Variants of the immunoreactivity and infectious process in bank vole (Myodes glareolus) experimentally infected with the Hantavirus Puumala (PUUV)

Abstract

As a result of a longitudinal study of the Puumala hantavirus (PUUV) in the experimentally infected bank voles (Myodes glareolus), we revealed three groups of the voles differing in the immunoreactivity and viral antigen concentration in the organs. The close correlation between these parameters suggested the existence of various mechanisms of the hantavirus persistence in the host.

Full Text

Род Hantavirus (семейство Bunyaviridae) насчитывает более 50 хантавирусов, многие из которых патогенны для человека и вызывают геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (ГЛПС) на территории Евразии и ханта- вирусный пульмонарный синдром в странах Нового Света [1-3]. Природными резервуарами всех патогенных для людей хантавирусов служат грызуны из семейств: мышиные (Muridae) и хомяковые (Cricetidae). Каждый вирус имеет, как правило, одного хозяина, связанного с ним эволюционно, и относится к определенному генотипу [4]. В европейской части ареала наиболее широко распространен вирус Puumala (PUUV), основной хозяин которого - рыжая полевка (Myodes glareolus) [5, 6]. У большинства животных в течение первого месяца после заражения развивается острая, бессимптомная инфекция, не влияющая на их жизнедеятельность, которая сопровождается формированием нестирильного иммунитета и интенсивным выделением вируса с экскретами во внешнюю среду [6-8]. В этот период инфицированные животные эпидемически наиболее опасны. В дальнейшем у грызунов, в отличие от острого течения ГЛПС у человека, несмотря на присутствие нейтрализующих антител, формируется хроническая персистирующая инфекция [8-10]. Центральная роль в ее патогенезе отводится не столько прямому воздействию хантавирусов на клетки, так как они не оказывают цитопа- тического эффекта, сколько многочисленным иммунологическим феноменам [11, 12]. Многие вопросы взаимоотношений хантавирусов с хозяевами еще мало изучены. В наших предыдущих публикациях были приведены сведения о накоплении PUUV и вирусного антигена в органах рыжей полевки в разные сроки после заражения; горизонтальной передаче вируса; врожденном и приобретенном иммунитете у этих грызунов в природных и лабораторных условиях [5, 7, 8, 13]. В настоящем сообщении представлены ранее не опубликованные данные длительных экспериментальных исследований (1987-1988 гг.) по изучению гуморального иммунитета у зараженных рыжих полевок и его связи с накоплением вирусного антигена в органах. Материалы и методы Вирус. Для заражения использовали PUUV, штамм Казань 6Cg., 39 пассаж, изолированный из легких рыжей полевки [7]. Животные. Моделью служили рыжие полевки лабораторной линии нашего института [14].162 полевки обоего пола (86$ и 76$) в возрасте 3-16 мес, предварительно проверенные на отсутствие антител (Лт) к хантавирусам, были заражены PUUV внутримышечно по 100 ИД50/ 0,3мл. Титрование вируса проводили методом конечных разведений путем заражения лабораторных полевок; титры рассчитывали по методу Рида и Минча. Инфекционная доза (ИД50) вызывала образование антигена и / или Ат к PUUV у 50% особей. Полевки содержались по 10-12 особей в отдельных клетках от 5 дней до 14 мес. На 5, 10, 14, 20, 30-е сутки после заражения и далее ежемесячно у животных прижизненно брали кровь из ретроорбитального синуса (~0,1 мл), разводили в 4 раза фосфатным буфером (pH 7,4) и исследовали на наличие