поверхностных белков Е30 изучены недостаточно. На примере полиовируса было показано, что VP3 проявлял более выраженную способность к проникновению в головной мозг через гематоэнцефалический барьер по сравнению с VP1 [7]. Установлено, что VP3 Enterovirus D68 играет ключевую роль в подавлении врожденного иммунитета хозяина, блокируя синтез интерферонов I типа [8]. В структуре VP3 некоторых энтеровирусов найдены эпитопы для нейтрализующих антител [9–11] и Т-клеточного ответа [12]. Это указывает на возможность использования белка VP3 энтеровирусов в качестве антигена для разработки вакцин или терапевтической мишени. Однако иммуногенные свойства VP3 E30 не изучены.

Цель исследования – характеристика иммуногенных свойств VP3 E30.

Материалы и методы

В работе использовали нуклеотидную последовательность VP3 Echovirus 30 isolate NSW-V46-2008-ECHO30 (GenBank № MF678335.1). Для успешной экспрессии в Escherichia coli проводили оптимизацию кодонов с использованием информации, представленной в базе данных Codon usage database (http://www.kazusa.or.jp/codon/). ДНК синтезировали в ООО «Люмипроб РУС» (Россия). Рекомбинантный VP3E30 получали, как описано ранее [13]. Для повышения иммуногенности VP3 Е30 объединяли в одну молекулу с последовательностью, кодирующей S и шарнирный регионы VP1 норовируса (SN-VP3E30), как описано ранее [14]. Белок SN-VP3E30 экспрессировали в E. coli Rosetta 2 (DE3) (Novagen, США) и очищали с использованием IMAC Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, Швеция) в денатурирующих условиях. Для формирования вирусоподобных частиц (ВпЧ) проводили диализ против 1000 объемов буферного раствора, содержащего 50 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 20% сахарозы, pH 7,5. Для удаления эндотоксинов применяли Detoxi-Gel (Pierce) в соответствии с рекомендациями производителя и стерилизовали фильтрованием с диаметром пор 0,45 мкм.

Получение антисывороток. Самок 25 мышей линии BALB/c (возраст 8 нед, масса 18–20 г) дважды иммунизировали внутрибрюшинно с интервалом 2 нед. Для иммунизации 1-й группы (10 мышей) использовали 500 мкл раствора, содержащего 10 мкг белка SN-VP3E30, 50 мМ трис-HСl рН 7,5, 150 мМ NaCl и 20% глюкозы; 2-ю группу (10 мышей) иммунизировали 500 мкл раствора, содержащего 10 мкг белка SN-VP3E30, 100 мкг Al(OH)3 («ИмБио», Россия), 50 мМ трис-HСl рН 7,5, 150 мМ NaCl и 20% глюкозы. Контрольную группу (5 мышей) иммунизировали введением 500 мкл буферного раствора (50 мМ трис-HСl рН 7,5, 150 мМ NaCl и 20% глюкозы). Через 21 сут после второй иммунизации у мышей забирали кровь, готовили сыворотку крови и хранили при −70 °С.

Самку морской свинки (Cavia porcellus) (возраст 9 мес, масса 700 г) иммунизировали подкожно дважды с интервалом 2 нед. Для каждой иммунизации использовали 1 мл раствора, содержащего 500 мкг белка SN-VP3E30, 5 мг Al(OH)3, 50 мМ трис-HСl рН 7,5, 150 мМ NaCl и 20% глюкозы. Через 21 сут после второй иммунизации у животного забирали кровь, готовили сыворотку крови и хранили при −70 °С. Для получения фракции иммуноглобулинов класса G из сыворотки крови использовали метод высаливания сульфатом аммония.

Иммуноферментный анализ. Обнаружение антител против VP3 E30 и определение индекса авидности антител проводили, как описано ранее [13], с небольшими изменениями. Для обнаружения антител в сыворотке крови мыши использовали конъюгированные с пероксидазой хрена антитела козы к суммарным иммуноглобулинам мыши (ИМТЕК, Россия) и антитела против мышиных иммуноглобулинов класса M (IgM) (Elabscience, Китай). Для выявления антител против VP3 E30 у морской свинки применяли белок А, меченный пероксидазой хрена (ФГУН НИИЭМ им. Пастера, Россия).

