Отправить статью по E-mail Выявление высокопатогенных ортопоксвирусов (Poxviridae: Chordopoxvirinae: Orthopoxvirus) методом дот-иммуноанализа в условиях лаборатории с высоким уровнем биологической защиты
- Авторы: Ерш А.В.1, Полтавченко А.Г.1, Ушкаленко Н.Д.1, Филатов П.В.1, Титова К.А.1, Одношевский Д.А.1, Сергеев А.А.1, Сергеев A.А.1
-
Учреждения:
- ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
- Выпуск: Том 70, № 4 (2025)
- Страницы: 388-392
- Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
- URL: https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/16768
- DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-332
- EDN: https://elibrary.ru/emfnak
- ID: 16768
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Введение. Высокопатогенные для человека ортопоксвирусы (ОПВ) – вирусы натуральной оспы (VARV) и оспы обезьян (MPXV) – могут вызывать системные заболевания, характеризующиеся высокой контагиозностью и нередко приводящие к смерти. В предыдущих публикациях (https://doi.org/10.3390/v14112580) мы сообщали о разработке чувствительного, быстрого и простого в использовании иммунохимического теста, потенциально пригодного для применения в очаге инфекции и в условиях лаборатории с высоким уровнем биозащиты. Прототип диагностического набора был протестирован на непатогенных и малопатогенных для человека ОПВ и специфически выявлял их с чувствительностью в диапазоне от 103 до 104 БОЕ/мл.
Цель работы – оценка чувствительности разработанного иммунохимического теста при выявлении высокопатогенных для человека MPXV и VARV, а также применимости анализа в лаборатории с высоким уровнем биологической безопасности (BSL-4).
Материалы и методы. Методом одностадийного дот-иммуноанализа в условиях лаборатории с уровнем биобезопасности BSL4 оценивали эффективность выявления вирусов в криолизатах образцов культуры клеток CV-1, инфицированных VARV и MPXV.
Результаты. Показано, что одностадийный дот-анализ позволяет обнаруживать MPXV в концентрации 2,5 × 103 БОЕ/мл, а VARV в концентрации 1,0 × 104 БОЕ/мл. Отмечено, что пары дезинфектантов (перекись водорода или формальдегид), используемых для обработки изолирующего бокса, могут влиять на эффективность проявления результатов анализа.
Заключение. Одностадийный дот-иммуноанализ может быть выполнен в лаборатории BSL-4. При ограничении контакта проявляющей системы с парами формальдегида чувствительность теста при выявлении VARV и MPXV укладывается в ранее заявленный диапазон 103–104 БОЕ/мл.
Ключевые слова
Полный текст
Введение
Род Orthopoxvirus подсемейства Chordopoxvirinae семейства Poxviridae включает 2 вида особо патогенных для человека вирусов: вирус натуральной оспы – Variola virus (VARV) и вирус оспы обезьян – Monkeypox virus (MPXV)[1]. Эти вирусы высококонтагиозны, устойчивы к внешним факторам среды и имеют разные пути передачи.
Инфицирование VARV и MPXV приводит к системным заболеваниям с острым течением и нередко с летальным исходом [1–3]. VARV был ликвидирован в результате массовой вакцинации, но невозможно исключить преднамеренное использование его штаммов против населения, а также распространение этого вируса из районов вечной мерзлоты с останками умерших от оспы [4, 5]. MPXV угрожает жизни людей не только в эндемичных регионах Африки, но в последнее время все чаще за их пределами [3, 6].
В системе противодействия патогенным ортопоксвирусам (ОПВ) ключевое значение имеет раннее выявление эпидемической угрозы, поскольку именно от этого зависит оперативность и эффективность реализации противоэпидемических мероприятий [2, 6]. С учетом высокой контагиозности исследуемых образцов, лабораторная диагностика должна проводиться в лаборатории с высоким уровнем биологической защиты (Biosafety Level 4, BSL-4) либо непосредственно в условиях очага инфекции. В том и другом случае выполнение диагностических процедур сопряжено с рядом ограничений в аппаратурном оснащении и маневренностью при проведении манипуляций в средствах индивидуальной защиты [7, 8]. Таким образом, в условиях BSL-4 применение технологий полимеразной цепной реакции (ПЦР) или иммуноферментного анализа ограничено необходимостью использования дорогостоящего оборудования и сложных манипуляций [9].