специфических АТ непрямым методом флюоресцирующих антител (НМФА) по ранее описанной методике [7]. Всего исследовали 1329 сывороток, из которых 1209 сывороток от 116 особей, обследованных в динамике не менее 5 раз, использовали для сравнительного анализа иммунного статуса инфицированных полевок. Для выявления антигена (АГ) в вышеуказанные сроки, по 5-7 полевок умерщвляли эфиром и готовили 10% суспензию тканей на среде Игла ( исходный титр обозначили как неразведенный). Индикацию Аг в крови, экскретах и органах и последующее его титрование проводили прямым иммуноферментным методом (ИФМ) по ранее описанной методике [7]. По уровню накопления AT оценивали интенсивность течения инфекции в организме полевок [5, 8]. Концентрации АТ оценивали в показателях среднегеометрических титров (СГТ -log2). При статистической обработке материала использовали стандартные методы расчета средних величин и их ошибок. Уровень достоверности составлял не менее 95%. Рис. 1. Изменение в динамике гуморального иммунитета у рыжих полевок трех иммунологических групп после экспериментального заражения PUUV (штамм Казань 6 C. g.). Результаты Период после заражения Обследовано сывороток в группах А, Б, В А Б В СГТ АТ АГ СГТ АТ АГ СГТ АТ АГ Сутки: 5-30-е 165:105:78 8,2 ± 0,2 Н. и. 7,2 ± 0,2 Н. и. 6,4 ± 0,2 Н. и. Месяцы: 2-4-й 149:100:75 8,9 ± 0,1 6/11 7,3 ± 0,1 0/5 4,7 ± 0,1 1/3 5-7-й 113:78:64 6,8 ± 0,1 5/9 5,7 ± 0,1 2/6 4,1 ± 0,1 0/4 8-10-й 82:54:50 7,7 ± 0,2 7/14 5,9 ± 0,2 2/12 4,5 ± 0,2 1/3 11-12-й 31:17:27 6,3 ± 0,2 3/9 5,0 ± 0,3 1/4 3,7 ± 0,1 0/10 13-14-й 8:7:7 8,3 ± 0,3 3/7 6,5 ± 0,7 0/5 4,3 ± 0,4 0/5 Всего ... 548:361:300 7,9 ± 0,1 24/50 6,5 ± 0,1 5/32 4,7 ± 0,1 2/25 Показатели гуморального иммунитета СГТ АТ и число особей с АГ в легких рыжих полевок трех иммунологических групп в разные периоды после экспериментального заражения PUUV (штамм Еазань 6 С. g.) Диапазон АТ % особей с АГ в легких 5,7-9,3 5,0-7,5 3,7-6,8 48,0 15,6 Гуморальный иммунитет. Динамика и групповые различия. Сравнительный анализ показателей иммунитета 116 полевок обоего пола, обследованных многократно, позволил выделить три группы особей с разным уровнем иммунного ответа: А - высоким, Б - средним и В - низким (рис.1). Периодичность, прослеживаемая в динамике иммуногенеза во всех группах, в общих чертах была сходной: 5-30-е сутки - нарастание уровня АТ; 2-4-й месяц - относительная стабильность; 5-7 и 11-12-й месяц - снижение уровня АТ; 8-10 и 13-14-й месяц - повторная активизация иммуногенеза (табл. 1). При этом, характер процесса у особей с разным иммунным статусом имел свои особенности. В течение опыта, начиная с 10-х суток, группы весьма существенно отличались между собой по уровню и диапазону колебаний СГТ АТ (р < 0,001). У полевок группы А отмечен ускоренный и интенсивный тип иммунного ответа с наиболее ярко выраженной периодичностью. Уже на 10-е сутки после заражения больше половины особей этой группы имели АТ, тогда как в группе В - меньше трети (р<0,01). 8,0 Примечание. Здесь и в табл. 2: А - группа полевок с высокой иммунореактивно- сью, Б - средней, В - низкой (п = 55;35;26). Н.