Электронная микроскопия. Для получения микрофотографий ВпЧ использовали трансмиссионную электронную микроскопию. На медную сетку, покрытую парлодиевой пленкой-подложкой, наносили 5 мкл раствора белка в концентрации 100 мкг/мл, инкубировали в течение 5 мин, отмывали водой от несвязавшихся компонентов и окрашивали водным раствором 2% уранилацетата (рН 4,5) в течение 20 с. Образцы анализировали с помощью просвечивающего электронного микроскопа НТ7700 (Hitachi, Япония).

При оценке способности антител против SN-VP3E30 взаимодействовать с вирионами Е30 в качестве источника энтеровируса использовали фекалии двух больных, в которых методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией были обнаружены Е30 с генотипом еС2 (Е30-еС2 1194/24) и h (Е30-h 2671/17). Готовили 10% суспензию фекалий в физиологическом растворе, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин, супернатант последовательно фильтровали через мембранные фильтры с размером пор 0,45 и 0,22 мкм. К 20 мкл вирусной суспензии добавляли 20 мкл иммуноглобулинов, выделенных из сыворотки крови морской свинки, иммунизированной SN-VP3E30, методом высаливания. В качестве отрицательного контроля использовали иммуноглобулины морской свинки, иммунизированной полученным ранее VP1 норовируса [15]. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 37 °С, затем в течение 12 ч при 4 °С. После инкубации препараты центрифугировали в течение 30 мин при 14 000 об/мин. Полученные осадки разводили в 20 мкл воды и наносили на сетку для электронной микроскопии, контрастировали в водном растворе 2% фосфорно-вольфрамовой кислоты и визуализировали с помощью электронного микроскопа, как описано выше.

Действие на дендритные клетки (ДК). ДК получали, как описано ранее [16]. Моноциты выделяли из мононуклеарных клеток крови взрослых здоровых доноров с помощью 2-часовой адгезии на 48-луночных планшетах (Costar, США). Неприлипшие клетки отмывали, оставшиеся клетки инкубировали в среде RPMI-1640 (Gibco, Великобритания), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (РАА, Австрия). На 1-е и 3-и сутки в культуры вносили по 20 нг/мл интерлейкина (IL)-4 и 100 нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (Sci.store.ru, Россия). На 7-е сутки полученные незрелые ДК (нДК) переводили в свежую питательную среду и культивировали с добавлением 10 мкг/мл полипептида VP3Е30 или SN-VP3E30 в течение 48 ч. Негативными контролями являлись ДК без добавления рекомбинантных белков (нДК) и ДК, инкубированные с контрольным раствором (КР) – лизатом бактерий, трансфицированных pET22b, который прошел все этапы очистки, аналогично VP3Е30 и SN-VP3E30. Положительным контролем являлись зрелые ДК (зДК), инкубированные в течение 48 ч в присутствии 25 нг/мл IL-6 (Sci.store.ru, Россия), 25 нг/мл IL-1β, 50 нг/мл фактора некроза опухоли-α (TNF-α) (R&D, США) и 1 мкг/мл простагландина E2 (Sigma, США). После инкубации ДК собирали, окрашивали флуоресцентно-мечеными моноклональными антителами к HLA-DR («Сорбент», Россия), CCR7, CD80 (BioLegend, США), CD83 (Elabscience, КНР) и CD86 (eBioscience, США) и анализировали на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (ВD Biosciences, США). ДК гейтировали по профилю прямого и бокового светорассеивания и оценивали долю клеток, несущих мембранные молекулы, а также геометрическую среднюю интенсивности флуоресценции (GMFI) как показатель среднего количества молекул на одной клетке.

Реакцию нейтрализации проводили, как детально описано ранее [17]. На клетках эмбриональной рабдомиосаркомы (RD) («Биолот», Россия) определяли 50% цитопатическое действие (ЦПД50) для штаммов Е30 с генотипом eC2 (изолят 2045/23) и генотипом h (изолят 2700/16), ранее выделенных от больных энтеровирусным менингитом и хранящихся в рабочей коллекции ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора. ЦПД регистрировали на 4-е сутки визуально и колориметрическим методом восстановления тетразолия (МТТ) (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) [18]. Далее для исследования нейтрализующих свойств антител сыворотку крови иммунизированных лабораторных животных прогревали в течение 30 мин при 56 °С. Для последовательных разведений использовали полную питательную среду, содержащую 100 ЦПД50 Е30. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 37 °С и переносили в 96-луночный планшет, содержащий не менее 95% монослоя клеток RD. Для каждого вируса использовали по три сыворотки крови мышей и сыворотку морской свинки, иммунизированные SN-VP3E30. Исследование проводили в двух повторах. В контрольные лунки вносили питательную среду без вируса. Клетки инкубировали в течение 96 ч при 37 °С и 5% СО2. При использовании МТТ нейтрализующий титр определяли по последнему разведению сыворотки крови, в котором средний показатель оптической плотности при длине волны 570 нм (ОП) был равен или превышал разницу между ОП в лунках с незараженными клетками и ОП в лунках с клетками, зараженными 100 ЦПД50 Е30, разделенную на 2.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). При сравнении нескольких зависимых выборок использовали тест Фридмана и при неравенстве выборок группы сравнивали парным знаковым ранговым тестом Вилкоксона.

