Engineering by reverse genetics and characterization of the new re-assortant influenza virus Strain H5N1

Full Text

Грипп птиц представляет собой экономическую угрозу для птицеводства во всем мире. В случае вспышки гриппа птиц в неблагополучных хозяйствах уничтожается все поголовье в соответствии с предписаниями международных организаций, Международного эпизоотического бюро (МЭБ) и Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (ФАО), а также с национальными ветеринарно-санитарными нормативами [1-3]. Вакцинированные куры при заражении высокопатогенными штаммами вируса гриппа птиц (ВГП) не болеют и в значительно меньшей степени выделяют вирус в окружающую среду [4, 5]. Для вакцинации кур применяют цельновирионные инактивированные вакцины с добавлением масляного адъюванта [6]. Главным недостатком вакцинации является ее неспособность предотвратить репликацию полевых штаммов вируса в организме кур и циркуляцию вируса в вакцинированном стаде [7, 8]. Это способствует эволюции ВГП за счет антигенного дрейфа в вирусном гемагглютинине (ГА), приводя к снижению эффективности вакцинации. Несмотря на применение современных адъювантов, которые увеличивают имму- ногенность вакцин, главным условием эффективности вакцин против гриппа остается антигенное соответствие ГА у вакцинного и эпизоотического штаммов вируса. Тем не менее в вакцинах против высокопатогенного ВГП А/ H5 это условие не всегда соблюдается [9, 10]. Так, вакцина на основе двух штаммов вируса гриппа A/chicken/ Hidalgo/232/1994 (H5N2) и A/turkey/Wisconsin/1968 (H5N9) оказалась низкоэффективной против эпизоотического высокопатогенного штамма ВГП А/ H5N1 из-за недостаточного антигенного соответствия ГА [11]. Таким образом, актуальной задачей является не только создание вакцины против ВГП с требуемой антигенной специфичностью, но и возможность эту вакцину модифицировать, следуя изменениям в антигенных свойствах циркулирующих полевых штаммов. Если обратиться к опыту здравоохранения, для создания вакцин против пандемий гриппа ВОЗ собирает результаты антигенного и генетического анализа циркулирующих высокопатогенных штаммов, представленных участниками Глобальной системы надзора за гриппом (GISRS). После этого методами обратной генетики создаются штаммы-кандидаты для вакцин, обладающие заданной антигенностью и аттенуированные по отношению к куриным эмбрионам [1, 12]. Аттенуация достигается посредством модификации сайта разрезания ГА высокопатогенного штамма. Модифицированный ген ГА соединяется вместе с 7 остальными генами, взятыми от штамма A/Puerto Rico/8/34 (PR8), и используется для трансфекции клеточных культур. Полученный инфекционный вирус представляет собой реассортант, сконструированный методами генетической инженерии. Он обладает требуемыми антигенными свойствами, сниженной вирулентностью, а также подобно штамму PR8 эффективно накапливается в куриных эмбрионах [12]. В настоящей работе мы применили данную стратегию для создания нового реассортантного вируса гриппа recPR8-H5N1, имеющего ГА высокопатогенного штамма ВГП А/Курган/05/2005 (H5N1), выделенного на территории России. Исследованы репродуктивные, антигенные и вирулентные свойства нового реассортанта. Полученные результаты - это первый шаг в работе по конструированию вирусных штаммов-кандидатов для инактивированных вакцин с заданными антигенными свойствами. Материалы и методы Вирус. В работе использовали штамм вируса гриппа А/Курган/05/2005 (H5N1), который был любезно предоставлен руководителем лаборатории физиологии вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, академиком РАН, проф. Н.В.