Detection of highly pathogenic orthopoxviruses ( Poxviridae :  Chordopoxvirinae :  Orthopoxvirus ) by dot immunoassay in a high-containment biological safety laboratory

Anna V. Ersh; Ерш Анна Васильевна; Alexander G. Poltavchenko; Полтавченко Александр Георгиевич; Nikita D. Ushkalenko; Ушкаленко Никита Дмитриевич; Pavel V. Filatov; Филатов Павел Владимирович; Ksenia A. Titova; Титова Ксения Александровна; Dmitrii A. Odnoshevsky; Одношевский Дмитрий Александрович; Alexander A. Sergeev; Сергеев Александр Александрович; Artemiy A. Sergeev; Сергеев Aртемий Александрович

doi:10.36233/0507-4088-332

Detection of highly pathogenic orthopoxviruses (Poxviridae: Chordopoxvirinae: Orthopoxvirus) by dot immunoassay in a high-containment biological safety laboratory

Authors: Ersh A.V.¹, Poltavchenko A.G.¹, Ushkalenko N.D.¹, Filatov P.V.¹, Titova K.A.¹, Odnoshevsky D.A.¹, Sergeev A.A.¹, Sergeev A.A.¹
Affiliations:
1. State Scientific Center of Virology and Biotechnology «Vector»
Issue: Vol 70, No 4 (2025)
Pages: 388-392
Section: SHORT COMMUNICATION
URL: https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/16768
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-332
EDN: https://elibrary.ru/emfnak
ID: 16768

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Highly pathogenic for humans orthopoxviruses (OPV) – Variola virus (VARV) and Monkeypox virus (MPXV) can cause systemic diseases characterized by high contagiousness and often leading to death. In previous publications (https://doi.org/10.3390/v14112580), we reported on the development of a sensitive, rapid and easy-to-use immunochemical test potentially suitable for use in the infection foci and in laboratory conditions with a high level of biosecurity. The prototype of the diagnostic kit was tested on non-pathogenic and low-pathogenic for humans OPV and specifically detected them with a sensitivity within the range of 10³ to 10⁴ PFU/mL.

The aim of this work was to evaluate the sensitivity of this assay in detecting highly pathogenic for humans MPXV and VARV, as well as the applicability of the assay in a laboratory with a high level of biosafety (BSL-4).

Materials and methods. The efficiency of virus detection in cryolysates of CV-1 cell culture samples infected with VARV and MPXV was assessed using a one-step dot immunoassay method in a laboratory with biosafety level BSL-4.

Results. It was shown that the one-step dot assay allows detection of MPXV at a concentration of 2.5 × 10³ PFU/mL, and VARV at a concentration of 1.0 × 10⁴ PFU/mL. It was noted that vapors from disinfectants (hydrogen peroxide/formaldehyde) applied in biosafety cabinet decontamination may interfere with assay performance and affect result interpretation.

Conclusion. The one-step dot immunoassay can be performed in a BSL-4 laboratory. When limiting the contact of the detecting system with formaldehyde vapors, the sensitivity of the test for detection of VARV and MPXV falls within the previously declared range of 10³–10⁴ PFU/mL.

Keywords

smallpox virus, monkeypox virus, detection, dot immunoassay

Full Text

Введение

Род Orthopoxvirus подсемейства Chordopoxvirinae семейства Poxviridae включает 2 вида особо патогенных для человека вирусов: вирус натуральной оспы – Variola virus (VARV) и вирус оспы обезьян – Monkeypox virus (MPXV)^[1]. Эти вирусы высококонтагиозны, устойчивы к внешним факторам среды и имеют разные пути передачи.

Инфицирование VARV и MPXV приводит к системным заболеваниям с острым течением и нередко с летальным исходом [1–3]. VARV был ликвидирован в результате массовой вакцинации, но невозможно исключить преднамеренное использование его штаммов против населения, а также распространение этого вируса из районов вечной мерзлоты с останками умерших от оспы [4, 5]. MPXV угрожает жизни людей не только в эндемичных регионах Африки, но в последнее время все чаще за их пределами [3, 6].

В системе противодействия патогенным ортопоксвирусам (ОПВ) ключевое значение имеет раннее выявление эпидемической угрозы, поскольку именно от этого зависит оперативность и эффективность реализации противоэпидемических мероприятий [2, 6]. С учетом высокой контагиозности исследуемых образцов, лабораторная диагностика должна проводиться в лаборатории с высоким уровнем биологической защиты (Biosafety Level 4, BSL-4) либо непосредственно в условиях очага инфекции. В том и другом случае выполнение диагностических процедур сопряжено с рядом ограничений в аппаратурном оснащении и маневренностью при проведении манипуляций в средствах индивидуальной защиты [7, 8]. Таким образом, в условиях BSL-4 применение технологий полимеразной цепной реакции (ПЦР) или иммуноферментного анализа ограничено необходимостью использования дорогостоящего оборудования и сложных манипуляций [9].