Результаты

Ранее сообщалось, что отдельные пептиды поверхностных белков enterovirus-А71 обладали слабой иммуногенностью даже при использовании адъюванта [19]. В связи с этим для повышения иммуногенности нами был получен химерный белок SN-VP3E30, состоящий из S-части VP1 норовируса и VP3 E30 (рис. 1 а), с молекулярной массой 51 кДа. Такой белок способен формировать округлые вирусоподобные структуры, диаметр которых варьировал приблизительно от 20 до 50 нм (рис. 1 б).

 

Рис. 1. Белок SN-VP3E30 формирует вирусоподобные частицы (ВпЧ). а – электрофоретическая подвижность очищенного SN-VP3E30 (1) в сравнении с PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific) (2); б – электронная микрофотография ВпЧ, образованных белком SN-VP3E30 (увеличение 12 000).

Fig. 1. The SN-VP3E30 protein forms virus-like particles (VLPs). a – electrophoretic mobility of purified SN-VP3E30 (1) compared to PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific) (2); b – electron micrograph of VLP formed by e SN-VP3E30 (12,000× magnification).

 

На первом этапе исследования иммуногенных свойств оценивали действие рекомбинантных VP3Е30 и SN-VP3E30 на ДК. С этой целью незрелые моноцитарные ДК человека инкубировали с исследуемыми белками, а затем оценивали их фенотип. Действие VP3 на ДК выражалось в небольшом приросте доли CD83+- и CD86+-клеток и увеличении GMFI CD80+-клеток относительно отрицательных контролей (рис. 2). Инкубация ДК с SN-VP3E30 вызывала увеличение доли CD86+-клеток и рост их GMFI, что говорит об увеличении количества копий этой костимулирующей молекулы на клетке. Также SN-VP3E30 индуцировал увеличение экспрессии CD80, которое проявлялось в росте интенсивности флуоресценции окрашенных ДК и оказывал воздействие на CD83 и CCR7, которое регистрировалось как увеличение доли клеток, несущих эти маркеры. Следует отметить, что экспрессия всех перечисленных выше молекул, индуцированная VP3 или SN-VP3E30, заметно уступала уровню экспрессии этих молекул на зДК положительного контроля, созревание которых было индуцировано смесью медиаторов воспаления.

 

Рис. 2. Экспрессия молекул HLA-DR, CD80, CD83, CD86 и CCR7 на дендритных клетках (ДК) после инкубации с VP3 или SN-VP3E30. а – интенсивность флуоресценции (GMFI); б – процент клеток, несущих маркер (гистограммы Тьюки). Тип клеток, их стимуляторов и анализируемые маркеры – под гистограммами. Различия с нДК обозначены: † – р < 0,05, †† – р<0,005; различия с ДК, инкубированными с КР, обозначены: * – р < 0,05, ** – р < 0,005 (в парном знаковом ранговом тесте Вилкоксона).

Fig. 2. Expression of HLA-DR, CD80, CD83, CD86, and CCR7 molecules on dendritic cells (DCs) after incubation with VP3 or SN-VP3E30. a – the fluorescence intensity (GMFI); b – the percentage of cells bearing the marker (Tukey histograms). The cell type, their stimulators, and analyzed markers are shown below the histograms. Differences from unstimulated DCs are indicated: † – p < 0.05, †† – p < 0.005; differences from DCs incubated with negative control are indicated: * – p < 0.05, ** – p < 0.005 (paired Wilcoxon signed rank test).