Кавериным. Вирус культивировали на 12-дневных беспатогенных (specific pathogen frec - СПФ) куриных эмбрионах (КЭ). Определение инфекционной активности вируса гриппа проводили согласно МУ3.3.2.1758-03. Специфические сыворотки были получены после вакцинации кур инактивированной эмульгированной вакциной против гриппа птиц типа А подтипа Н5 «Флупротект Н5» производства ФГУП «Ставропольская биофабрика». Плазмиды. Система из 8 плазмид со вставками 8 генов (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS) вируса гриппа А/ PR8/34 (H1N1) в плазмиде pHW2000 [13] была любезно предоставлена St. Jude Children's Research Hospital , Мемфис, США. Для выделения плазмидной ДНК из клеток E. coli использовали набор Qiagen Plasmid Midiprep Kit («Qiagen», США). Выделение РНК и ОТ-ПЦР. Вирусную РНК выделяли с использованием тризола (Trizol Reagent, «Sigma», США), кДНК нарабатывали с использованием олиго- нуклеотидных праймеров: Bm-HA-1 (5’-TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG TG-3’) и Bm-NS-890R (5’-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT-3’). Амплификацию проводили с использованием термоциклера Терцик («ДНК-Технология», Россия). Продукты ПЦР были проанализированы методом гель- электрофореза и очищены с помощью набора GeneJET Extraction Kit («Fermentas», Литва). Секвенирование гена ГА выполняли с применением праймеров 1R201: TGT GTC TTT TCC AGT ATG TCT TG; 2R1195: TGT CTG CAG CGT ACC CAC T; 3R1662: CTA GAG TTC TCT CAT TTT CC; 1F100: TTG CAT TGG TTA CCA TGC A; 2F943: GAT AAA CTC TAG TAT GCC ATT C; 5F1532: Накопление антигемагглютининов в сыворотках крови кур, вакцинированных препаратом на основе инактивированного штамма recPR8-H5N1 (1-я группа). Контрольная (2-я) группа не вакцинирована Группа № птицы До вакцинации 21-й день после вакцинации титр в РТГА титр в РТГА H5N1 H1N1 H5N1 H1N1 1-я 1.1 1:4 1:2 1:512 1:2 1.2 1:2 1:4 1:2048 1:4 1.3 1:4 1:2 1:2048 1:4 1.4 1:2 1:4 1:512 1:2 1.5 1:4 1:4 1:1024 1:2 1.6 1:4 1:4 1:1024 1:4 1.7 1:4 1:2 1:512 1:4 1.8 1:2 1:2 1:512 1:2 1.9 1:2 1:2 1:512 1:2 1.10 1:2 1:4 1:256 1:4 1.11 1:4 1:2 1:512 1:4 1.12 1:2 1:4 1:1024 1:4 1.13 1:4 1:2 1:512 1:2 1.14 1:2 1:4 1:1024 1:2 1.15 1:4 1:4 1:256 1:4 1.16 1:4 1:4 1:512 1:2 1.17 1:4 1:2 1:256 1:4 1.18 1:2 1:2 1:512 1:2 1.19 1:2 1:2 1:512 1:4 1.20 1:2 1:4 1:256 1:4 2-я 2.1 1:4 1:2 1:4 1:2 2.2 1:4 1:2 1:4 1:2 2.3 1:4 1:4 1:4 1:4 2.4 1:4 1:2 1:4 1:2 2.5 1:4 1:4 1:4 1:4 2.6 1:4 1:4 1:4 1:4 Контрольные сыворотки Контроль + SS H5N1 1:512 1:2 Контроль + SS H1N1 1:2 1:256 Контроль - SN 1:2 1:2 GAA AGT GTA AGA AAC GGA AC. Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера с помощью набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США) на автоматическом сек- венаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ BioEdit (version 7.0.0. Copyright © 1997-2004) и программы SeqMan из пакета программ Lasergene (version 7.1.0. Copyright0 1993-2006). Клеточные культуры и трансфекция. Культуру клеток MDCK выращивали на ростовой среде DMEM с добавлением 5% эмбриональной сыворотки КРС («Gibco», США). Коэффициент пересева - 1:5-1:6 Культуру клеток почки эмбриона человека 293Т выращивали на ростовой среде Opti-MEM («Gibco») с добавлением 5% фетальной сыворотки теленка («Gibco», Москва) без антибиотиков. Коэффициент пересева - 1:4. Для транс- Таблица 2 Схема постановки опыта на птице и результаты экспериментального заражения Группа Вакцинация n павших 1- я опытная 2- я контрольная 3- я контрольная 4- я контрольная 20 Инактивированный recPR8-H5N1 Не вакцинировали То же 0 0 6 6 1-й пассаж на КЭ 2-й пассаж на КЭ Исходная плазмида фекции клеток 293^MDCK использовали реагент TransIT®- LT1 Transfection Reagent («MirusBio», США). Заражение суточного клеточного монослоя MDCK проводили путем адсорбции виругсодержащей культуральной жидкости, отобранной после трансфекции, при 3 70С в атмосфере 5% СО2 («SANYO», Япония). Через 1 ч после адсорбции с монослоя клеток удаляли культуральную жидкость и заменяли