Pathogenicity of Noncytophatic Isolates of Bovine Viral Diarrhea Virus in Experimentally Infected Seronegative Calves

Full Text

Вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек (ВД-БС) крупного рогатого скота (КРС), широко распространена во всем мире и наносит значительный экономический ущерб молочному и мясному скотоводству. Возбудитель болезни - вирус семейства Flaviviridae рода Pestivirus. Идентифицированы два его биотипа - цитопатогенный (ЦП) и нецитопа- тогенный (НЦП), а также два генотипа - 1 и 2 [1]. Первый генотип вируса распространен повсеместно и насчитывает до 11 субгенотипов [2], второй, представленный двумя субгенотипами, циркулирует, в основном, в США и Канаде. Оба генотипа могут иметь как ЦП-, так и НЦП-биотип. Болезнь чаще протекает субклинически [1, 3-4]. В природе преобладает НЦП-биотип, который имеет наибольшее эпизоотологическое значение и является наиболее вирулентным, поскольку вызывает трансплацентарную инфекцию, приводящую к репродуктивным нарушениям у коров и персистентной инфекции (ПИ) плода, а также иммуносупрессию при острых постнатальных формах инфекции. Механизм иммуносупрессивного действия вируса включает лейкопению, снижение пролиферации лимфоцитов, истоще- Изолят/источник выделения Субгенотип Форма проявления болезни Длительность лейкопении (дни); ее значения (кл/мм3) Сероконверсия (+; -) Выявление генома вируса в органах Бизон/легкие теленка 1d Острая (слабое ОРЗ, диарея) 4-9; до 3200 + Лимфоидные органы, эпителий кишечника и респираторные органы Т-2/сперма ПИ-быка- производителя 1а Субклиническая 4-8; до 3500 ± Лимфоидные и респираторные органы Бор/сыворотка крови ПИ-телки 1b Субклиническая 3-9; до 3600 + Лимфоидные органы ние лимфоидной ткани, понижение хемотаксиса и фагоцитарной активности, повышение выработки простагландина Е2 и нарушение выработки провоспалительных цитокинов [1, 3, 5-8], которая носит транзитный (2-3 нед) либо длительный характер у ПИ-животных. Считается, что вирус не является прямым респираторным патогеном, однако способность вызывать иммуносупрессию значительно повышает риск возникновения респираторных болезней у телят, связанный, в частности, с размножением вирусов других нозологических групп и бактерий семейства Pasteurellaceae [1, 8, 9]. С учетом существования вируса в виде двух биотипов интерес исследователей всего мира вызывает определение его вирулентности и способности индуцировать развитие инфекционного процесса в организме восприимчивых животных. В доступной отечественной литературе данных о патогенности НЦП-изолятов вируса для телят мы не нашли, за исключением сообщения Г.К. Юрова и соавт. [4] об активной циркуляции в популяциях домашнего скота и диких животных РФ двух антигенно различающихся НЦП-штаммов вируса субгенотипов 1а и 1 m. Целью данной работы стало определение вирулентности НЦП-изолятов трех субгенотипов вируса ВД-БС КРС первого генотипа, выделенных нами от больных животных в 19992006 гг., для серонегативных телят. Материалы и методы Подготовку проб, процедуру выделения, титрования и ге- нотипирования изолятов вируса проводили в соответствии с методикой, описанной ранее [10, 11]. Серологические исследования с целью установления сероконверсии к вирусу проводили при помощи реакции нейтрализации (РН) микрометодом согласно стандарту МЭБ с использованием ЦП-штамма ВК-1, относящегося к первому генотипу. Распространение генома вируса во внутренних органах инфицированных животных изучали при помощи полимеразно-цепной реакции (ПЦР) [11]. Изоляты вируса. Для экспериментального инфицирования использовали три НЦП-изолята вируса: Бизон (субгенотип 1d), Т-2 (1а) и Бор (1b), типированные нами ранее [11]. Опытные животные. 