Frequency of the occurrence of spliced variants of the messenger RNA DR3/LARD in herpesviral infection

Full Text

Представители семейства Herpesviridae широко распространены в разных регионах мира и вызывают хроническую персистирующую инфекцию [1]. Важным механизмом иммунорезистентности герпес-вирусов является способность модулировать апоптоз инфицированных и иммунокомпетентных клеток [2-5]. Поэтому изучение молекулярных механизмов иммунного ответа и апоптоза при данной инфекции весьма актуально. В инициации внешнего пути апоптоза участвуют представители белкового семейства рецепторов смерти [5]. Одним из них является трансмембранный рецептор DR3/ LARD. Он экспрессируется на поверхности лейкоцитов периферической крови, а также в тканях, содержащих лимфоидные элементы (толстая и тонкая кишка, тимус, селезенка). В зависимости от типа клеток стимуляция DR3/LARD приводит к апоптозу или пролиферации [6]. Для рецептора DR3/LARD описано 14 вариантов мРНК, образующихся в результате альтернативного сплайсинга. Среди них выделяют мембранные (4 мРНК) и растворимые (10 мРНК) формы, выполняющие разные функции [6]. Предполагается, что растворимые формы DR3/LARD ингибируют апоптоз, инициированный с помощью мембранных форм рецептора [7]. Такое разнообразие форм мРНК DR3/LARD предполагает наличие множества путей модуляции пусковых событий апоптоза в рамках противодействия иммунной системы организма хозяина и вирусных патогенов. Цель работы - анализ встречаемости мРНК мембранных и растворимых форм DR3/LARD в крови при инфицировании разными представителями семейства Herpesviridae. Материалы и методы Форма мРНК DR3/LARD Здоровые лица Пациенты с ГВИ мужчины женщины всего ВВО ВЭБ ЦМВ микстинфекция всего DR3P soluble DR3P 70 (14/20) 80 (16/20) 80 (16/20) 70 (14/20) 75 (30/40) 75 (30/40) 72 (21/29) 48 (14/29)*** 73 (27/37) 59 (22/37) 79 (15/19) 58 (11/19) 78 (7/9) 56 (5/9) 74 (70/94)* 55 (52/94)*** LARD 1а 95 (19/20)** 90 (18/20) 93 (37/40)**,* 90 (26/29)* 95 (35/37)*,** 79 (15/19) 78 (7/9) 88 (83/94)*,** LARD 3 95 (19/20)** 75 (15/20) 85 (34/40) 93 (27/29)*, **, **** 81 (30/37)* 68 (13/19) 100 (9/9)* 84 (79/94)* Примечание. * - статистически значимые различия по сравнению с мРНК soluble DR3P (р < 0,05); ** - статистически значимые различия по сравнению с мРНК DR3P (р < 0,05); *** - статистически значимые различия во встречаемости мРНК soluble DR3P по сравнению с таковой у здоровых лиц (р < 0,05); **** - статистически значимые различия в частоте выявления мРНК LARD 3 при инфицировании ВВО по сравнению с таковой при ЦМВ (р < 0,05). Исследуемый материал. Исследовали периферическую кровь у 94 пациентов (44 мужчины и 50 женщин) с диагнозом герпес-вирусной инфекции (ГВИ), поступивших на лечение в Городскую инфекционную больницу № 2 г. Нижнего Новгорода. Возраст пациентов составил от 18 до 81 года (средний возраст 36 лет). Инфекцию, вызываемую вирусом ветряной оспы (ВВО), выявили у 29 больных из 94, вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) - у 37 из 94, цитомегаловирусом (ЦМВ) - у 19 из 94; у 9 из 94 наблюдали смешанную форму инфицирования (ВВО и ЦМВ). В качестве контроля использовали 40 образцов крови здоровых лиц (20 мужчин и 20 женщин) в возрасте от 18 до 75 лет (средний возраст 41 год). В крови здоровых волонтеров методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) не детектировали ДНК вируса в клинически значимых концентрациях. Это принципиальное отличие и легло в основу разделения групп на здоровых лиц и больных. Выделение тотальной РНК проводили с помощью коммерческого набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя (ООО «Интерлабсервис», Москва). ОТ-ПЦР. Для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) на матрице мРНК проводили реакцию обратной транскрипции по стандартной схеме [8]. В реакции использовали обратный праймер DR3R6 (5’- CAgCgCTTgAgCATCTCgTA-3’). Полученную кДНК амплифицировали в два раунда. В первом раунде проводили 30 циклов с помощью праймеров - прямого DR3F0 (5’-gTgACTTCCACAAgAAgATT-3’) и обратного DR3R6 - при следующих температурных условиях: 