 

Иммунизация мышей белком SN-VP3E30 показала, что средний титр суммарных антител против VP3 составил приблизительно 1/35 000, а при использовании адъюванта – 1/115 000. Титры анти-VP3 IgM также были высокими и в среднем составляли 1/6600 и 1/8800 при иммунизации совместно с адъювантом (рис. 3 a). Антитела обладали относительно высокими индексами авидности, в среднем 75% для суммарных антител и 49% для IgM. Использование адъюванта не приводило к значимым изменениям индекса авидности антител против VP3 (рис. 3 б).

 

Рис. 3. Характеристика антител к VP3E30 после иммунизации мышей химерным белком SN-VP3E30. а – титры антител; б – индекс авидности антител. 1 – иммунизация без адъюванта (n = 10), 2 – иммунизации с адъювантом (n = 10).

Fig. 3. Characteristics of antibodies to VP3E30 after mice immunization by the chimeric protein SN-VP3E30. a – antibody titers; b – antibody avidity index. 1 – immunization without adjuvant (n = 10), 2 – immunization with adjuvant (n = 10).

 

При исследовании взаимодействия антител против VP3 c вирионами Е30 показано, что добавление иммуноглобулинов морской свинки, иммунизированной SN-VP3E30, к выделенным из фекалий препаратам Е30 разных генотипов приводило к образованию вирусных агломератов (рис. 4 б, в). В реакции нейтрализации было установлено, что при разведении в 20–40 раз содержащие анти-VP3 сыворотки крови мышей и морской свинки нейтрализовали 100 ЦПД50 Е30 обоих генотипов.

 

Рис. 4. Иммуноэлектронные микрофотографии Е30 (увеличение 12 000). а – препарат после взаимодействия с антителами против VP1 норовируса; б – агрегаты Е30-еС2 1194/24 после взаимодействия с антителами против VP3E30; в – агрегаты Е30-h 2671/17 после взаимодействия с антителами против VP3E30.

Fig. 4. Immunoelectron micrographs of E30 (12,000× magnification). a – preparation with antibodies against norovirus VP1; b – Е30-еС2 1194/24 aggregates after interaction with antibodies against VP3E30; с – Е30-h 2671/17 aggregates after interaction with antibodies against VP3E30.

 

Обсуждение

Энтеровирус Е30 является широко распространенным патогеном, который занимает ведущее место среди представителей вида Enterovirus betacoxsackie, обладающих нейротропностью. Повсеместная распространенность и тяжесть вызываемого заболевания определяют необходимость разработки Е30-вакцины, в том числе на основе поверхностных белков капсида вируса. Поверхностные белки вириона энтеровирусов не гликозилируются, поэтому исследуемые в настоящей работе белки были получены в E. coli. VP3E30 представляет собой рекомбинантный аналог полноразмерного VР3 Е30. Молекула SN-VP3E30 является химерой, в которой S-домен белка VP1 норовируса GII.4 слит в одну молекулу с VР3 Е30. Такое слияние позволяло получать ВпЧ, у которых на поверхности представлен VР3 Е30. Электронная микроскопия показала, что SN-VP3E30 формирует ВпЧ разного размера (рис. 2 б). Это наблюдение согласуется с ранее опубликованными данными, в которых показано, что рекомбинантный VP1 норовируса с генотипом GII.4 образует по крайней мере три типа ВпЧ с диаметром ~ 52, 45 и 26 нм [20].

Поскольку ДК являются важным звеном развития приобретенного иммунитета и необходимы для первой фазы инициации фолликулярных Т-хелперов, которые, в свою очередь, способствуют выработке В-клетками долгоживущих высокоаффинных антител [21], нами было проведено сравнение воздействия VР3E30 и SN-VP3E30 на фенотип ДК. Установлено, что инкубация ДК с VP3 вызывала слабые изменения фенотипа ДК (небольшой прирост доли CD83+- и CD86+-клеток и увеличение экспрессии CD80+) и не стимулировала экспрессию CCR7 на поверхности ДК (рис. 2). CCR7 является основным хемокиновым рецептором, который направляет миграцию ДК из периферических тканей в лимфатические узлы, а при его отсутствии активация фолликулярных Т-хелперов нарушается [22]. Возможно, это наблюдение объясняет описанную ранее слабую иммуногенность отдельных пептидов поверхностных белков энтеровирусов [19]. SN-VP3E30 вызывал увеличение экспрессии костимулирующих молекул CD80 и CD86, маркера зрелости CD83 и хемокинового рецептора CCR7 на поверхности ДК, что вероятно связано со способностью SN-VP3E30 формировать ВпЧ. Однако по сравнению с положительным контролем увеличение экспрессии исследуемых маркеров было умеренным, что отражало созревание не всех ДК человека.