на среду DMEM, содержащую 1 мкг/мл трипсина ТРСК («Sigma», США) без сыворотки в течение 72 ч. Проводили контроль под микроскопом состояния монослоя на наличие цитопатического действия (ЦПД). Культивирование вирусов в куриных эмбрионах. Для заражения рекомбинантным ВГП H5N1 использовали 12дневные СПФ-КЭ («Lohman», Германия). Для предотвращения бактериального заражения применяли антибиотики широкого спектра действия (стрептомицин и пенициллин 1000 ед/мл). Эмбрионы заражали в аллантоисную полость по 0,1 см3 вируссодержащей культуральной жидкости, отобранной после трансфекции (при дальнейшем пассировании - аллантоисной экстраэмбриональной жидкостью) в разведении 1:100-1:1000 (для последних пассажей использовали до 1:1 000 000) и инкубировали при 37°С в течение 48 ч. Эмбрионы просматривали через 6, 8, 12, 24, 48 ч после заражения под овоскопом. Погибшие эмбрионы охлаждали, помещая в холодильник при 4-60С, вскрывали в асептических условиях и собирали экстраэмбриональ- ную жидкость для последующей работы. Постановка реакции гемагглютинации (РГА) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Реакции проводили на иммунологических планшетах с V-образными лунками с 1% суспензией куриных эритроцитов согласно рекомендациям МЭБ «Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals», 2012. Сыворотки крови исследовали в РТГА с антигенами ВГП H5N1 собственного приготовления и H1N1 производства Покровского завода биопрепаратов. В качестве контроля использовали серонегативную сыворотку кур (SN), гипериммун- ную сыворотку кур (SS) к ВГП H5N1 и положительную (SS) сыворотку к ВГП H1N1 (табл. 1). Накопление, а также идентификация рекомбинантного вируса H5N1 в процессе пассирования были продемонстрированы с помощью количественной тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени («Ветбиохим», Москва). Проверка антигенной активности вируса и проведение биопробы на птице. Инактивированный формалином (в конечной концентрации 0,1%) вирус recPR8-H5N1 после 3 пассажей в КЭ использовали для приготовления эмульсионной вакцины с готовым адъювантом Montanide ISA 70 («Seppic», Франция). Вакцинировали 1,5-месячных цыплят кросса Hysex white однократно подкожно в области средней трети шеи в дозе 0,5 см3. Птиц разделили на 4 группы (табл. 2): опытную (1-ю) группу (n = 20) и 3 контрольных группы 2, 3, 4-ю (n = 6 в каждой). Вакцинировали птиц опытной группы, контрольные группы не вакцинировали. Перед опытом и через 21 сут после вакцинации у птиц 1-й и 2-й групп брали пробы сывороток крови для серологических исследований (см. табл. 1). Через 21 сут после вакцинации птиц 1-й группы и 3-й контрольной группы заразили вирулентным высокопатогенным вирусом А/Курган/05/2005 (H5N1) орально в дозе Н107 ЭИД50. Птиц из 4-й контрольной группы заразили исследуемым recPR8-H5N1 аналогичным методом. Результаты Получение реассортантного вируса гриппа recPR8- H5N1 и оценка его репродуктивной активности. Рекомбинантный штамм был получен при помощи трансфекции смеси клеток 293Т/MDCK смешанной ДНК 8 плазмид с последующим культивированием в перевиваемой культуре клеток MDCK, а затем в КЭ. На рисунке показана первая детекция инфекционного вируса гриппа после внесения ДНК в культуру клеток и последующее накопление вируса в аллантоисной жидкости КЭ. Плазмидная ДНК, содержащая ген Н5, определялась лишь в культуральной жидкости после трансфекции и не обнаруживалась после первого пассажа. Число копий плазмидной ДНК подсчитано по результатам прямой ПЦР в реальном времени (калибровочные графики не приводятся). Для оценки репродуктивной активности вируса recPR8-H5N1 провели 5 последовательных пассажей на КЭ. Специфическую гибель зараженных КЭ наблюдали через 36 ч после инъекции. После охлаждения собирали экстраэмбриональную жидкость и