Complete genome characterization of the Kyzylagach virus (KYZV) (Togaviridae, Alphavirus, Sindbis serogroup) isolated from mosquitoes Culex modestus Ficalbi, 1889 (Culicinae) collected in a colony of herons (Ardeidae 27 Leach, 1820) in Azerbaijan

Full Text

Введение Прототипный штамм LEIV-65A вируса Кызылагач (KYZV - Kyzylagach virus) изолирован из пула комаров Culex modestus Ficalbi, 1889 (Culicinae), собранных летом 1969 г. в колонии цаплевых птиц (Ardeidae Leach, 1820) на территории Кызылагачского заповедника (39°10' с.ш., 48°58' в.д.) [1, 2], который расположен на побережье залива Кызыл-Агач Каспийского моря в южной части Азербайджана (Ленкоранский район) [3]. По данным электронной микроскопии KYZV отнесен к сем. Togaviridae, а по результатам серологического исследования - к серогруппе Синдбис (SINV - Sindbis virus) рода Alphavirus [1, 2, 4]. На основании современной классификации KYZV рассматривается как один из региональных вариантов SINV наряду с вирусами Бабанки (BNKV - Babanki virus), Окельбо (OCKV - Ockelbo virus) и карельской лихорадки (KAFV - Karelian fever virus) [5-7]. SINV и его варианты широко распространены в Европе, на Ближнем Востоке, в Африке, Юго-Восточной Азии, Австралии, на Филиппинах. Известны изоляции этого вируса в Азербайджане и Таджикистане, а в Российской Федерации - в Астраханской области, Западной Сибири (в среднем течении реки Оби). SINV вызывает у людей заболевание с острым началом, лихорадкой, сыпью, но с благоприятным исходом [6-11]. Альфавирусы в основном являются арбовирусами и связаны с комарами и птицами, что обеспечивает возможность их трансконтинентального переноса. К альфа- вирусам принадлежат опасные патогенны человека или животных, такие как вирусы SINV, вирусы восточного энцефалита лошадей (WEE - Western equine encephalitis), Чикунгунья (CHIKV - Chikungunya virus), Гета (GETV - Getah virus), Уна (UTAV - Uta virus) [5]. Геном альфавирусов представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности длиной около 11,5 тыс. н.о. Вирусная РНК кэпирована на 5’-конце и полиаде- нилирована на 3’-конце. Большая часть генома альфавирусов (около 2/3 со стороны 5’-конца) кодирует неструктурные белки, формирующие вирусный репликативный комплекс (белки nsP1, nsP2, nsP3 и nsP4). Структурные белки (core, Е3, E2, 6К и E1) транслируются с субгеном - ной РНК (26S РНК), которая образуется в процессе репликации вируса и соответствует 3’-концевой (около 4 тыс. н.о.) части генома [5]. В настоящей работе мы впервые определили полную последовательность генома KYZV, используя метод полногеномного секвенирования. На основании проведенного анализа показано, что KYZV является топо- типным для Закавказья и Средней Азии вариантом SINV (генотип IV). Материалы и методы Прототипный штамм KYZV/LEIV-65A получен из Государственной коллекции вирусов РФ ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4-е сутки) мышей забивали в соответствии с правилами этичного содержания и использования лабораторных животных. Генетическая дистанция (p-distance) между различными изолятами вируса Синдбис (SINV) по полноразмерной нуклеотидной последовательности, кодирующей области геномной РНК (неструктурные белки) Вирусы SINV 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Kyzylagach virus / LEIV-65A 1 0,01 0,19 0,19 0,19 0,19 0,18 0,19 0,25 0,37 0,42 Sindbis virus / XJ-160; AF103728 2 0,01 0,19 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,25 0,37 0,42 Sindbis virus / LEIV-9298 (Россия); JQ771799 3 0,07 0,07 0,01 0,01 0,01 0,03 0,03 0,23 0,36 0,41 Sindbis virus (Германия); JX570540 4 0,07 0,07 0,01 0,01 0,01 0,03 0,03 0,23 0,36 0,41 Ockelbo virus (Швеция); M69205 5 0,07 0,07 0,01 0,01 0,01 0,03 0,03 0,23 0,36 0,41 Sindbis virus (Финляндия); JQ771797 6 0,07 0,07 0,01 0,01 0,01 0,03 0,03 0,23 0,36 0,41 Babanki virus (Камерун); HM147984 7 0,07 0,07 0,01 0,01 0,01 0,01 0,03 0,23 0,37 0,41 Sindbis-like virus (Южная Африка); U38305 8 0,07 0,07 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,23 0,36 0,41 Sindbis virus / SW6562 (Австралия); AF429428 9 0,12 0,13 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,36 0,42 Aura virus (Бразилия); NC003900 10 0,32 0,32 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,43 Chikungunya virus; EU037962 11 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,41 0,41 Примечание. Правая верхняя часть - нуклеотидные последовательности, левая нижняя - аминокислотные; вирусы Аура (AURAV) и Чикунгунья (CHIKV) представлены как внешняя группа. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 700 мкл лизирующего буфера RLT (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделяли набором «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) из 350 мкл буфера в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с помощью флюориметра Qubit (Invitrogen, США). Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле- ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплециро- ванной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С в течение 10 мин, далее при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С в течение 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с помощью набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали, используя набор «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illumina, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США; прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек осуществляли на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора «MiSeq Reagent Kits v2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. а - дендрограмма, построенная методом ближайшего соседа, для полных нуклеотидных последовательностей кодирующей части S26-субгеномной РНК (структурные белки); б - дендрограмма для полных нуклеотидных последовательностей кодирующей части геномной РНК SINV (неструктурные белки); вирусы Аура (AURAV) и Чикунгунья (CHIKV) представлены как внешняя группа. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генома вируса Синдбис (SINV). Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили с помощью программы «CLC Genomics Workbench 5.5» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили, используя сервис BLASTX (http//blast.ncbi. nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Последовательности выравнивали по алгоритму ClustalW [12]. Генетическую дистанцию определяли по модели p-distance с попарным удалением гэпов. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с использованием программы Mega5 по методу ближайшего соседа (модель p-distance) с бутстреп-тестированием 1000 [13]. Результаты и обсуждение В результате проведенного секвенирования определили практически полную последовательность генома KYZV, включая открытые рамки считывания (ОРС) для структурных и неструктурных белков. Поскольку у альфавирусов структурные и неструктурные белки кодируют разные ОРС, молекулярно генетический и филогенетический анализ генома KYZV провели для каждой из них отдельно. Ранее для KYZV были частично определены последовательности структурных генов, на основании чего установлены его филогенетические связи с другими изолятами SINV [14]. В настоящей работе мы определили полную последовательность генома KYZV, что дало возможность провести анализ также и на основе неструкутрной части генома KYZV. На основе сравнения частичной последовательности поверхностного белка Е2, несущего основные нейтрализующие детерминанты, SINV были разделены на пять генотипов [15]. Филогенетическое разделение SINV на генотипы в целом соответствует их географическому распространению и связано с основными направлениями миграции птиц, которые являются основными позвоночными хозяевами SINV. Генотип I включает SINV из Европы и Африки. К генотипу II отнесены изоляты из Австралии и Океании, а к генотипу III - из Индии и Филиппин. Генотип V представлен единственным изолятом SINV М78 из Новой Зеландии. KYZV вместе с китайским штаммом SINV XJ-160 были отнесены к генотипу IV. В структуре генотипа I можно выделить два субкластера, один из которых включает SINV из Северной Европы и