Генетическая характеристика вируса Повассан (POWV - Powassan virus), изолированного от клещей Haemaphysalis longicornis в Приморском крае, и двух штаммов вируса клещевого энцефалита (Flaviviridae, Flavivirus): Алма-Арасан (AAV - Alma-Arasan virus), изолированного от клещей Ixodes persulcatus в Казахстане, и Малышево, изолированного от комаров Aedes vexans nipponii в Хабаровском крае


Цитировать

Полный текст

Аннотация

В работе методом полногеномного секвенирования определены полные последовательности генома трех клещевых флавивирусов (род Flavivirus, сем. Bunyaviridae): Повассан (Powassan virus - POWV, штамм LEIV-3070Prm, изолирован от иксодовых клещей Haemaphysalis longicornis в 1973 г. в Приморском крае), Алма-Арасан (Alma-Arasan virus - AAV, штамм LEIV-1380Kaz, выделен из клещей Ixodes persulcatus в Казахстане в 1977 г.) и вируса Малышево (Malyshevo virus изолирован из пула комаров Aedes vexans nipponii в 1978 г. в Хабаровском крае). Показано, что AAV и вирус Малышево являются штаммами вируса клещевого энцефалита Сибирского и Дальневосточного генотипов соответственно (GenBank ID: AAV KJ744033; штамм Малышево KJ744034). Филогенетически AAV наиболее близок (94,6% гомологии по нуклеотидной и 98,3% по аминокислотной последовательности) к штаммам TBEV, изолированным в Забайкалье (Vasilchenko, Chita-653, Irkutsk-12, Aino). Штамм Малышево наиболее близок (96,4 и 98,3%) к штаммам TBEV, изолированным на Дальнем Востоке (1230, Spassk-72, Primorye-89). POWV LEIV-3070Prm обладает 99,7% гомологии с прототипным штаммом POWV LB, изолированным в Канаде, и 99,5% гомологии с дальневосточными изолятами POWV (Spassk-9 и Nadezdinsk-1991).

