Genetic characterization of Powassan virus (POWV) isolated from Haemaphysalis longicornis ticks in the Maritime Territory and Two Strains of the Tick-borne encephalitis virus (TBE) (Flaviviridae, Flavivirus): Alma-Arasan virus (AAV) isolated from the Ixodes persulcatus ticks in Kazakhstan and Malyshevo virus isolated from the Aedes vexans nipponii mosquitoes in the Khabarovsk Territory

Full Text

Вирус Повассан (POWV - Powassan virus) впервые выделен McLean и W. Donohue в сентябре 1958 г. из мозга умершего от энцефалита ребенка в г. Повассан на севере провинции Онтарио, Канада. Спорадические случаи инфекции выявляют в северных штатах США и на юге Канады [1-3]. POWV отнесен к группе флавивирусов (Flavivirus, сем. Bunyaviridae) млекопитающих, передаваемых клещами, куда входят также вирусы Gadgets- Gally (GGYV), болезни леса Киассанур (KFDV - Kyas- sanur Forest disease virus), Лангат (LGTV - Langat virus), Люпинг-Илл (LIV - Louping ill virus), омской геморрагической лихорадки (OHFV - Omsk hemorrhagic fever virus), Ройал-Фарм (Royal Farm virus - RFV) и клещевого энцефалита (TBEV - Tick-borne encephalitis virus) [4, 5]. На территории РФ POWV впервые выделен в 1972 г. в Приморском крае из клещей Haemaphysalis longicornis (Ixodidae: Haemaphysalinae), собранных с пятнистых оленей Cervus nippon [6]. Позднее вирус в Приморском крае выделен также от клещей Haem. concinna, Haem. japonica, Dermacentor silvarum (Rhipicephalinae), Ixodes persulcatus (Ixodidae) и от уток - чирка-свистунка Anas crecca, кряквы A. platyrhynchos, а также от больных людей [6-14]. Депонент Государственной коллекции вирусов № 705 - штамм 555, выделенный из крови больной С. на о. Русский Приморского края; авторы: Леонова Г.Н., Кругляк С.П., Львов Д.К., Скворцова Т.М.). Вирус вызывает различные формы инфекции - от инаппаратных до энцефалита с летальным исходом [7, 10, 11, 13, 15]. Среди больных с нейроинфекциями в Приморском крае в 4% в диагностических титрах выявлены антитела к POWV. Описаны летальные случаи менингоэнцефалита [10]. Вирус Алма-Арасан (AAV) изолирован от клещей Ixodes persulcatus в низкогорной части Юго-Восточного Казахстана (Алма-Атинская область) в 1977 г. (прототипный штамм AAV LEIV-1380Kaz депонирован в Государственную коллекцию вирусов под № 675; авторы Львов Д.К., Каримов С.К., Киргощенко Т.В., Громашевский В.Л., Дробищенко Н.И.) [7, 15-18]. AAV обладал односторонней антигенной связью с POWV, на основании чего он был предварительно охарактеризован как вирус, анти- генно близкий к POWV. Выявлены случаи заболевания людей, протекающие с явлениями менингита. Антитела к AAV выявлены у грызунов (у желтого суслика - Citellus fulvus), сельскохозяйственных животных, у людей [14]. Вирус Малышево изолирован из пула комаров Aedes vexans nipponii, отловленных в 1978 г. в подзоне хвойношироколиственных лесов, на северном побережье озера Петропавловское в Хабаровском крае (48°40’ с.ш, 135°40’ в.д.) [19-21]. На основании антигенных реакций вирус Ма- лышево предварительно классифицирован как изолят вируса Негиши (Negishi virus - NEGV), впервые выделенного в 1946 г. в Токио из спинномозговой жидкости 6-летнего ребенка с клиническим диагнозом японского энцефалита [22] и отнесенного к комплексу клещевого энцефалита [22, 23]. В настоящее время NEGV рассматривается как изолят LIV В РФ штаммы, антигенно близкие к NEGV, изолированы в 1971 г. в Загорском районе Московской области от клещей Ixodes ricinus, собранных в 1971 г. с коров на территории Хотьковского сельсовета [24-28]. В настоящей работе методом полногеномного сек- венирования определены полные последовательности генома POWV (штамм LEIV-3070Prm), AAV (штамм LEIV-1380Kaz) и вируса Малышево. Показано, что AAV и вирус Малышево являются штаммами вируса клещевого энцефалита Сибирского и Дальневосточного генотипов соответственно. Материалы и методы Вирусные штаммы. Штаммы POWV (LEIV-3070Prm), AAV (LEIV-1380Kaz) и