Иммунохимические методы обладают меньшей чувствительностью по сравнению с ПЦР и не позволяют дифференцировать виды ОПВ, поскольку внутри рода антигенные детерминанты этих вирусов обладают выраженной степенью гомологии. Однако в сочетании с анамнестическими данными и клиническими симптомами они позволяют поставить предварительной диагноз заражения высокопатогенными видами ОВП и принять необходимые противоэпидемические меры. В то же время иммунохимические методы менее прихотливы к условиям анализа, относительно просты и оперативны в исполнении. Известны иммунохимические тесты, которые могут выполняться в полевых условиях за короткий период, но они не обладают достаточной чувствительностью [9, 10]. Таким образом, методы детекции ОПВ требуют усовершенствования в отношении повышения чувствительности, оперативности получения результатов и простоты выполнения анализа, позволяющей использовать тест непосредственно в очаге заражения или в условиях технических ограничений лаборатории с высоким уровнем биологической защиты.
Ранее нами был описан метод одностадийного дот-иммуноанализа на белковых матрицах для детекции ОПВ во внелабораторных условиях [11]. Созданные на его основе наборы реагентов автономны, содержат встроенные контроли, отличаются простотой применения, быстротой выполнения (до 35 мин) и возможностью надежной визуальной оценки результатов. Испытания наборов с использованием слабопатогенных и непатогенных для человека вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии показало, что они обеспечивают специфичность на уровне рода и чувствительность в диапазоне от 104 до 103 БОЕ/мл [11].
Целью данной работы являлась оценка чувствительности набора реагентов, созданного на основе разработанного иммунохимического теста, при обнаружении высокопатогенных для человека MPXV и VARV, а также применимости теста в лаборатории с высоким уровнем биологической безопасности (BSL-4).
Материалы и методы
Вирусы
Использовали следующие вирусы: VARV – вирус натуральной оспы (Variola virus), штамм Ind-3a, исходный титр 8,0 × 106 БОЕ/мл; MPXV – вирус оспы обезьян (Monkeypox virus), штамм V79-1-005, исходный титр 4,0 × 106 БОЕ/мл; VACV – вирус осповакцины (Vaccinia virus), штамм LIVP, исходный титр 8,5 × 106 БОЕ/мл.
Титрование вирусов на культуре клеток Vero проводили в соответствии с ранее описанными процедурами [11]. Все вирусы использовали в виде криолизатов инфицированных клеток, освобожденных от клеточного дебриса низкоскоростным центрифугированием. Все эксперименты с живыми VARV (работы проводились в 2023 г. после одобрения и согласия Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)) и MPXV выполняли в лаборатории уровня BSL-4 в Сотрудничающем центре ВОЗ по диагностике ортопоксвирусных инфекций и музее штаммов и ДНК вируса оспы с соблюдением всех операционных процедур.
Антитела
Использовали следующие антитела: АТ a/POX – поликлональные антитела из сыворотки кролика, иммунизированного VACV, штамм LIVP (получение сыворотки и выделение из нее антител методом осаждения сульфатом аммония описаны ранее [1]); АТ НКС – антитела из сыворотки не иммунизированного кролика, выделенные осаждением сульфатом аммония.
Конъюгат коллоидного золота с АТ a/POX
Получение золя золота (20 нм), определение дозы нагрузки золя антителами АТ a/POX, проведение нагрузки золя, стабилизацию и очистку конъюгата выполняли, как описано ранее [11].
Набор для выявления ортопоксвирусов
Набор содержал белковые матрицы и аналитические ванны. Белковые матрицы представляли собой подложки из синтетической бумаги с иммобилизованными в виде отдельных точек реагентами захвата: АТ a/POX (тестовая точка), АТ НКС (точка негативного контроля) и инактивированный VACV (точка позитивного контроля). Аналитические ванны содержали наборы ячеек с компонентами иммунологической реакции, герметизированные укрывным материалом. Полный состав набора и способы изготовления его элементов приведены в предыдущей публикации [11].
Дот-иммуноанализ
Одностадийный дот-анализ выполняли в аналитических ваннах в течение 35 мин при температуре 20–25 °С в растворе конъюгата объемом 400 мкл, с разведением образца 1 : 20. Общая схема и описание отдельных этапов анализа приведены в предыдущей работе [11].