Полный текст

Вирус Повассан (POWV - Powassan virus) впервые выделен McLean и W. Donohue в сентябре 1958 г. из мозга умершего от энцефалита ребенка в г. Повассан на севере провинции Онтарио, Канада. Спорадические случаи инфекции выявляют в северных штатах США и на юге Канады [1-3]. POWV отнесен к группе флавивирусов (Flavivirus, сем. Bunyaviridae) млекопитающих, передаваемых клещами, куда входят также вирусы Gadgets- Gally (GGYV), болезни леса Киассанур (KFDV - Kyas- sanur Forest disease virus), Лангат (LGTV - Langat virus), Люпинг-Илл (LIV - Louping ill virus), омской геморрагической лихорадки (OHFV - Omsk hemorrhagic fever virus), Ройал-Фарм (Royal Farm virus - RFV) и клещевого энцефалита (TBEV - Tick-borne encephalitis virus) [4, 5]. На территории РФ POWV впервые выделен в 1972 г. в Приморском крае из клещей Haemaphysalis longicornis (Ixodidae: Haemaphysalinae), собранных с пятнистых оленей Cervus nippon [6]. Позднее вирус в Приморском крае выделен также от клещей Haem. concinna, Haem. japonica, Dermacentor silvarum (Rhipicephalinae), Ixodes persulcatus (Ixodidae) и от уток - чирка-свистунка Anas crecca, кряквы A. platyrhynchos, а также от больных людей [6-14]. Депонент Государственной коллекции вирусов № 705 - штамм 555, выделенный из крови больной С. на о. Русский Приморского края; авторы: Леонова Г.Н., Кругляк С.П., Львов Д.К., Скворцова Т.М.). Вирус вызывает различные формы инфекции - от инаппаратных до энцефалита с летальным исходом [7, 10, 11, 13, 15]. Среди больных с нейроинфекциями в Приморском крае в 4% в диагностических титрах выявлены антитела к POWV. Описаны летальные случаи менингоэнцефалита [10]. Вирус Алма-Арасан (AAV) изолирован от клещей Ixodes persulcatus в низкогорной части Юго-Восточного Казахстана (Алма-Атинская область) в 1977 г. (прототипный штамм AAV LEIV-1380Kaz депонирован в Государственную коллекцию вирусов под № 675; авторы Львов Д.К., Каримов С.К., Киргощенко Т.В., Громашевский В.Л., Дробищенко Н.И.) [7, 15-18]. AAV обладал односторонней антигенной связью с POWV, на основании чего он был предварительно охарактеризован как вирус, анти- генно близкий к POWV. Выявлены случаи заболевания людей, протекающие с явлениями менингита. Антитела к AAV выявлены у грызунов (у желтого суслика - Citellus fulvus), сельскохозяйственных животных, у людей [14]. Вирус Малышево изолирован из пула комаров Aedes vexans nipponii, отловленных в 1978 г. в подзоне хвойношироколиственных лесов, на северном побережье озера Петропавловское в Хабаровском крае (48°40’ с.ш, 135°40’ в.д.) [19-21]. На основании антигенных реакций вирус Ма- лышево предварительно классифицирован как изолят вируса Негиши (Negishi virus - NEGV), впервые выделенного в 1946 г. в Токио из спинномозговой жидкости 6-летнего ребенка с клиническим диагнозом японского энцефалита [22] и отнесенного к комплексу клещевого энцефалита [22, 23]. В настоящее время NEGV рассматривается как изолят LIV В РФ штаммы, антигенно близкие к NEGV, изолированы в 1971 г. в Загорском районе Московской области от клещей Ixodes ricinus, собранных в 1971 г. с коров на территории Хотьковского сельсовета [24-28]. В настоящей работе методом полногеномного сек- венирования определены полные последовательности генома POWV (штамм LEIV-3070Prm), AAV (штамм LEIV-1380Kaz) и вируса Малышево. Показано, что AAV и вирус Малышево являются штаммами вируса клещевого энцефалита Сибирского и Дальневосточного генотипов соответственно. Материалы и методы Вирусные штаммы. Штаммы POWV (LEIV-3070Prm), AAV (LEIV-1380Kaz) и Малышево получены из Государственной коллекции вирусов при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России. Работы с инфекционным материалом, связанные с получением и накоплением вируса, проводили в боксовых помещениях, оборудованных и сертифицированных для работы с микроорганизмами II группы патогенности. Для восстановления вируса лиофилизированную суспензию восстановили в 1 мл культуральной среды ДМЕМ (с добавлением антибиотика) и использовали для интрацеребрального заражения новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-3 сут) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 1 мл реагента TRIzol (Life Technology, США) и гомогенизировали пластиковым пестиком. Далее выделяли РНК согласно прилагаемой инструкции производителя данного реагента. Конечный осадок суммарной РНК растворяли в 100 мкл DEPC- обработанной воды. Для дополнительной очистки, а также для удаления низкомолекулярных фракций рибосомальной (5 S) и транспортной РНК полученный препарат был очищен набором Рис. 1. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения аминокислотных последовательностей полипротеина-предшественника вирусов сероком- плекса TBEV (род Flavivirus, сем. Bunyaviridae). Положение на дендрограмме AAV (LEIV -1380Kaz) (KJ744033), (KJ744034) и POWV LEIV-3070Prm указано черным кружком. TBEV Far-Eastern subtype DQ862460 TBEV Far-East (Spassk-72) JQ825151 # TBEV strain Malishevo 66j-• TBEV Alma-Arasan LEIV-Kaz1380 J- TBEV Siberian (Vasilchenko) L40361 99 L TBEV Siberian subtype AF527415 99 ■- TBEV European (Ljubljana I) JQ654701 L-TBEV European subtype U27495 100 ■ Negishi virus M94956 Louping ill virus D12937 - Louping ill virus X86784 TBEV Far-Eastern TBEV Siberian TBEV European 59 97 С Louping ill virus - Louping iill (Spanish) DQ236152 - Turkish sheep enceph virus DQ235151 ■ Greek goat enceph virus DQ235153 -------------------- POWV LB L06436 Рис. 2. Результаты филогенетического анализа TBEV и LIV, проведенного на основе сравнения последовательностей оболочечного белка E. AAV (LEIV -1380Kaz) (KJ744033) и (KJ744034) обозначены черным кружком. «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) в