Малышево получены из Государственной коллекции вирусов при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России. Работы с инфекционным материалом, связанные с получением и накоплением вируса, проводили в боксовых помещениях, оборудованных и сертифицированных для работы с микроорганизмами II группы патогенности. Для восстановления вируса лиофилизированную суспензию восстановили в 1 мл культуральной среды ДМЕМ (с добавлением антибиотика) и использовали для интрацеребрального заражения новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-3 сут) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 1 мл реагента TRIzol (Life Technology, США) и гомогенизировали пластиковым пестиком. Далее выделяли РНК согласно прилагаемой инструкции производителя данного реагента. Конечный осадок суммарной РНК растворяли в 100 мкл DEPC- обработанной воды. Для дополнительной очистки, а также для удаления низкомолекулярных фракций рибосомальной (5 S) и транспортной РНК полученный препарат был очищен набором Рис. 1. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения аминокислотных последовательностей полипротеина-предшественника вирусов сероком- плекса TBEV (род Flavivirus, сем. Bunyaviridae). Положение на дендрограмме AAV (LEIV -1380Kaz) (KJ744033), (KJ744034) и POWV LEIV-3070Prm указано черным кружком. TBEV Far-Eastern subtype DQ862460 TBEV Far-East (Spassk-72) JQ825151 # TBEV strain Malishevo 66j-• TBEV Alma-Arasan LEIV-Kaz1380 J- TBEV Siberian (Vasilchenko) L40361 99 L TBEV Siberian subtype AF527415 99 ■- TBEV European (Ljubljana I) JQ654701 L-TBEV European subtype U27495 100 ■ Negishi virus M94956 Louping ill virus D12937 - Louping ill virus X86784 TBEV Far-Eastern TBEV Siberian TBEV European 59 97 С Louping ill virus - Louping iill (Spanish) DQ236152 - Turkish sheep enceph virus DQ235151 ■ Greek goat enceph virus DQ235153 -------------------- POWV LB L06436 Рис. 2. Результаты филогенетического анализа TBEV и LIV, проведенного на основе сравнения последовательностей оболочечного белка E. AAV (LEIV -1380Kaz) (KJ744033) и (KJ744034) обозначены черным кружком. «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) в режиме clean-up на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли, используя флюориметр Qubit (Invit- rogen, США). Для удаления рибосо- мальной (18 и 28 S) РНК применяли набор «GenRead rRNA depletion Kit» (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для этого брали не более 3 мкг суммарной РНК. Эффективность деплеции достигала 5080%, и, таким образом, количество полученной РНК для дальнейшего анализа составляло около 300 нг. Подготовка ДНК-библиотек и сек- венирование. Для получения кДНК около 100 нг деплецированной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскрипта- зы с гексапраймером при 85°С в течении 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С в течение 10 мин, далее при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С в течение 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illumina, США) в соответствии с инструкцией. Для селекции ДНК по размеру использовали реагент «AMpure XP» (Beckman Coulter, США) с расчетом получения ДНК-библиотек длиной более 270 н.о., что соответствует размеру вставки около 150 н.о. Данные требования к размеру ДНК-библиотек связаны с использованием для секвенирования набора, позволяющего секвенировать не более 150 н.о. в одну сто- 52 рону. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек осуществляли на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора «MiSeq Reagent Kits v2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили, используя программу «CLC Genomics Workbench 6.0» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей осуществляли с помощью сервиса BLASTX (http://blast. ncbi.nlm.nih.gov). Для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму Clustal W. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли с использованием программы Mega5 по алгоритму ближайшего соседа (neighbor- joining) или максимального правдоподобия (maximum likelihood) с 1000-кратным бутстреп-тестированием. Результаты и обсуждение TBEV широко распространен практически по всей территории Северной Евразии. Антигенно и филогенетически выделяют три субтипа (генотипа) TBEV: Западный (или Европейский; также встречается обозначение Центрально-Европейский субтип - CEEV; прототипный штамм Neudoerfl (U27495)); Сибирский (или Уральский, прототипные штаммы Aina (JN003206) и Vasilchenko (L40361)); Дальневосточный (прототипный штамм Sofjin-Chumakov (KC806252)) [29, 30]. В настоящей работе проведено полногеномное секве- нирование двух изолятов (AAV (LEIV - 1380Kaz) и вирус Малышево), которые были предварительно классифицированы как вирусы, антигенно связанные с POWV и NEGV соответственно. Определили практически полные последовательности генома AAV (LEIV - 1380Kaz) (KJ744033) и вируса Малышево (KJ744034), который, как и у всех флавивирусов, представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности длиной около 11 тыс. н.о., которая кодирует полипротеин-предшественник вирусных структурных и неструктурных белков. Результаты предварительного анализа полученных последовательностей генома позволили классифицировать AAV (LEIV - 1380Kaz) и вирус Малышево как изоляты TBEV. Сравнительный анализ полных последовательностей генома AAV (LEIV - 1380Kaz) с другими вариантами TBEV показали, что наиболее высокой степенью гомологии (94,6%) AAV обладает со штаммами TBEV, изолированными в Забайкалье (Vasilchenko, Сhita-653, Irkutsk-12, Aino). По аминокислотной последовательности полипротеина- предшественника гомология AAV (LEIV -1380Kaz) с про- тотипным для Сибирского генотипа штаммом Vasilchenko достигает 98,3%. Штамм Малышево наиболее близок (96,4% по нуклеотидной и 98,3% по аминокислотной последовательности соответственно) штаммам TBEV, изолированным на Дальнем Востоке (1230, Spassk-72, Primorye-89). Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения полноразмерной последовательности полипротеина-предшественника, представлены на рис. 1. Положение AAV (LEIV - 1380Kaz) и вируса Малышево на дендрограмме позволяет заключить, что они принадлежат различным генотипам TBEV, что согласуется с географией их изоляции. AAV (LEIV - 1380Kaz) принадлежит Сибирскому субтипу TBEV, а вирус Малышево отнесен к Дальневосточному генотипу (см. рис. 1). Поскольку при первоначальном изучении штамма Малышево обнаружены антигенные связи с NEGV, провели более подробный филогенетический анализ на основе последовательности поверхностного белка Е (рис. 2). В настоящее время NEGV вследствие генетической близости рассматривается как изолят LIV, а не как самостоятельный вирус. На дендрограмме, представленной на рис. 2, различные варианты LIV, включая NEGV, формируют отдельную ветвь, близкую к TBEV Европейского генотипа. Положение штамма Малышево на дендрограмме остается в составе Дальневосточного генотипа TBEV. В работе определена полная последовательность генома штамма LEIV-3070Prm вируса Повассан (POWV), изолированного от клещей в Приморье в 1977 г. POWV вместе с другими антигенно близкими к TBEV входит в сероком- плекс TBEV (см. рис. 1). POWV широко распространен в Северной Америке и на Дальнем Востоке России [31, 32]. Результаты анализа полученной последовательности показали, что POWV LEIV-3070Prm обладает 99,7% гомологии с прототипным штаммом POWV LB, изолированным в Канаде, и 99,5% гомологии с дальневосточными изолятами POWV (Spassk-9 и Nadezdinsk-1991). Эти данные согласуются с ранее показанной высокой степенью гомогенности циркулирующей в Северной Америке и на Дальнем Востоке популяции POWV [32]. Зондирование территорий и Казахстана проводили в рамках программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в разных экосистемах Северной Евразии [27, 33-35]

References

Supplementary files