исследовали в РГА. В табл. 3 приведены показатели накопления ГА вируса в КЭ по результатам РГА. При небольшом разбросе значений титры в РГА в ходе культивирования возрастали, достигая средних значений 9,38 log2, 10,71 log2, 11,12 log2 после 3, 4 и 5 пассажей соответственно. Параллельно провели 4 пассажа вируса на 24 ч в монослое линии клеток MDCK (табл. 4). Специфическое ЦПД наблюдали в течение 48-72 ч после заражения клеток. Титры в РГА были ниже и составили 5,66 log2 для 3-го пассажа и 6,66 log2 для 4-го пассажа. Увеличение титров ГА является подтверждением инфекционности вируса recPR8-H5N1 и свидетельствует о его адаптации к используемой системе культивирования. А/Курган/05/2005 (H5N1) Не заражали А/Курган/05/2005 (H5N1) recPR8-H5N1 1,00Е+10-| 5 1.00Е+09- 2 m 1.00Е+08- | 1.00Е+07- 2 1.00Е+06- 11.00Е+05- §. 1.00Е+04- I- 11.00Е+03- g 1.00Е+02- 3 1.00Е+01 - 1.00Е+00- Рекомбинантный вирус Заражение 0 Накопление рекомбинантного вируса H5N1 в процессе культивирования и детекция плазмиды pHW2000 со вставкой гена ГА вируса гриппа А/Курган/05/2005 (H5N1). Культуральная жидкость после трансфекции Гемагглютинирующая активность вируса гриппа штамма recPR8-H5N1 в аллантоисной жидкости КЭ после 3, 4 и 5-го пассажей при заражении КЭ вирусом в разведениях 10-4-10-6 № эмбриона Пассаж Степень разведения вируса (10n) Титр РГА 1 3-й -4 1:1024 2 -4 1:512 3 -5 1:512 4 -5 1:1024 5 -5 1:512 6 -6 1:512 7 -6 1:512 8 -6 1:1024 9 4-й -5 1:2048 10 -5 1:1024 11 -5 1:2048 12 -6 1:2048 13 -6 1:2048 14 -6 1:1024 15 -6 1:2048 16 5-й -5 1:2048 17 -5 1:4096 18 -5 1:2048 19 -5 1:1024 20 -6 1:2048 21 -6 1:1024 22 -6 1:2048 23 -6 1:8196 Проверка генетической стабильности штамма recPR8-H5N1. Проведено секвенирование гена ГА штамма recPR8-H5N1 после 5 пассажей в КЭ, а также сравнение с первичной структурой ДНК исходной плазмиды pHW2000 со вставкой гена ГА из штамма А/ Курган/05/2005 (H5N1). При сравнении не выявлено ни одной нуклеотидной замены в последовательности из 1782 нуклеотидов. Это свидетельствует и о стабильности антигенных эпитопов, связанных с геном TA. Проверка антигенной активности штамма recPR8- H5N1. На основе рекомбинантного штамма была изготовлена эмульсионная инактивированная вакцина, которой были иммунизированы птицы опытной группы. Данные, табл. 1 свидетельствуют о том, что через 21 день после вакцинации у кур вырабатываются антитела, специфичные к антигену Н5, в титрах 8-11 log2 по результатам РТГА. При этом выработка антител, специфичных к антигену Н1, не превышает фоновых значений, характерных для контрольной группы. Таблица 4 Гемагглютинирующая активность вируса гриппа штамма recPR8-H5N1 в культуре MDCK после 3-го и 4-го пассажей при заражении клеток вирусом в разведениях 10-2- 10-6 № препарата Пассаж Степень разведения вируса (10n) Титр РГА 1 3-й -4 1:128 2 -5 1:64 3 -6 1:16 4 4-й -2 1:256 5 -3 1:64 6 -4 1:64 Сероконверсия и детекция вируса в крови и клоакальных смывах у птиц через 7-14 сут после заражения вирусом recPR8- H5N1 (4-я группа). 2-я группа не имела контакта с вирусом Группа № птицы Титр антител к H5N1 в РТГА Выявление вируса в ПЦР 7-е сутки 14-е сутки 7-е сутки 14-е сутки 2-я 2.1 1 2 1:2 Нет Нет 2.2 1: 2 1:2 п а 2.3 1 4 1:4 и п 2.4 1 2 1:2 и п 2.5 1 4 1:4 и п 2.6 1 2 1:2 и п 4-я 4.1 1 2 1:16 и п 4.2 1 2 1:8 и п 4.3 1 4 1:64 и п 4.4 1 2 1:32 и п 4.5 1 4 1:128 и п 4.6 1 2 1:64 и п Заражение вакцинированных и контрольных птиц вирусами гриппа. Заражение птиц проводили через 21 день после начала опыта (вакцинации). Результаты представлены в табл. 2. После заражения высокопатогенным вирулентным вирусом А/Курган/05/2005 (H5N1) привитые инактивированной вакциной куры в течение срока наблюдения (14 сут) остались живыми без проявления клинических и патоморфологических признаков заболевания, как и птицы 