94°С - 30 с, 50°С - 30 с, 72°С - 50 с. Во втором раунде для одновременной детекции мРНК мембранных и растворимых форм DR3/LARD проводили 25 циклов ПЦР с прямым праймером DR3F1S (5’-CTgggAgAACCACCATAATT-3’), а также с обратными праймерами DR3R3b (5’- gAACACACCTACTCTgCCTC-3’) и DR3TMR4 (5’- CCCAgCTTCATCTgCAgTAA-3’) при следующих температурных условиях: 94°С - 30 с, 62°С - 30 с, 72°С - 40 с. Для детекции продуктов, образовавшихся в ходе двух раундов ПЦР, проводили электрофорез в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия. Секвенирование ДНК. При подготовке к секвенирова- нию фрагменты кДНК вырезали из агарозного геля, очищали с использованием набора DNA Extraction Kit («Fer- mentas», Латвия) и проводили реакцию терминирования, используя набор BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit («Applied Biosystems», США), согласно рекомендациям производителя. Результаты реакции регистрировали на генетическом анализаторе ABI Prizm 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США). Нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями мРНК мембранных и растворимых форм DR3/LARD, зарегистрированными в базе данных NCBI GenBank (AF026070.1, AF026071.1, U94501.1, U94504.1). Статистический анализ. Для статистической обработки данных использовали пакет программ Statistica 8.0. Сравнивали относительные частоты исследуемых признаков в группах. Для анализа взаимосвязи выявления различных вариантов мРНК DR3/LARD в зависимости от пола и типа инфекционного агента использовали двусторонний тест критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми прир < 0,05. Результаты Встречаемость мРНК DR3/LARD в крови здоровых лиц В крови здоровых лиц с разной частотой наблюдали четыре варианта мРНК DR3/LARD (см. таблицу). Две мРНК кодировали мембранные молекулы (мРНК LARD 1a, мРНК DR3P), а две другие - растворимые формы рецептора (мРНК LARD 3, мРНК soluble DR3P). Всего в исследованных образцах крови здоровых лиц выявили 10 спектров форм. В целом среди здоровых лиц мРНК LARD 1a выявляли в 1,2 раза чаще, чем мРНК DR3P и мРНК soluble DR3P (р = 0,031). У мужчин и женщин сплайсированные варианты мРНК DR3/LARD обнаруживали приблизительно с одинаковой частотой. Только у мужчин мРНК LARD 1a и мРНК LARD 3 детектировали в 1,4 раза чаще, чем мРНК DR3P (р = 0,044). При этом статистически значимые ассоциации в частоте выявления различных форм мРНК DR3/ LARD с полом здоровых лиц отсутствовали. Встречаемость мРНК DR3/LARD в крови при ГВИ В крови пациентов с ГВИ с разной частотой выявляли четыре варианта мРНК DR3/LARD (см. таблицу). Эти же варианты мРНК детектировали в крови здоровых лиц. Всего у инфицированных лиц обнаружили девять спектров форм мРНК DR3/LARD. В целом при ГВИ мРНК LARD 1a, мРНК LARD 3 и мРНК DR3P выявляли в 1,6 раза, в 1,5 раза и в 1,3 раза чаще, чем мРНК soluble DR3P (р < 0,05). Встречаемость мРНК LARD 1a в 1,2 раза оказалась выше, чем мРНК DR3P (р = 0,02). Также мРНК soluble DR3P определяли в 1,4 раза реже, чем у здоровых лиц (р = 0,035). При инфицировании ВВО мРНК LARD 3 и мРНК LARD 1a выявляли в 1,9 раза чаще, чем мРНК soluble DR3P (р < 0,001 и р = 0,001 соответственно). Инфицирование данным вирусом сопровождалось повышением в 1,3 раза частоты выявления мРНК LARD 3 над мРНК DR3P (р = 0,01). Кроме того, при инфицировании ВВО мРНК LARD 3 определяли в 1,4 раза чаще, чем при инфицировании ЦМВ (р = 0,045). Наблюдали снижение в 1,6 раза встречаемости мРНК soluble DR3P по сравнению с таковой среди здоровых лиц (р = 0,041). При ВЭБ-инфекции встречаемость мРНК LARD 1a в 1,6 и в 1,3 раза оказалась выше, чем мРНК soluble DR3P и мРНК DR3P (р < 0,001; р = 0,014 соответственно). Кроме того, мРНК LARD 3 выявляли в 1,4 раза чаще, чем мРНК soluble DR3P (р = 0,046). При инфицировании ЦМВ различий в частоте детекции сплайсированных вариантов мРНК DR3/LARD не обнаружили. При микстинфекции (ВВО и ЦМВ) встречаемость мРНК LARD 3 в 1,8 раза была выше, чем мРНК soluble DR3P (р = 0,038). При ВЭБ-инфекции, микстинфекции, а также при инфицировании ЦМВ различий в частоте выявления сплайсированных