и. - не исследовали; * - число особей с АГ в легких/число обследованных полевок. Сероконверсия у 50% полевок с высокой иммунореактивностью продолжалась еще в течение 2-го месяца; у 1/3 зверьков стабильно высокие титры АТ (1:640-2560) сохранялись на 3-4-й, а у единичных - даже на 5-6-й месяц после заражения. Напротив, сравнительно интенсивное анти- телообразование в группе В происходило только в 1-й период, а начиная со 2-го месяца большинство особей имели устойчиво низкий иммунный статус. Титры АТ у отдельных полевок периодически снижались даже ниже порогового уровня (< 1:10), и в течение 5-7 и 12-го месяца доля таких зверьков достигала более чем 20-40%. Небольшие подъемы уровня АТ на 4 и 8-10-й месяц отмечены только у единичных особей. Полевки группы Б по всем параметрам занимали промежуточное положение. При сходстве динамики иммуногенеза, они существенно отличались от полевок группы А интенсивностью процесса во все сроки наблюдения, за исключением 10-14 дней. Показатели иммунитета у них были существенно ниже, чем в группе А, как при минимуме на 7-й месяц (5,1 ± 0,1 и 5,7 ± 0,2; р < 0,01), так и при повторной активизации иммуногенеза на 8-10-й месяц (р < 0,001) (см. табл. 1). Иммунный минимум у большинства особей этих групп приходился на 6- й и/или 7-й месяц. У полевок групп Б и В титры АТ к концу наблюдения (в течение 11-12 и 13-14-го месяца) достоверно не отличались. Группы полевок с разной иммунореактивностью: А - высокой; Б - средней, В - низкой (п = 55; п = 35; п = 26 соответственно); М - средние показатели. По вертикали - СГТ АТ (-log2). Здесь и на рис. 2: по горизонтали сутки и месяцы после заражения. Во всех группах присутствовали взрослые особи разного пола. В среднем, показатели иммунитета у самок, большинство из которых принесло потомство, были выше, чем у половозрелых самцов (6,9 ± 0,09 и 6,6 ± 0,08; р = 0,01), однако значимые различия отмечены только в некоторые сроки: в группе В на 2-й месяц (р < 0,01), а в группах Б и А на 9-й и 10-й месяц соответственно (р < 0,01). Связи уровня иммунного ответа с возрастом мы не обнаружили. Накопление вирусного антигена. АГ впервые выявили на 5-е сутки в крови (4,3% из 162 особей) и кале (28,6% из 70), а на 10-е сутки в органах. В течение нескольких месяцев после заражения антигенемия имела транзиторный характер и с 10-х суток по 7-й месяц зафиксирована у 4,5% из 157 особей. Повышенный уровень АГ в крови наблюдали только в период повторной активизации иммуногенеза (27,4% из 73). Всего в ходе эксперимента его обнаружили у 36 зараженных полевок и у половины из них - на 8-10-й месяц, а до и после - лишь у единичных особей. При сравнении уровней накопления АГ в органах полевок с разной иммунореактивностью мы установили, что у особей с высоким иммунным статусом АГ присутствовал чаще и в более высоких концентрациях, чем у полевок двух других групп (табл. 2). По результатам обследования всех органов, доля особей с АГ в группе А была достоверно выше, чем в группе В (р < 0,05). Наиболее значимые различия отмечены в частоте его присутствия в легких и головном мозге (р < 1 Таблица 18/24 7/15 10/16 11/23 15/23 9/17 Таблица 2 Частота и интенсивность накопления АГ в органах и экскретах рыжих полевок, имеющих разную иммунореактивность, со 2-го по 14-й месяц после заражения PUUV (штамм Еазань 6 C. g.)) Орган % особей с АГ (M ± m/макс. титр АГ А (п = 46) Б (п = 26) В (п = 23) р Легкие 48,0 ± 7,1/256 15,6 ± 6,4/8 8,0 ± 5,4/Н. р.* А от Б и В < 0,001 Бурый жир 28,9 ± 6,8/256 12,5 ± 6,8/2 13,0 ± 7,0/Н. р. - Слюнные железы 22,2 ± 6,2/256 8,3 ± 5,6/Н. р. 4,3 ± 4,2/Н. р. А от В < 0,05 Головной мозг 31,8 ± 7,0/16 4,5 ± 4,4/32 4,5 ± 4,4/Н. р. А от Б и В < 0,001 Спинной мозг 25,0 ± 6,5/32 4,5 ± 4,4/Н. р. 4,5 ± 4,4/Н. р. А от Б и В < 0,01 Печень 24,4 ± 6,4/16 18,2 ± 8,2/8 18,2 ± 8,2/2 - Селезенка 8,9 ± 4,2/8 14,8 ± 6,8/2 9,5 ± 6,4/2 - Лимфоузлы + тимус 4,7 ± 3,2/4 4,8 ± 4,6/Н. р. 10,0 ± 6,7/Н. р. - Почки 13,3 ± 5,1/4 0 0 А от Б и В Мочевой пузырь, моча 2,1 ± 2,1/Н. р. 4,5 ± 4,4/Н. р. 4,5 ± 4,4/Н. р. - Прямая кишка, кал 2,3 ± 2,3/Н. р. 4,3 ± 4,2/Н. р. 0 - Всего особей с АГ в органах, % (абс.) 72,0 ± 6,6 (33) 53,8 ± 9,8 (14) 43,5 ± 10,3 (10) А от В < 0,05 Примечание. * - исходный титр АГ (Н. р.