Иммунохимические методы обладают меньшей чувствительностью по сравнению с ПЦР и не позволяют дифференцировать виды ОПВ, поскольку внутри рода антигенные детерминанты этих вирусов обладают выраженной степенью гомологии. Однако в сочетании с анамнестическими данными и клиническими симптомами они позволяют поставить предварительной диагноз заражения высокопатогенными видами ОВП и принять необходимые противоэпидемические меры. В то же время иммунохимические методы менее прихотливы к условиям анализа, относительно просты и оперативны в исполнении. Известны иммунохимические тесты, которые могут выполняться в полевых условиях за короткий период, но они не обладают достаточной чувствительностью [9, 10]. Таким образом, методы детекции ОПВ требуют усовершенствования в отношении повышения чувствительности, оперативности получения результатов и простоты выполнения анализа, позволяющей использовать тест непосредственно в очаге заражения или в условиях технических ограничений лаборатории с высоким уровнем биологической защиты.

Ранее нами был описан метод одностадийного дот-иммуноанализа на белковых матрицах для детекции ОПВ во внелабораторных условиях [11]. Созданные на его основе наборы реагентов автономны, содержат встроенные контроли, отличаются простотой применения, быстротой выполнения (до 35 мин) и возможностью надежной визуальной оценки результатов. Испытания наборов с использованием слабопатогенных и непатогенных для человека вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии показало, что они обеспечивают специфичность на уровне рода и чувствительность в диапазоне от 10⁴ до 10³ БОЕ/мл [11].

Целью данной работы являлась оценка чувствительности набора реагентов, созданного на основе разработанного иммунохимического теста, при обнаружении высокопатогенных для человека MPXV и VARV, а также применимости теста в лаборатории с высоким уровнем биологической безопасности (BSL-4).

Материалы и методы

Вирусы

Использовали следующие вирусы: VARV – вирус натуральной оспы (Variola virus), штамм Ind-3a, исходный титр 8,0 × 10⁶ БОЕ/мл; MPXV – вирус оспы обезьян (Monkeypox virus), штамм V79-1-005, исходный титр 4,0 × 10⁶ БОЕ/мл; VACV – вирус осповакцины (Vaccinia virus), штамм LIVP, исходный титр 8,5 × 10⁶ БОЕ/мл.

Титрование вирусов на культуре клеток Vero проводили в соответствии с ранее описанными процедурами [11]. Все вирусы использовали в виде криолизатов инфицированных клеток, освобожденных от клеточного дебриса низкоскоростным центрифугированием. Все эксперименты с живыми VARV (работы проводились в 2023 г. после одобрения и согласия Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)) и MPXV выполняли в лаборатории уровня BSL-4 в Сотрудничающем центре ВОЗ по диагностике ортопоксвирусных инфекций и музее штаммов и ДНК вируса оспы с соблюдением всех операционных процедур.

Антитела

Использовали следующие антитела: АТ a/POX – поликлональные антитела из сыворотки кролика, иммунизированного VACV, штамм LIVP (получение сыворотки и выделение из нее антител методом осаждения сульфатом аммония описаны ранее [1]); АТ НКС – антитела из сыворотки не иммунизированного кролика, выделенные осаждением сульфатом аммония.

Конъюгат коллоидного золота с АТ a/POX

Получение золя золота (20 нм), определение дозы нагрузки золя антителами АТ a/POX, проведение нагрузки золя, стабилизацию и очистку конъюгата выполняли, как описано ранее [11].

Набор для выявления ортопоксвирусов

Набор содержал белковые матрицы и аналитические ванны. Белковые матрицы представляли собой подложки из синтетической бумаги с иммобилизованными в виде отдельных точек реагентами захвата: АТ a/POX (тестовая точка), АТ НКС (точка негативного контроля) и инактивированный VACV (точка позитивного контроля). Аналитические ванны содержали наборы ячеек с компонентами иммунологической реакции, герметизированные укрывным материалом. Полный состав набора и способы изготовления его элементов приведены в предыдущей публикации [11].

Дот-иммуноанализ

Одностадийный дот-анализ выполняли в аналитических ваннах в течение 35 мин при температуре 20–25 °С в растворе конъюгата объемом 400 мкл, с разведением образца 1 : 20. Общая схема и описание отдельных этапов анализа приведены в предыдущей работе [11].