Для дальнейших экспериментов по иммунизации лабораторных животных мы использовали только SN-VP3E30. У мышей, иммунизированных SN-VP3E30, детектировались высокие титры и индексы авидности как суммарных антител, так и IgM-антител против VP3 Е30 (рис. 3). Сравнение иммуногенности SN-VP3E30 с иммуногенностью аналогичного химерного белка SN-VP1E30, содержащего VP1 Е30, иммунизация которым происходила по аналогичной схеме [17], показало, что титры и индексы авидности антител против VP3 были выше, чем у антител против VP1 Е30. Это свидетельствует о более скором процессе созревания антител против VP3. Иммуноглобулины морской свинки, иммунизированной SN-VP3E30, вызывали образование агломератов двух наиболее распространенных в России генотипов вирусов Е30, выделенных из клинического материала. Этот результат свидетельствует о способности антител против VP3 связываться с диким вирусом. Кроме того, сывороточные антитела против VP3, полученные при иммунизации мышей и морской свинки, были способны нейтрализовать генетически различающиеся штаммы Е30 в культуре клеток. Сходные результаты были получены для других энтеровирусов. При исследовании поликлональных сывороток человека моноклональные антитела против одного генотипа могут блокировать заражение клеток в культуре с другими генотипами и серотипами энтеровирусов [23, 24].

Заключение

Таким образом, VP3 Е30 вызывал неполное созревание ДК, характеризующееся отсутствием стимуляции экспрессии хемокинового рецептора CCR7. Включение VP3 в состав химерных ВпЧ приводило к созреванию ДК и сильному гуморальному иммунному ответу у лабораторных животных. Антитела против VP3 Е30 характеризовались высокой авидностью и способностью связывать и нейтрализовать вирусы двух наиболее распространенных на территории России генотипов Е30. Полученные результаты свидетельствуют, что VP3 в составе SN-VP3E30 в перспективе может быть включен в состав комбинированной вакцины для профилактики энтеровирусных инфекций.

×

About the authors

Dmitry V. Novikov

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor); N.I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Email: novikov.dv75@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7049-6935

PhD, Leading Researcher, laboratory of immunochemistry

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950; Nizhny Novgorod, 603950

Dmitry A. Melentev

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor); N.I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Email: dim-melente@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2441-6874

Junior Researcher, laboratory of immunochemistry

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950; Nizhny Novgorod, 603950

Vladimir Yu. Talayev

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: talaev@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-1993-0622

DSc (Medicine), Professor, Head of the Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950

Nadezhda A. Novikova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: novikova_na@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3710-6648

Professor. Head of the laboratory of molecular epidemiology of viral infections

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950

Ekaterina V. Mokhonova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: ekaterinamohonova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9742-7646

Researcher, laboratory

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950

Alexander U. Kashnikov

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: mevirfc@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1033-7347

Researcher, laboratory of molecular epidemiology of viral infections

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950

Irina E. Zaichenko

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: imm.irina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5063-3111

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950

Marya V. Svetlova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: marya.talaeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4097-6780

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950

Elena V. Kurkova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: el2v@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1801-9693

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950

Olga N. Babaykina

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: olga_babaykina@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-4527-6134

PhD (Medicine), Senior Researcher, Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950

Vladislav A. Lapin

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor); N.I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Email: fridens.95@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5905-5722

Junior Researcher, laboratory of immunochemistry

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950; Nizhny Novgorod, 603950

Maria I. Tsyganova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: maria_che@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2811-6844

PhD, Leading Researcher, laboratory of immunochemistry

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950

Dmitry E. Zaitsev

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor); N.I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Email: mitya.zaitseff@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7663-6924

Junior Researcher, laboratory of immunochemistry

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950; Nizhny Novgorod, 603950

Viktor V. Novikov

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor); N.I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Author for correspondence.
Email: mbre@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2449-7213

Professor, Head of the laboratory of immunochemistry

Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950; Nizhny Novgorod, 603950