субсахариальной Африки, а другой - вирусы средиземноморского региона (Южная Европа, Северная Африка, Ближний Восток) [15]. Генетическая дистанция между вирусами разных генотипов SINV (например, между европейскими и австралийскими изолятами) составляет не более 23% по нуклеотидной последовательности генома (см. таблицу). В то же время SINV, изолированные в одном географическом регионе, характеризуются очень высокой степенью гомологии. Так, штаммы SINV, выделенные в России, Германии, Швеции (OCKV), Финляндии, обладают гомологией около 99% и по нуклеотидным и аминокислотным последовательностям неструктурной части генома (см. таблицу) [16-19]. BNKV из Камеруна, который также принадлежит генотипу I, имеет около 98% гомологии с европейскими вирусами SINV . Несмотря на высокий уровень гомологии, можно полагать, что существуют связанные с генотипом генетические детерминанты патогенности SINV, поскольку заболеваемость людей лихорадкой Синдбис (карельская лихорадка, болезнь Окельбо, болезнь Погоста, болезнь Бабанки) связана только с вирусами I генотипа европейско-южноафриканского субкластера. В то же время заболеваемость лихорадкой Синдбис на эндемичных территориях может быть обусловлена экологическими особенностями [11, 17]. В Новом свете антигенно-ближайшим к SINV вирусом можно считать вирус Аура (AURAV - Aura virus), с которым SINV имеет около 70% гомологии по белковым последовательностям (см. таблицу) [20]. AURAV был изолирован только из комаров, и сведения о его позвоночных хозяевах отсутствуют. В настоящей работе AURAV вместе с CHIKV был использован в филогенетическом анализе в качестве внешней группы (см. рисунок). KYZV обладает высокой гомологией (около 99%) с китайским изолятом SINV XJ-160, изолированным от комаров Anopheles spp. в Синьцзян-Уйгурском регионе на Северо-востоке Китая [21]. Дивергенция KYZV и XJ-160 от европейских изолятов SINV составляет 18 и 7% по нуклеотидным и аминокислотным последовательностям соответственно (см. таблицу). С австралийским изоля- том SINV SW6562 дивергенция KYZV по нуклеотидным последовательностям составляет 19%, а по аминокислотным это значение достигает 12%. Поскольку изо- лят XJ-160 обладает такой высокой гомологией с KYZV, его можно рассматривать как штамм KYZV География выделения KYZV и XJ-160 и их генетическая обособленность от европейских вирусов позволяют предположить, что KYZV является топотипным вариантом SINV, характерным для Закавказья и Средней Азии. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе полноразмерных ОРС SINV, доступных в базе данных GenBank, представлены на рисунке. Топология расположения на дендрограмме филогенетической ветви KYZV отдельно от SINV других географических регионов подтверждает его обособленный топотипный статус. При этом видно, что эволюционное разделение KYZV и европейских вариантов SINV произошло позже отделения от них австралийской группы. Экология SINV тесно связана с орнитофильными комарами: в Египте - Culex univittatus Theobald, 1901, Cx. antennatus Becker, 1903, Anopheles pharoensis Giles, 1899; Уганде - Coq. fuscopennata Theobald, 1901; Малайзии - Cx. bitaeniorhynchus Giles, 1901; Австралии - Cx. annulirostris Skuse, 1889, Aedes normanensis Taylor, 1915, Ae. vigilax Scuse, 1889. В дельте Волги SINV изолирован от Culex pipi- ens Linnaeus, 1758 в антропогенных и Anopheles hyrcanus Pallas, 1771 и Coquillettidia richiardii Ficalbi, 1889 - в природных биоценозах [8, 9]. Основное значение как хозяев SINV среди позвоночных принадлежит птицам водного и околоводного комплексов: веслоногим (Pelecaniformes Sharpe, 1891), голенастым (Ciconiiformes Bonaparte, 1854) и пластинчатоклювым (Anseriformes Wagler, 1831). Показана хроническая инфекция у птиц, что обеспечивает трансконтинентальный перенос вируса [10]. Зондирование территории Закавказья проводили в рамках Программы по биобезопасности и изучения биоразнообразия в различных экосистемах Северной Евразии и пополнения базы данных Государственной коллекции вирусов [4, 6, 7, 10, 11].

References

Supplementary files