Результаты

Эксперименты по оценке чувствительности выявления VARV проводили дважды с двумя параллельными постановками анализа, а по оценке чувствительности выявления MPXV – двумя независимыми группами исследователей в двух постановках. Во всех случаях были получены сходные результаты. При выявлении VARV максимальный фактор разведения составил 1/800, а лимит определения – 1,0 × 10⁴ БОЕ/мл, а при выявлении MPXV – 1/1600 и 2,5 × 10³ БОЕ/мл соответственно.

Обсуждение

В настоящей работе представлены результаты отложенного по техническим причинам (согласование с ВОЗ) этапа разработки метода индикации ОПВ, касающегося оценки характеристик метода при выявлении высокопатогенных для человека видов ОПВ в условиях лаборатории с высоким уровнем биологической защиты (BSL-4). Метод представляет собой одностадийный дот-иммуноанализ на плоских белковых матрицах с использованием поликлональных кроличьих антител, связанных с коллоидным золотом, и золото-серебряного проявления. Результаты исследований с использованием слабопатогенных и непатогенных ОПВ, приведенные в предшествующей публикации [11], показали, что метод позволяет в течение 35 мин при комнатной температуре выявлять ОПВ в неочищенных вирусных препаратах и клинических материалах с пределом обнаружения в диапазоне 10⁴–10³ БОЕ/мл. Метод предполагает визуальный учет с несложной интерпретацией результатов анализа, прост в постановке, не проявляет реактивности в отношении возбудителей других эритематозных заболеваний и может использоваться для детекции ОПВ непосредственно в очаге инфекции

Для определения чувствительности детекции особо опасных ОПВ готовили серии двукратных разведений VARV и MPXV в ячейках аналитической ванны, заполненных рабочим разведением конъюгата, погружали белковые матрицы в полученные смеси и инкубировали 25 мин при 25 °С. Далее выполняли отмывки, проявление матриц и визуальный учет результатов. За лимит определения принимали максимальный фактор разведения исходного титра вируса, при котором достоверно определяется положительный результат анализа.

Проявитель в составе набора был представлен в виде двух компонентов: сухого – таблетка, содержащая метол и лимонную кислоту в соотношении 3 : 5, и жидкого – 0,4% раствор нитрата серебра в очищенной воде. Таблетки помещали в определенный ряд ячеек аналитической ванны, а жидкий компонент входил в состав набора в отдельном флаконе. Описанная ранее схема подготовки проявителя предусматривает вскрытие ячеек с таблетками и внесение в них по 200 мкл очищенной воды до начала выполнения анализа (для полного растворения таблеток). Жидкий компонент вносят в эти ячейки в объеме 200 мкл непосредственно перед проявлением. Полученный проявитель стабилен не менее 10 мин, но малейшие посторонние примеси могут спровоцировать его дестабилизацию с выпадением серебра в осадок. Эксперименты показали, что длительное воздействие паров дезинфектантов (таких, как перекись водорода или формальдегид), используемых для обработки внутренних поверхностей в изоляционных камерах, может привести к реакциям, ухудшающим качество проявителя, вызывая неравномерное проявление тестовых и контрольных пятен на белковых матрицах. Рекомендовано производить вскрытие ячеек с таблетками сухой смеси и внесение в них воды до помещения диагностического набора в изолирующий бокс. Полученный раствор метола и лимонной кислоты стабилен не менее 12 ч, что достаточно для выполнения всех операций по подготовке и проведению эксперимента. Для изоляции этого раствора от паров дезинфектантов подготовленные ячейки необходимо герметизировать лабораторной пленкой Parafilm. Непосредственно перед проявлением пленку удаляют и вносят в ячейки раствор нитрата серебра. При таком подходе воздействие дезинфектанта на проявитель ограничено 8–10 мин, что значительно улучшает процесс проявления. Приведенные выше результаты достигнуты с использованием описанной модификации метода.

Заключение

Дот-иммуноанализ на плоских белковых матрицах может выполняться в условиях лаборатории с высоким уровнем биологической защиты, но требует адаптации методики, обусловленной необходимостью минимизации времени контакта реагентов с парами дезинфектантов, применяемых при текущей обработке изолирующих боксов.

С использованием модифицированной методики лимит определения вирусов VARV и MPXV в исследованных образцах составил 1,0 × 10⁴и 2,5 × 10³БОЕ/мл соответственно, что соответствует заявленному ранее [11] диапазону чувствительности.

¹ Genus: Orthopoxvirus | ICTV [Internet]. International Committee on Taxonomy of Viruses. Доступно по: https://ictv.global/report/chapter/poxviridae/poxviridae/orthopoxvirus (дата обращения 11 мая 2025).