- не разведенный). 50- 8-10-й 11-12-й 13-14-й | б □ в 10-30-е 2-4-й 5-7-й Рис. 2. Накопление АГ в органах рыжих полевок в разные периоды после экспериментального заражения PUUV (% от числа зверьков с АГ). Доля особей с АГ в органах: а - только в легких; б - в легких и других органах; в - в других органах (-легкие); 18/24. - число особей с АГ/ число обследованных полевок. 0,001), спинном мозге и слюнных железах (р < 0,01), а также в почках. Для полевок группы А характерна высокая степень генерализации инфекции; АГ обнаружили в 5-9 органах у 18,2% из 33 носителей, выявленных в ходе эксперимента как в ранние, так и поздние сроки, а у большинства носителей из двух других групп (п = 24) он присутствовал в 1-3 органах, редко - в 4. Кроме того, у полевок с высоким иммунным статусом наиболее ярко проявился пневмотропизм РиГГУ(см. табл. 1, 2). Присутствие АГ в легких зафиксировали у 73% из всех носителей этой группы, тогда как среди зверьков с меньшей иммунореактивностью у достоверно меньшего количества: у 36% из 14 и 20% из 10 соответственно (р < 0,01). Следует отметить и периодичность в присутствии АГ в легких, что хорошо видно при анализе более полных данных, включающих результаты обследования зверьков в ранние сроки (10-30 дней) (рис. 2). В два первых периода и на 8-10-й месяц его выявили в легких более 80-70% носителей, тогда как в остальные сроки, особенно на 11-14-й месяц - существенно реже (р < 0,001). В это время АГ чаще определяли в печени, буром жире, спинном и головном мозге, что связано, по-видимому, с депонированием вируса в этих органах в латентную фазу инфекции. Сравнение данных о накоплении АГ у самок и самцов не выявило между ними существенных различий как при учете только легких: 32,9 ± 5,2 и 36,9 ± 6,9 (п = 76$; 65$), так и всех обследованных органов: 55,7 ± 5,9 и 63,8 ± 6,3 (п = 70$; 54$$ (р > 0,05). Возрастные различия между полевками также отсутствовали. Обсуждение По теории Е.С. Шварца с соавт., природные популяции грызунов характеризуются генетической и физиологической разнокачественностью [15]. Это подтверждается наблюдениями о существовании разных функциональных группировок в природных и виварных популяциях рыжих полевок [14]. Наши длительные наблюдения за полевками, экспериментально зараженными PUUV, выявили существенные различия в иммунореактивности и накоплении вирусного антигена в органах трех групп особей. Для полевок с высоким иммунным статусом (А) были характерны: раннее появление специфических антител, ускоренный и интенсивный тип иммуногенеза, широкая генерализация инфекции, ярко выраженные пневмотропизм и периодичность процесса. У полевок со средней и низкой иммунореактивностью отметили замедленный темп иммуногенеза и существенно меньшая его интенсивность, ограниченная диссеминация вируса и малая степень поражения всех органов, включая легкие. Сходные варианты развития хантавирусной инфекции описаны и у других представителей семейства Cricetidae - оленьих хомячков (Piromyscus maniculatus), зараженных вирусом Sin Nombre (SNV); вирус удавалось выделить только из зверьков с диссеминированным типом инфекции [16]. Известно, что у рыжих полевок и полевых мышей, зараженных