вариантов мРНК DR3/LARD в сравнении с таковой среди здоровых лиц не отметили. Обсуждение Физиологическая роль рецептора DR3/LARD до конца не известна. Показано, что DR3/LARD является важной ко- стимуляторной молекулой при активации CD4-позитивных Т-лимфоцитов [9], а также участвует в регуляции негативной селекции тимоцитов в тимусе [10]. Для дальнейшего понимания вклада DR3/LARD в работу иммунокомпетент- ных клеток мы провели анализ встречаемости сплайсиро- ванных вариантов мРНК исследуемого рецептора у здоровых лиц. В целом превалировала встречаемость мРНК LARD 1a и мРНК LARD , а не с мРНК soluble DR3P и мРНК DR3P, и прежде всего у мужчин. Вероятно, такой набор мРНК DR3/LARD обусловливает физиологическую регуляцию начальных этапов апоптоза. Функциональная роль рецептора DR3/LARD в регуляции иммунного ответа и апоптоза при ГВИ до конца не выяснена. Литературные источники свидетельствуют о ключевой роли DR3/LARD в формировании протективного и пролонгированного иммунитета на ЦМВ-инфекцию у мышей [10]. Демонстрируется, что инфицирование ЦМВ приводит к усилению экспрессии этого рецептора цитотоксическими CDS-позитивными Т-лимфоцитами. Отсутствие экспрессии рецептора DR3/ LARD вследствие нокаута гена сопровождалось неконтролируемой репликацией вируса. Данные об участии DR3/LARD в патогенезе других нозологических форм ГВИ в доступной литературе отсутствуют. Мы показали, что по разнообразию форм мРНК DR3/ LARD ГВИ соответствовала показателям у здоровых лиц. При этом частота выявления отдельных вариантов мРНК DR3/LARD варьировала и имела специфические черты. Так, в крови пациентов наблюдали снижение в 1,4 раза встречаемости мРНК soluble DR3P по сравнению с таковой среди здоровых лиц. Возможно, что данная форма мРНК DR3/LARD является важным регуляторным фактором, отсутствие которого способствует уходу вируса от иммунологического контроля. Т. е. снижение частоты выявления мРНК soluble DR3P, проявляющей антиапоптотическую направленность, может способствовать повышению восприимчивости иммунокомпе- тентных клеток к апоптозу, последующему уменьшению их количества и возникновению иммунодефицита. Также можно предположить, что этиология возбудителя будет определять механизм модуляции апоптоза с участием сплайсированных вариантов DR3/LARD и результат иммунных реакций. Возможной составной частью такого механизма являются снижение встречаемости мРНК soluble DR3P при инфицировании ВВО в сравнении с таковой среди здоровых лиц и отсутствие различий в отношении других нозологических форм ГВИ на общем фоне гетерогенной экспрессии сплайсированных вариантов мРНК DR3/LARD. Полученные результаты дополняют и расширяют существующие представления, согласно которым инфицирование ВВО сопровождается усилением апоптоза Т-лимфоцитов in vitro [3]. Напротив, инфицирование ЦМВ и ВЭБ-инфекция характеризуются ингибированием апоптоза Т- и В-лимфоцитов, соответственно [4, 5] . В то же время отсутствие различий в частоте выявления сплайсированных вариантов мРНК DR3/LARD при инфицировании ЦМВ и ВЭБ может свидетельствовать о неучастии данного рецептора в реализации стратегий иммунорезистентности, используемых данными вирусами. Известно, что инфицирование ЦМВ и ВЭБ приводит к синтезу клеткой белков, проявляющих антиапоптотиче- ские функции, которые по механизму действия сходны с Bcl-2 [2]. Возможно, что модуляция апоптоза и иммунного ответа в случае ВВО достигается при участии рецептора DR3/LARD, а для ЦМВ и ВЭБ ключевыми являются иные способы ухода от иммунного надзора. Заключение Показано, что ГВИ сопровождалась изменениями в составе сплайсированных вариантов мРНК DR3/LARD и частоте их детекции как среди инфицированных лиц, так и в сравнении с таковыми у здоровых лиц. В значительной мере они касались ВВО и проявлялись в снижении частоты выявления мРНК soluble DR3p. При инфицировании ЦМВ и ВЭБ таких различий не обнаружили. В целом изменения в частоте выявления сплайсированных вариантов мРНК DR3/LARD направлены на модуляцию сигнальных событий апоптоза и сдерживание противовирусного иммунного ответа.

References

Supplementary files