References

  1. Brouwer L., Moreni G., Wolthers K.C., Pajkrt D. World-wide prevalence and genotype distribution of enteroviruses. Viruses. 2021; 13(3): 434–49. https://doi.org/10.3390/v13030434
  2. Chuang Y., Huang Y. Enteroviral infection in neonates. J. Microbiol. Immunol. Infect. 2019; 52(6): 851–7. https://doi.org/10.1016/j.jmii.2019.08.018
  3. Nishikawa M., Matsubara T., Yoshitomi T., Ichiyama T., Hayashi T., Furukawa S. Abnormalities of brain perfusion in echovirus type 30 meningitis. J. Neurol. Sci. 2000; 179(S 1-2): 122–6. https://doi.org/10.1016/s0022-510x(00)00398-1
  4. Broberg E.K., Simone B., Jansa J. Upsurge in echovirus 30 detections in five EU/EEA countries, April to September, 2018. Euro Surveill. 2018; 23(44): 1800537. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2018.23.44.1800537
  5. Lema C., Torres C., Van der Sanden S., Cisterna D., Freire M.C., Gómez R.M. Global phylodynamics of Echovirus 30 revealed differential behavior among viral lineages. Virology. 2019; 531: 79–92. https://doi.org/10.1016/j.virol.2019.02.012
  6. Novikov D.V., Melentev D.A. Enteroviral (Picornaviridae: Enterovirus) (nonpolio) vaccines. Voprosy virusologii. 2022; 67(3): 185–92. https://doi.org/10.36233/0507-4088-111 https://elibrary.ru/fwqjow (in Russian)
  7. Mizutani T., Ishizaka A. Poliovirus capsid protein VP3 can penetrate vascular endothelial cells. FEBS Lett. 2024; 598(15): 1909–18. https://doi.org/10.1002/1873-3468.14974
  8. Kang J., Huang M., Li J., Zhang K., Zhu C., Liu S., et al. Enterovirus D68 VP3 targets the interferon regulatory factor 7 to inhibit type I interferon response. Microbiol. Spectr. 2023; 11(3): e0413822. https://doi.org/10.1128/spectrum.04138-22
  9. Kiener T.K., Jia Q., Meng T., Chow V.T.K., Kwang J. A novel universal neutralizing monoclonal antibody against enterovirus 71 that targets the highly conserved “knob” region of VP3 protein. PLoS Negl. Trop. Dis. 2014; 8(5): e2895. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002895
  10. Jia Q., Ng Q., Chin W., Meng T., Chow V.T.K., Wang C., et al. Effective in vivo therapeutic IgG antibody against VP3 of enterovirus 71 with receptor-competing activity. Sci. Rep. 2017; 7: 46402. https://doi.org/10.1038/srep46402
  11. Huang K.A. Structural basis for neutralization of enterovirus. Curr. Opin. Virol. 2021; 51: 199–206. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2021.10.006
  12. Marttila J., Hyoty H., Vilja P., Harkonen T., Alho A., Roivainen M., et al. T cell epitopes in coxsackievirus B4 structural proteins concentrate in regions conserved between enteroviruses. Virology. 2002; 293(2): 217–24. https://doi.org/10.1006/viro.2001.1259
  13. Melentev D.A., Novikov D.V., Lapin V.A., Mokhonova E.V., Tsiganova М.I., Manakova E.A., et al. Blood anti-surface proteins Echovirus 30 (Enterovirus, Picornaviridae) antibodies in residents of the Nizhny Novgorod region. Infektsiya i immunitet. 2024; 14(6): 1179–86. https://doi.org/10.15789/2220-7619-BAC-16103 https://elibrary.ru/exbfif (in Russian)
  14. Novikov D.V., Melentev D.A., Mokhonov V.V., Kashnikov A.Yu., Novikova N.A., Lapin V.A., et al. Construction of norovirus (Caliciviridae: Norovirus) virus-like particles containing VP1 of the Echovirus 30 (Picornaviridae: Enterovirus: Enterovirus B). Voprosy virusologii. 2021; 66(5): 383–9. https://doi.org/10.36233/0507-4088-79 https://elibrary.ru/mkbqet (in Russian)
  15. Lapin V.A., Novikov D.V., Mokhonova E.V., Melentyev D.A., Tsiganova M.I., Zaitsev D.E., et al. Production of recombinant norovirus VP1 protein and its antigenic and immunogenic properties. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2024; 101(5): 661–7. https://doi.org/10.36233/0372-9311-552 https://elibrary.ru/ubmktf (in Russian)
  16. Talayev V., Zaichenko I., Svetlova M., Matveichev A., Babaykina O., Voronina E., et al. Low-dose influenza vaccine Grippol Quadrivalent with adjuvant Polyoxidonium induces a T helper-2 mediated humoral immune response and increases NK cell activity. Vaccine. 2020; 38(42): 6645–55. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2020.07.053
  17. Melentev D.A., Novikov D.V., Mokhonova E.V., Novikova N.A., Kashnikov A.Yu., Selivanova S.G., et al. Immunological properties of a chimeric protein containing the major capsid protein of echovirus 30 (Picornaviridae: Enterovirus: Enterovirus betacoxsackie). Voprosy virusologii. 2025; 70(2): 189–98. https://doi.org/10.36233/0507-4088-311 https://elibrary.ru/peagdt (in Russian)
  18. Riss T.L., Moravec R.A., Niles A.L., Duellman S., Benink H.A., Worzella T.J., et al. Cell viability assays. In: Markossian S., Grossman A., Baskir H., Arkin M., Auld D., Austin C., et al. Assay Guidance Manual. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2004.
  19. Anasir M.I., Poh C.L. Advances in antigenic peptide-based vaccine and neutralizing antibodies against viruses causing hand, foot, and mouth disease. Int. J. Mol. Sci. 2019; 20(6): 1256. https://doi.org/10.3390/ijms20061256
  20. Devant J.M., Hofhaus G., Bhella D., Hansman G.S. Heterologous expression of human norovirus GII.4 VP1 leads to assembly of T=4 virus-like particles. Antiviral Res. 2019; 168: 175–82. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2019.05.010
  21. Luo W., Yin Q. B cell response to vaccination. Immunol. Invest. 2021; 50(7): 780–801. https://doi.org/10.1080/08820139.2021.1903033
  22. Krishnaswamy J.K., Gowthaman U., Zhang B., Mattsson J., Szeponik L., Liu D., et al. Migratory CD11b+ conventional dendritic cells induce T follicular helper cell-dependent antibody responses. Sci. Immunol. 2017; 2(18): eaam9169. https://doi.org/10.1126/sciimmunol.aam9169
  23. Mao Q., Cheng T., Zhu F., Li J., Wang Y., Li Y., et al. The cross-neutralizing activity of enterovirus 71 subgenotype C4 vaccines in healthy Chinese infants and children. PLoS One. 2013; 8(11): e79599. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0079599
  24. Rosenfeld A.B., Shen E.Q.L., Melendez M., Mishra N., Lipkin W.I., Racaniello V.R. Cross-reactive antibody responses against nonpoliovirus enteroviruses. mBio. 2022; 13(1): e0366021. https://doi.org/10.1128/mbio.03660-21