2-й контрольной группы. Невакци- нированные птицы 3-й контрольной группы погибли в пределах 3 сут после заражения. Птицы 4-й контрольной группы, зараженные полученным реассортантом recPR8-H5N1, в течение срока наблюдения оставались живыми и клинически здоровыми. Через 7 и 14 сут после заражения у этих кур, а также у птиц 2-й контрольной группы брали пробы сывороток крови и клоакальные смывы для изучения сероконверсии и детекции вируса в ПЦР. Результаты представлены в табл. 5. На 14-е сутки после заражения отмечена слабая сероконверсия у птиц 4-й группы. Титры в РТГА достигали среднего значения 5,1 log2 при фоновых значениях 1,3 log2 во 2-й незараженной группе. Вирус не был обнаружен методом ПЦР ни в крови, ни в клоакальных смывах. Обсуждение Эффективность вакцинации в значительной степени зависит от антигенного сходства между полевыми и вакцинными штаммами вируса гриппа. Антигенные различия могут существенно снизить защитный эффект, что приведет к повышенному вирусовыделению у вакцинированной птицы или к вспышкам болезни. В настоящее время ВГП А/ШШ согласно классификации ВОЗ/МЭБ/ФАО, принятой и 2011 г., разделен на 12 подгрупп на основе филогенетического анализа гена TA. Такая генетическая диверсификация, вызванная постоянной эволюцией вируса, несомненно влечет за собой и антигенную диверсификацию. При помощи моноклональных антител была проведена классификация ВГП АШ5Ш по их антигенной специфичности [14]. Анализ высокопатогенных изолятов ВГП H5N1, полученных в период с 2002 по 2007 г. в Азии, позволил выделить 4 антигенные подгруппы. Таким образом, весьма важно обеспечить точное соответствие антигенной структуры вакцинного и эпизоотического штаммов ВГП. КЭ повсеместно используют для производства антигенов ВГП с целью разработки вакцин. Однако высокопатогенные штаммы ВГП вызывают быструю гибель эмбрионов. Решить эту проблему можно путем конструирования штаммов ВГП со сниженной вирулентностью и заданной антигенной специфичностью при помощи обратной генетики. В настоящей работе с использованием метода обратной генетики был получен реассортантный штамм вируса гриппа с целью дальнейшей разработки вакцины против высоко патогенных штаммов ВГП подтипа Н5. Новый штамм recPR8-H5N1 имеет ген TA от высокопатогенного ВГП А/Курган/05/2005 (H5N1), выделенного на территории России, а остальные гены - от высокопродуктивного штамма A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Штамм recPR8-H5N1 имеет антигенную специфичность, характерную для подтипа Н5, возрастающую репродуктивную активность при пассировании в культуре клеток и 12-суточных КЭ, вызывая гибель последних в течение 36 ч. Опытная инактивированная эмульгированная вакцина, изготовленная в лаборатории на основе штамма recPR8-H5N1, защищала 1,5-месячных цыплят при контрольном заражении высокопатогенным вирусом А/Курган/05/2005 (H5N1). Заражение цыплят вирусом recPR8-H5N1 не вызвало клинических и патоморфологических проявлений болезни, вирус не обнаруживался в крови через 7 дней. При этом зарегистрирована незначительная специфическая сероконверсия на 14-е сутки после заражения. Таким образом, создан про- тотипный штамм ВГП recPR8-H5N1, который не вызывает заболевания у птицы, имеет требуемую антигенную специфичность и накапливается с высокой эффективностью при культивировании. Следующим шагом в данной работе должна стать модификация гена ГА у штамма recPR8- H5N1 с целью снизить его вирулентность для КЭ с последующим детальным изучением нового штамма в качестве вакцинного кандидата. Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения обратной генетики для быстрого конструирования реассортантов ВГП с заданной антигенной специфичностью с целью разработки вакцины, адекватной текущей эпизоотической ситуации.

References

Supplementary files