PUUV и Hantaan (HTNV), соответственно, в течение 1-го месяца преобладают низкоавидные АТ [13, 17]; кроме того, в крови и органах рыжих полевок выявлены иммунные комплексы (ИК) [7]. Роль ИК в патогенезе хантавирусных инфекций у грызунов изучена мало, но по результатам исследований на других экспериментальных моделях хорошо известно их участие в реализации различных иммунологических механизмов [18]. По совокупности наших данных можно предположить, что у полевок с разным иммунным статусом ИК образуются в различных условиях: при избытке нейтрализующих АТ - у полевок с высокой иммунореактивностью, а при недостаточном их количестве в ранние сроки - у прочих особей. По-видимому, в первом случае формируется персистирующая фракция, уровень которой, как известно, во многом определяется свойствами АТ, взаимодействующих с вирусными частицами. В случае низкоавидных АТ диссоциация ИК более выражена, что обеспечивает продолжительную персистенцию PUUV и антигенную стимуляцию иммунокомпетентных клеток и объясняет, отчасти, высокий уровень иммунного ответа и зараженности полевок группы А. Кроме того, ИК, выполняя роль медиатора, могут активировать эндотелий сосудов, повышая их проницаемость [19, 20]. У полевок двух других групп при увеличении концентрации АТ, число ИК с избыточным содержанием вируса уменьшается и, возможно, они полностью исчезают. Это, вероятно, приводит к освобождению части зверьков от вируса, о чем свидетельствует более низкое число носителей АГ начиная со 2-го месяца. По-видимому, ключевая роль в элиминации вируса принадлежит эффекторным Т-клеткам. Так, при изучении инфекции, вызванной HTNV в присутствии нейтрализующих АТ, было показано, что персистенция возникает в результате неспособности нефункциональных CD8+T клеток элиминировать вирус [21]. Установлено также, что при заражении клеток фибробластов рыжих полевок in vitro PUUV не индуцирует образование интерферона в [22]. В настоящее время рассматривается роль приобретенного и врожденного иммунитета в персистенции хантавирусов у природных хозяев [12]. Выявленные индивидуальные различия в восприимчивости к PUUV не связаны с принадлежностью полевок к определенным половозрастным группам. По-видимому, у рыжих полевок, как и у людей, существование нескольких типов иммунного ответа к PUUV (высокого, среднего, низкого) генетически детерминировано. В природе большая зараженность половозрелых самцов особенно связана с их подвижностью и характером поведения в репродуктивный период, что определяет ведущую роль самцов в сохранении и распространении инфекции в популяциях рыжей полевки [5]. Таким образом, выраженные различия в иммунореактивности и накоплении АГ в органах рыжих полевок свидетельствуют о вариабельности популяции по степени восприимчивости к PUUV и предполагают существование разных механизмов персистенции и адаптивной стратегии вируса во взаимоотношениях с хозяином. Вероятно, каждая из выявленных групп, играет особую роль, от их соотношения в популяции может зависеть цикличность течения эпизоотического процесса. Гетерогенность популяции по морфофизиологическим и иммунологическим параметрам определяет разнообразие условий существования вируса и создает предпосылки для его внутрипопуляционной изменчивости по признакам патогенности и иммуногенности. Для дальнейшего исследования взаимоотношений между сочленами экосистемы хантавирус-хозяин в естественных условиях необходимо одновременное изучение состава и состояния их популяций на всех фазах эпизоотического цикла.