12 серонегативных телят чернопестрой породы в возрасте 4-6 мес живой массой 150 кг, подобранных по принципу аналогов, не содержащих в крови вирус ВД-БС по данным ПЦР и антител к нему, разделенных на три опытные и одну контрольную группы по три головы в каждой. Телята выращены в условиях метода умереннопониженных температур и не подвергались воздействию стрессов, включая транспортный и кормовой. Они были также серонегативными к вирусу инфекционного ринотрахеита КРС, что исключало наличие смешанной инфекции. Экспериментальное заражение осуществляли при помощи генератора аэрозоля БГ-2, создавая аэрозоль с медианномассовым аэродинамическим диаметром частиц 1,1 мкм так, как это было описано ранее [10]. Суспензию вирусов вводили интраназально в дозе 4 • 105,5-6,0 ТЦД50/01см3. Контрольным животным таким же способом вводили физиологический раствор. За всеми животными в течение 25 дней проводили клинические наблюдения с ежедневной термометрией, отбором проб крови для определения гематологических показателей. Пробы сыворотки крови отбирали до заражения и в день окончания опыта для выявления сероконверсии. На 12-13-е сутки опыта подвергали убою по одному теленку из каждой опытной группы с целью выявления патологоанатомических изменений во внутренних органах и генома вируса в них. Для этого отбирали пробы слизистой оболочки носа, трахеи, носоглотки, тимуса, легочных и мезентериальных лимфатических узлов, бронхов, трахеального и бронхиального экссудатов, легких, миндалин, селезенки, тонкого и толстого отделов кишечника. Реультаты и обсуждение Результаты исследований показали, что все, использованные для заражения НЦП-изоляты вируса (см. таблицу), индуцировали развитие инфекционного процесса в организме зараженных животных, однако интенсивность его проявления была разной. Наиболее вирулентным оказался изолят Бизон, вызвавший у всех инфицированных животных (№ 1909, 1969 и 1916) клинические признаки легкого респираторного заболевания, проявлявшегося в виде угнетения общего состояния на 4-5-е сутки после заражения, отказа от корма, повышения температуры тела до 41,9оС, выделения серозного экссудата из носовой полости и глаз, кратковременной диареи с примесью крови. Уровень лейкопении находился в пределах 3200-2700 кл/мм3. У одного опытного теленка отмечали кратковременное увеличение предлопаточного лимфоузла. Инфицированные животные выздоровели на 15-е сутки после заражения. На вскрытии трупа теленка из этой опытной группы регистрировали наличие серозного экссудата в верхних респираторных путях и гиперемию тонкого отдела кишечника. Геном вируса выявили во всех исследованных пробах внутренних органов, что свидетельствует о широком тропизме изолята к лимфоидным органам, а также к клеткам эпителия кишечника и респираторного тракта. На введение изолята Бор все инфицированные животные (№ 1913, 1982 и 1974) реагировали незначительным угнетением общего состояния, отказом от корма с 6-х по 10-е сутки после заражения. У них на 5-е сутки после заражения регистрировали повышение температуры тела в среднем до 41,2оС и ее снижение на 9-е сутки опыта. Количество лейкоцитов у животных этой группы также снижалось, начиная с 3-х суток после заражения и достигая минимальных значений (38804000 кл/мм3) на 5-7-е сутки. Выздоровление регистрировали на 14-е сутки опыта (рис. 1). Патолого-анатомические изменения включали незначительное увеличение мезентериальных лимфатических узлов, гиперемию слизистой тонкого отдела кишечника. Геном вируса выявили в основном в лимфоидных органах. Изолят Т-2, выделенный из спермы быка-производителя, вызвал у всех зараженных животных (№ 1954, б/н и 1967) признаки заболевания, сходные с таковыми у животных, которым вводили изолят Бор. Результаты молекулярных исследований также подтвердили широкое распространение вируса во внутренних органах, включая лимфоидные. У контрольных животных клинические и гематологические показатели не отклонялись от нормы. Полученные нами результаты показали, что, несмотря на принадлежность к различным субгенотипам, все использованные НЦП-изоляты вируса ВД-БС КРС обладали вирулентностью для серонегативных телят 4-6-месячного возраста. Клинические признаки варьировали от легкого респираторного синдрома и кратковременной диареи до субклинической формы инфекции, проявлявшейся в виде угнетения общего состояния, отказа от корма, повышения температуры тела и транзитной лейкопении, сопровождаясь диссеминацией вируса в широких пределах лимфоидной ткани, эпителиоидных клетках верхнего респираторного тракта и тонкого отдела кишечника. Рис. 1. Количество лейкоцитов у телят, экспериментально инфицированных НЦП-изолятами вируса ВД-БС КРС. Рис. 2. Температурная кривая у телят, экспериментально инфицированных НЦП-изолятами вируса ВД-БС КРС. По вертикали - количество (в кл/мм3) лейкоцитов. По вертикали - градус. Здесь и на рис. 2: по горизонтали - сутки опыта. Сроки выявления лейкопении у животных всех групп были в среднем одинаковыми и определялись на 3-5-е сутки после заражения, т. е. либо до развития видимой клинической реакции на введение вируса, либо одновременно с ней. Согласно данным литературы, этот показатель у инфицированных животных имеет патогенетическое и прогностическое значение, поскольку свидетельствует о развитии иммуносупрессии, способствующей суперинфицированию другими возбудителями вирусной и бактериальной природы [1, 3, 9]. Все телята, использованные в опыте, реагировали серо- конверсией к вирусу на 25-е сутки после заражения (срок наблюдения), однако титры вируснейтрализующих антител не превышали 1:16. У одного теленка, инфицированного изоля- том Т2 (№ 1954), не выявили реакции антителообразования. Относительно низкие титры вируснейтрализующих антител у телят после выздоровления и отсутствие их у теленка № 1954, вероятно, связаны с иммуносупрессивным свойством вируса, поскольку, по данным [3, 8] сероконверсия у инфицированных животных может развиваться через 3-12 нед после заражения. Наши данные до некоторой степени согласуются с результатами, полученными M. Lambot и соавт. [7], также выявившими низкие титры вируснейтрализующих антител при экспериментальном заражении телят различными биотипами вируса. У телят, не имеющих антител к моменту заражения вирусом, титры вируснейтрализующих антител достигали максимального значения 1:16. Таким образом, тестированные нами НЦП-изоляты вируса, выделенные от животных разного возраста, обладали разной вирулентностью для серонегативных к вирусу телят 4-6-месячного возраста. Тяжесть проявления клинических признаков имела «штаммовую» зависимость. Принадлежность к биотипу не влияла на способность вируса инфицировать органы лимфоидной системы и индуцировать транзитную лейкопению (до 2880-3800 кл/мм3) в течение 8-10 дней, возникающую у животных на 3-5-е сутки после заражения. Ранее нами описана экспериментальная инфекция телят ЦП-изолятом вируса, выделенным из легких больного теленка, введение которого двум серонегативным к вирусу телятам 4- 6-месячного возраста вызывало слабые признаки острого респираторного заболевания с кратковременной диареей [10]. В данной работе мы нашли подтверждение тому, что некоторые НЦП-изоляты вируса могут вызывать развитие слабого респираторного дистресса у безмолозивных телят. Известно, что наиболее распространенной формой ВД-БС КРС является субклиническая, часто протекающая незамеченной ветеринарными специалистами. В данном случае важным биологическим свойством возбудителя является транзитная иммуносупрессия, в период которой животное становится восприимчивым к развитию респираторных болезней вследствие усиленного размножения коинфицирующих микроорганизмов. Роль НЦП-биотипа вируса в возникновении респираторных болезней длительное время недооценивалась, и способность изолятов этого биотипа вызывать клиническую респираторную болезнь у КРС обсуждается с начала 1990-х годов [1]. Так, в этот период времени в США и Канаде были выделены несколько НЦП изолятов, относящихся ко второму генотипу вируса, вызывающих тромбоцитопению, геморрагии, лейкопению, лихорадку, диарею и гибель животных во время неосложненной первичной острой инфекции [1], что во многом стимулировало интерес к болезни и изучению патогенности вируса. Однако большинство штаммов первого генотипа способны вызывать либо субклиническую, либо умеренную острую форму болезни [1, 9]. Впервые об экспериментальном воспроизведении респираторного заболевания при помощи вируса ВД-БС КРС сообщили L. Potgieter и соавт. в 1984 г [9]. По их данным, у трех телят 6-месячного возраста, зараженных вирусом, развились признаки слабой респираторной болезни в виде лихорадки, выделений из носа и редкого кашля. На вскрытии выявляли поражения от 2 до 7% поверхности легких. M. Spagnuolo-Weaver и соавт. [12] изучали распространение НЦП-биотипа вируса, выделенного из содержимого кишечника павшей коровы, во внутренних органах экспериментально зараженных телят с наличием и отсутствием колостральных антител. Методом иммунофлюоресценции антиген вируса выявляли в основном в пробах тканей лимфоидной и желудочно-кишечной системы и незначительное количество в респираторных органах, в которые, возможно, вирус был занесен током крови во время транзитной вире- мии. К сожалению, авторы не указали генотип и субгенотип использованного для заражения вируса. Знания о роли субгенотипов вируса в этиологии респираторных болезней молодняка КРС ограничены. Считается, что в этиологии респираторных болезней чаще участвуют изоляты субгенотипа 1в [1, 2]. [1]KEMV был впервые описан в 1963 г. [20]. KEMV стал прототипом для группы Кемерово [21], в которую были включены вирусы Ченуда (CNUV - Chenuda virus) [22, 23], Грейт Айленд (GIV - Great Island virus) [24, 25] и др. [26]. Изменение названия группы Кемерово на Грейт Айленд считаем неправомерным. В опытах V. Galav и соавт. [13] была продемонстрирована патогенность Индийского изолята вируса субгенотипа 1в для 7-9-месячных телят, у которых после заражения развились признаки респираторной болезни, двухфазной температурной реакции, легкой диареи, лейкопении и слабовыражен- ной тромбоцитопении. Виремия демонстрировалась с 3-х по 15-е сутки, а сероконверсия выявлялась через 15 дней после заражения. Кроме того, диагностировали поражение почек в виде увеличения количества эндотелиальных клеток, пролиферации клеток глии и фагоцитов, что приводило к облитерации пространства гломерул. У животных наблюдали интерстициальную пневмонию, легкий гастроэнтерит, а также признаки системного распространения вируса. Авторы сделали заключение о том, что изолят вызывал развитие умеренной клинической болезни у телят, а гломерулонефрит был следствием острой формы ВД, что отмечено впервые. Наши результаты согласуются также с данными С. Baule и соавт., описавших первичную респираторную болезнь у экспериментально зараженных иммунокомпетентных безмоло- зивных телят с помощью НЦП-изолята субгенотипа Id [5]. Таким образом, можно заключить, что в настоящее время на территории Сибири циркулируют вирулентные НЦП- изоляты вируса ВД-БС КРС, способные вызвать развитие инфекционного процесса в организме серонегативных телят, что говорит о необходимости целенаправленной специфической профилактики болезни. Полученные результаты можно использовать при планировании противоэпизоотических мероприятий, предусматривающих в том числе комплексные диагностические исследования с целью расшифровки этиологической структуры конкретной вспышки респираторных болезней и выяснения этиологической роли каждого инфекционного агента, особенно НЦП-биотипа вируса ВД-БС КРС.

References

Supplementary files