режиме clean-up на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли, используя флюориметр Qubit (Invit- rogen, США). Для удаления рибосо- мальной (18 и 28 S) РНК применяли набор «GenRead rRNA depletion Kit» (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для этого брали не более 3 мкг суммарной РНК. Эффективность деплеции достигала 5080%, и, таким образом, количество полученной РНК для дальнейшего анализа составляло около 300 нг. Подготовка ДНК-библиотек и сек- венирование. Для получения кДНК около 100 нг деплецированной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскрипта- зы с гексапраймером при 85°С в течении 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С в течение 10 мин, далее при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С в течение 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illumina, США) в соответствии с инструкцией. Для селекции ДНК по размеру использовали реагент «AMpure XP» (Beckman Coulter, США) с расчетом получения ДНК-библиотек длиной более 270 н.о., что соответствует размеру вставки около 150 н.о. Данные требования к размеру ДНК-библиотек связаны с использованием для секвенирования набора, позволяющего секвенировать не более 150 н.о. в одну сто- 52 рону. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек осуществляли на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора «MiSeq Reagent Kits v2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили, используя программу «CLC Genomics Workbench 6.0» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей осуществляли с помощью сервиса BLASTX (http://blast. ncbi.nlm.nih.gov). Для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму Clustal W. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли с использованием программы Mega5 по алгоритму ближайшего соседа (neighbor- joining) или максимального правдоподобия (maximum likelihood) с 1000-кратным бутстреп-тестированием. Результаты и обсуждение TBEV широко распространен практически по всей территории Северной Евразии. Антигенно и филогенетически выделяют три субтипа (генотипа) TBEV: Западный (или Европейский; также встречается обозначение Центрально-Европейский субтип - CEEV; прототипный штамм Neudoerfl (U27495)); Сибирский (или Уральский, прототипные штаммы Aina (JN003206) и Vasilchenko (L40361)); Дальневосточный (прототипный штамм Sofjin-Chumakov (KC806252)) [29, 30]. В настоящей работе проведено полногеномное секве- нирование двух изолятов (AAV (LEIV - 1380Kaz) и вирус Малышево), которые были предварительно классифицированы как вирусы, антигенно связанные с POWV и NEGV соответственно. Определили практически полные последовательности генома AAV (LEIV - 1380Kaz) (KJ744033) и вируса Малышево (KJ744034), который, как и у всех флавивирусов, представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности длиной около 11 тыс. н.о., которая кодирует полипротеин-предшественник вирусных структурных и неструктурных белков. Результаты предварительного анализа полученных последовательностей генома позволили классифицировать AAV (LEIV - 1380Kaz) и вирус Малышево как изоляты TBEV. Сравнительный анализ полных последовательностей генома AAV (LEIV - 1380Kaz) с другими вариантами TBEV показали, что наиболее высокой степенью гомологии (94,6%) AAV обладает со штаммами TBEV, изолированными в Забайкалье (Vasilchenko, Сhita-653, Irkutsk-12, Aino). По аминокислотной последовательности полипротеина- предшественника гомология AAV (LEIV -1380Kaz) с про- тотипным для Сибирского генотипа штаммом Vasilchenko достигает 98,3%. Штамм Малышево наиболее близок (96,4% по нуклеотидной и 98,3% по аминокислотной последовательности соответственно) штаммам TBEV, изолированным на Дальнем Востоке (1230, Spassk-72, Primorye-89). Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения полноразмерной последовательности полипротеина-предшественника, представлены на рис. 1. Положение AAV (LEIV - 1380Kaz) и вируса Малышево на дендрограмме позволяет заключить, что они принадлежат различным генотипам TBEV, что согласуется с географией их изоляции. AAV (LEIV - 1380Kaz) принадлежит Сибирскому субтипу TBEV, а вирус Малышево отнесен к Дальневосточному генотипу (см. рис. 1). Поскольку при первоначальном изучении штамма Малышево обнаружены антигенные связи с NEGV, провели более подробный филогенетический анализ на основе последовательности поверхностного белка Е (рис. 2). В настоящее время NEGV вследствие генетической близости рассматривается как изолят LIV, а не как самостоятельный вирус. На дендрограмме, представленной на рис. 2, различные варианты LIV, включая NEGV, формируют отдельную ветвь, близкую к TBEV Европейского генотипа. Положение штамма Малышево на дендрограмме остается в составе Дальневосточного генотипа TBEV. В работе определена полная последовательность генома штамма LEIV-3070Prm вируса Повассан (POWV), изолированного от клещей в Приморье в 1977 г. POWV вместе с другими антигенно близкими к TBEV входит в сероком- плекс TBEV (см. рис. 1). POWV широко распространен в Северной Америке и на Дальнем Востоке России [31, 32]. Результаты анализа полученной последовательности показали, что POWV LEIV-3070Prm обладает 99,7% гомологии с прототипным штаммом POWV LB, изолированным в Канаде, и 99,5% гомологии с дальневосточными изолятами POWV (Spassk-9 и Nadezdinsk-1991). Эти данные согласуются с ранее показанной высокой степенью гомогенности циркулирующей в Северной Америке и на Дальнем Востоке популяции POWV [32]. Зондирование территорий и Казахстана проводили в рамках программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в разных экосистемах Северной Евразии [27, 33-35]
×