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. The SN-VP3E30 protein forms virus-like particles (VLPs). a – electrophoretic mobility of purified SN-VP3E30 (1) compared to PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific) (2); b – electron micrograph of VLP formed by e SN-VP3E30 (12,000× magnification).

Download (860KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Expression of HLA-DR, CD80, CD83, CD86, and CCR7 molecules on dendritic cells (DCs) after incubation with VP3 or SN-VP3E30. a – the fluorescence intensity (GMFI); b – the percentage of cells bearing the marker (Tukey histograms). The cell type, their stimulators, and analyzed markers are shown below the histograms. Differences from unstimulated DCs are indicated: † – p < 0.05, †† – p < 0.005; differences from DCs incubated with negative control are indicated: * – p < 0.05, ** – p < 0.005 (paired Wilcoxon signed rank test).

Download (967KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Characteristics of antibodies to VP3E30 after mice immunization by the chimeric protein SN-VP3E30. a – antibody titers; b – antibody avidity index. 1 – immunization without adjuvant (n = 10), 2 – immunization with adjuvant (n = 10).

Download (703KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Immunoelectron micrographs of E30 (12,000× magnification). a – preparation with antibodies against norovirus VP1; b – Е30-еС2 1194/24 aggregates after interaction with antibodies against VP3E30; с – Е30-h 2671/17 aggregates after interaction with antibodies against VP3E30.

Download (881KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2025 Novikov D.V., Melentev D.A., Talayev V.Y., Novikova N.A., Mokhonova E.V., Kashnikov A.U., Zaichenko I.E., Svetlova M.V., Kurkova E.V., Babaykina O.N., Lapin V.A., Tsyganova M.I., Zaitsev D.E., Novikov V.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.