Результаты
Эксперименты по оценке чувствительности выявления VARV проводили дважды с двумя параллельными постановками анализа, а по оценке чувствительности выявления MPXV – двумя независимыми группами исследователей в двух постановках. Во всех случаях были получены сходные результаты. При выявлении VARV максимальный фактор разведения составил 1/800, а лимит определения – 1,0 × 104 БОЕ/мл, а при выявлении MPXV – 1/1600 и 2,5 × 103 БОЕ/мл соответственно.
Обсуждение
В настоящей работе представлены результаты отложенного по техническим причинам (согласование с ВОЗ) этапа разработки метода индикации ОПВ, касающегося оценки характеристик метода при выявлении высокопатогенных для человека видов ОПВ в условиях лаборатории с высоким уровнем биологической защиты (BSL-4). Метод представляет собой одностадийный дот-иммуноанализ на плоских белковых матрицах с использованием поликлональных кроличьих антител, связанных с коллоидным золотом, и золото-серебряного проявления. Результаты исследований с использованием слабопатогенных и непатогенных ОПВ, приведенные в предшествующей публикации [11], показали, что метод позволяет в течение 35 мин при комнатной температуре выявлять ОПВ в неочищенных вирусных препаратах и клинических материалах с пределом обнаружения в диапазоне 104–103 БОЕ/мл. Метод предполагает визуальный учет с несложной интерпретацией результатов анализа, прост в постановке, не проявляет реактивности в отношении возбудителей других эритематозных заболеваний и может использоваться для детекции ОПВ непосредственно в очаге инфекции
Для определения чувствительности детекции особо опасных ОПВ готовили серии двукратных разведений VARV и MPXV в ячейках аналитической ванны, заполненных рабочим разведением конъюгата, погружали белковые матрицы в полученные смеси и инкубировали 25 мин при 25 °С. Далее выполняли отмывки, проявление матриц и визуальный учет результатов. За лимит определения принимали максимальный фактор разведения исходного титра вируса, при котором достоверно определяется положительный результат анализа.
Проявитель в составе набора был представлен в виде двух компонентов: сухого – таблетка, содержащая метол и лимонную кислоту в соотношении 3 : 5, и жидкого – 0,4% раствор нитрата серебра в очищенной воде. Таблетки помещали в определенный ряд ячеек аналитической ванны, а жидкий компонент входил в состав набора в отдельном флаконе. Описанная ранее схема подготовки проявителя предусматривает вскрытие ячеек с таблетками и внесение в них по 200 мкл очищенной воды до начала выполнения анализа (для полного растворения таблеток). Жидкий компонент вносят в эти ячейки в объеме 200 мкл непосредственно перед проявлением. Полученный проявитель стабилен не менее 10 мин, но малейшие посторонние примеси могут спровоцировать его дестабилизацию с выпадением серебра в осадок. Эксперименты показали, что длительное воздействие паров дезинфектантов (таких, как перекись водорода или формальдегид), используемых для обработки внутренних поверхностей в изоляционных камерах, может привести к реакциям, ухудшающим качество проявителя, вызывая неравномерное проявление тестовых и контрольных пятен на белковых матрицах. Рекомендовано производить вскрытие ячеек с таблетками сухой смеси и внесение в них воды до помещения диагностического набора в изолирующий бокс. Полученный раствор метола и лимонной кислоты стабилен не менее 12 ч, что достаточно для выполнения всех операций по подготовке и проведению эксперимента. Для изоляции этого раствора от паров дезинфектантов подготовленные ячейки необходимо герметизировать лабораторной пленкой Parafilm. Непосредственно перед проявлением пленку удаляют и вносят в ячейки раствор нитрата серебра. При таком подходе воздействие дезинфектанта на проявитель ограничено 8–10 мин, что значительно улучшает процесс проявления. Приведенные выше результаты достигнуты с использованием описанной модификации метода.
Заключение
Дот-иммуноанализ на плоских белковых матрицах может выполняться в условиях лаборатории с высоким уровнем биологической защиты, но требует адаптации методики, обусловленной необходимостью минимизации времени контакта реагентов с парами дезинфектантов, применяемых при текущей обработке изолирующих боксов.
С использованием модифицированной методики лимит определения вирусов VARV и MPXV в исследованных образцах составил 1,0 × 104 и 2,5 × 103 БОЕ/мл соответственно, что соответствует заявленному ранее [11] диапазону чувствительности.
1 Genus: Orthopoxvirus | ICTV [Internet]. International Committee on Taxonomy of Viruses. Доступно по: https://ictv.global/report/chapter/poxviridae/poxviridae/orthopoxvirus (дата обращения 11 мая 2025).
Об авторах
Анна Васильевна Ерш
ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Email: ersh_av@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-9220-1250
канд. биол. наук, научный сотрудник
Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская областьАлександр Георгиевич Полтавченко
ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Email: poltav@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-2408-5611
д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник
Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская областьНикита Дмитриевич Ушкаленко
ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Email: ushkalenko_nd@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-2171-7444
аспирант, младший научный сотрудник
Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская областьПавел Владимирович Филатов
ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Автор, ответственный за переписку.
Email: filatov_pv@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-7763-3808
канд. биол. наук, научный сотрудник
Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская областьКсения Александровна Титова
ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Email: titova_ka@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-8764-9408
канд. биол. наук, старший научный сотрудник
Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская областьДмитрий Александрович Одношевский
ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Email: odnoshevskiy_da@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-0616-7488
научный сотрудник
Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская областьАлександр Александрович Сергеев
ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Email: sergeev_ala@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-8355-5551
канд. мед. наук, заведующий отделом «Коллекция микроорганизмов»
Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская областьAртемий Александрович Сергеев
ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Email: sergeev_aa@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-3591-1571
д-р мед. наук, зам. генерального директора по научной и эпидемиологической работе
Россия, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская областьСписок литературы
- Buller R.M.L. Poxviruses. In: Cohen J., Powderly W.G., Opal S.M., eds. Infectious Diseases. Volume 2. Elsevier; 2017: 1452–7.e1.
- Shchelkunova G.A., Shchelkunov S.N. Smallpox, monkeypox and other human orthopoxvirus infections. Viruses. 2022; 15(1): 103. https://doi.org/10.3390/v15010103
- Sklenovská N. Monkeypox virus. In: Malik Y.S., Singh R.K., Dhama K., eds. Livestock Diseases and Management. Springer; 2020: 39–68.
- Whitley R.J. Smallpox: a potential agent of bioterrorism. Antiviral. Res. 2003; 57(1-2): 7–12. https://doi.org/10.1016/s0166-3542(02)00195-x
- Wallin A., Luksiene Z., Zagminas K., Surkiene G. Public health and bioterrorism: renewed threat of anthrax and smallpox. Medicina (Kaunas). 2007; 43(4): 278–84.
- Harapan H., Ophinni Y., Megawati D., Frediansyah A., Mamada S.S., Salampe M., et al. Monkeypox: a comprehensive review. Viruses. 2022; 14(10): 2155. https://doi.org/10.3390/v14102155
- Shurtleff A.C., Garza N., Lackemeyer M., Carrion R. Jr., Griffiths A., Patterson J., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 2012; 4(12): 3932–51. https://doi.org/10.3390/v4123932
- Bohannon J.K., Janosko K., Holbrook M.R., Barr J., Pusl D., Bollinger L., et al. Safety precautions and operating procedures in an (A)BSL-4 laboratory: 3. Aerobiology. J. Vis. Exp. 2016; (116): 53602. https://doi.org/10.3791/53602
- Townsend M.B., MacNeil A., Reynolds M.G., Hughes C.M., Olson V.A., Damon I.K., et al. Evaluation of the Tetracore Orthopox BioThreat® antigen detection assay using laboratory grown orthopoxviruses and rash illness clinical specimens. J. Virol. Methods. 2013; 187(1): 37–42. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2012.08.023
- Stern D., Olson V.A., Smith S.K., Pietraszczyk M., Miller L., Miethe P., et al. Rapid and sensitive point-of-care detection of Orthopoxviruses by ABICAP immunofiltration. Virol. J. 2016; 13(1): 207. https://doi.org/10.1186/s12985-016-0665-5
- Ushkalenko N., Ersh A., Sergeev A., Filatov P., Poltavchenko A. Evaluation of rapid dot-immunoassay for detection orthopoxviruses using laboratory-grown viruses and animal’s clinical specimens. Viruses. 2022; 14(11): 2580. https://doi.org/10.3390/v14112580
Дополнительные файлы
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).