Список литературы

  1. Powassan - POWV. In: Karabatsos N., ed. International catalogue of arboviruses and certain other viruses of vertebrates. San Antonio, Texas: Am. Soc. Trop. Med. Hyg.; 1985: 827-8.
  2. Artsob H. Powassan encephalitis. In: Monat T.P., ed. The arboviruses: epidemiology and ecology. Boca Raton: CRE Press; 1988: 29-31.
  3. McLean D.M., Ladyman S.R., Purvin-Good K.W. Westward extension of Powassan virus prevalence. Can. Med. Assoc. J. 1968; 98(20): 946-9.
  4. Mandl C.W., Holzmann H., Kunz C., Heinz F.X. Complete genomic sequence of Powassan virus: evaluation of genetic elements in tick-borne versus mosquito-borne flaviviruses. Virology. 1993; 194(1): 173-84.
  5. Simmonds P., Becker P., Collet M.S., Coved E.A., Heinz F.X., Meyers G. Flaviviridae. In: King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J., eds. Virus taxonomy. 9th Rep ort of the International Committee Taxonomy of Viruses. London: Elsevier; 2012: 1003-20.
  6. Львов Д.К., Леонова Г.Н., Громашевский В.Л., Бекикова Н.П., Березина Л.К., Сафронов А.В. Изоляция вируса Повассан из клещей Haemophysalis neumanni Donitz, 1905, в Приморском крайе. Вопросы вирусологии. 1974; 5: 538-9.
  7. Lvov D.K. Arboviral zoonoses of Northern Eurasia (Eastern Europe and the commonwealth of independent states). In: Beran G.W., ed. Handbook of zoonoses. Sec. ed. Section B: Viral. London, Tokyo: CRC Press; Boca Raton: AMArbar; 1994: 237-60.
  8. Кругляк С.П., Леонова Г.Н., Экологические особенности вируса Повассан в Приморском крае. В кн.: Львов Д.К., ред. Арбовирусы и арбовирусные инфекции: Материалы международного симпозиума. М.; 1989: 17-8.
  9. Леонова Г.Н. Вирусы, выделенные из клещей в Приморском крае. Дисс.. канд. мед. наук. Владивосток; 1976.
  10. Леонова Г.Н., Исачкова Л.М. Менингоэнцефалит, вызванный вирусом Повассан в Приморском крае. В кн.: Гайдамович С.Я., ред. Арбовирусы. М.: АМН СССР; 1981: 107-11.
  11. Леонова Г.Н., Исачкова Л.М., Баранов Н.И. Изучение роли вируса Повассан в этиологической структуре клещевого энцефалита в Приморском крае. Вопросы вирусологии. 1980; 2: 173-6.
  12. Львов Д.К. Природные очаги связанных с птицами арбовирусов в СССР. В кн.: Львов Д.К., Ильичев В.Д., ред. Миграция птиц и перенос возбудителей инфекции. М.: Наука; 1979: 37-101.
  13. Львов Д.К. Арбовирусные инфекции в Средней части умеренного пояса СССР. В кн.: Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я., ред. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: Медицина; 1989: 269-89.
  14. Львов Д.К., Громашевский В.Л., Скворцова Т.М., Сидорова Г.А., Ямникова С.С., Березина Л.К. Выделение вирусов из природных источников в СССР. В кн.: Львов Д.К., ред. Актуальные вопросы общей и медицинской вирусологии. М.: АМН СССР; 1986: 28-37.
  15. Львов Д.К. Энцефалит Повассан. В кн.: Львов Д.К., ред. Вирусы и вирусные инфекции. М.: МИА; 2013: 770-1.
  16. Каримов С.К. Арбовирусы Казахстанского региона. Дисс.. д-ра мед. наук. Алма-Ата; 1983.
  17. Львов Д.К. Изоляция вирусов из природных источников в СССР В кн.: Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я., ред. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: Медицина; 1989: 220-35.
  18. Львов Д.К. Арбовирусные инфекции в субтропиках и на юге умеренного пояса СССР. В кн.: Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я., ред. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: Медицина; 1989: 235-49.
  19. Воробьева Р.Н., Иванов Л.И., Волков В.И., Скворцова Т.М., Здановская Н.И., Морозова Т.Н. и др. Арбовирусы в Приамурье и на Сахалине. В кн.: Львов Д.К., ред. ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Серия: Вирусология: Арбовирусы и арбовирусные инфекции. Ч. 1. М.: РАН; 1992: 10-6.
  20. Гайдамович С.Я., Деменев В.А., Рослан И.Г., Обухова В.Р., Конинская А.И. Штамм «Малышево» вируса Негиши. Паспорт штамма 2КВ № 682. 1978.
  21. Воробьева Р.Н., Иванов Л.И., Артюян Н.И., Скворцова Т.М., Морозова Т.Н., Гущина Е.А. и др. К вопросу о распространении арбовирусов в Приамурье и на Сахалине. В кн.: Львов Д.К., ред. ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Серия: Вирусология: Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: РАН; 1991: 8-9.
  22. Ando K. et al. Kitasato Arch. o Exp. Med. 1952; 24: 49-61.
  23. Negishi (NEGV). In: Karabatsos N., ed. International catalogue of arboviruses including certain other viruses of vertebrates. San Antonio, Texas: Am. Soc. Trop. Med. Hyg.; 1975: 733-4.
  24. Линев М.Б., Чумаков М.П., Рубин С.Г., Гавриловская И.Н. Загорский арбовирус, выделенный в очаге москитной лихорадки - новый представитель в антигенной подгруппе клещевого энцефалита. В кн.: Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов: Актуальные проблемы вирусологии и профилактики вирусных заболеваний. М.; 1972: 254-5.
  25. Линев М.Б., Чумаков М.П., Рубин С.Г., Гавриловская И.Н. Выделение трех штаммов вируса Негиши из клещей Ixodes ricinus, собранных в Загорском районе Московской области. В кн.: Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов. М.; 1973; т. 21 (вып. 2): 184-9.
  26. Львов Д.К. Арбовирусные инфекции в Средней части умеренного пояса СССР. В кн.: Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я., ред. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: Медицина; 1989: 249-69.
  27. Lvov D.K. Ecological soundings of the former USSR territory for natural foci of arboviruses. In: Sov. Med. Rev. E. Virology Reviews. USA: Harwood Ac. Publ. GmbH; 1993: 1-47.
  28. Львов Д.К., Громашевский В.Л., Скворцова Т.М., Сидорова Г.А., Ямникова С.С., Березина Л.К. и др. Изоляция вирусов из природных источников в СССР. В кн.: Львов Д.К., ред. Актуальные вопросы общей и медицинской вирусологии. М.: АМН СССР; 1986: 28-37.
  29. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis. Antiviral Res. 2003; 57(1-2): 129-46.
  30. Kulakova N.V., Andaev E.I., Belikov S.I. Tick-borne encephalitis virus in Eastern Siberia: complete genome characteristics. Arch. Virol. 2012; 157(11): 2253-5.
  31. Deardorff E.R., Nofchissey R.A., Cook J.A., Hope A.G., Tsvetkova A., Talbot S.L. et al. Powassan virus in mammals, Alaska and New Mexico, U.S.A., and Russia, 2004-2007. Emerg. Infect. Dis. 2013; 19(12): 2012-6.
  32. Leonova G.N., Kondratov I.G., Ternovoi V.A., Romanova E.V., Protopopova E.V., Chausov E.V. et al. Characterization of Powassan viruses from Far Eastern Russia. Arch. Virol. 2009; 154(5): 811-20.
  33. Львов Д.К. Экология вирусов. В кн.: Львов Д.К., ред. Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. М.: МИА; 2013: 66-86.
  34. Львов Д.К., Дерябин П.Г., Аристова В.А., Бутенко А.М., Галкина И.В., Громашевский В.Л. Атлас распространения возбудителей природно-очаговых вирусных инфекций на территории Российской Федерации. М.: Издательство НПЦ ТМГ Мз РФ; 2001.
  35. Львов Д.К., ред. Организация эколого-эпидемиологического мониторинга территорий Российской Федерации с целью противоэпидемической защиты населения и войск. Методические рекомендации. М.: МЗ РФ, Федеральное управление медико-биологических и экстремальных проблем, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН; 1993.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Львов Д.К., Альховский С.В., Щелканов М.Ю., Щетинин А.М., Дерябин П.Г., Гительман А.К., Ботиков А.Г., Аристова В.А., 2014

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах