Варианты иммунореактивности и течения инфекции у рыжей полевки (Myodes glareolus) при экспериментальном заражении хантавирусом Puumala (PUUV)

Аннотация

При длительном изучении инфекционного процесса у рыжих полевок (Myodes glareolus), экспериментально зараженных штаммом Казань 6С.g хантавируса Puumala (PUUV), выявлены три группы особей, отличающихся по иммунореактивности и интенсивности накопления вирусного антигена в органах. Наличие тесной связи между этими параметрами предполагает существование разных механизмов персистенции вируса и вариантов течения инфекции в организме хозяина.

Полный текст

Род Hantavirus (семейство Bunyaviridae) насчитывает более 50 хантавирусов, многие из которых патогенны для человека и вызывают геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (ГЛПС) на территории Евразии и ханта- вирусный пульмонарный синдром в странах Нового Света [1-3]. Природными резервуарами всех патогенных для людей хантавирусов служат грызуны из семейств: мышиные (Muridae) и хомяковые (Cricetidae). Каждый вирус имеет, как правило, одного хозяина, связанного с ним эволюционно, и относится к определенному генотипу [4]. В европейской части ареала наиболее широко распространен вирус Puumala (PUUV), основной хозяин которого - рыжая полевка (Myodes glareolus) [5, 6]. У большинства животных в течение первого месяца после заражения развивается острая, бессимптомная инфекция, не влияющая на их жизнедеятельность, которая сопровождается формированием нестирильного иммунитета и интенсивным выделением вируса с экскретами во внешнюю среду [6-8]. В этот период инфицированные животные эпидемически наиболее опасны. В дальнейшем у грызунов, в отличие от острого течения ГЛПС у человека, несмотря на присутствие нейтрализующих антител, формируется хроническая персистирующая инфекция [8-10]. Центральная роль в ее патогенезе отводится не столько прямому воздействию хантавирусов на клетки, так как они не оказывают цитопа- тического эффекта, сколько многочисленным иммунологическим феноменам [11, 12]. Многие вопросы взаимоотношений хантавирусов с хозяевами еще мало изучены. В наших предыдущих публикациях были приведены сведения о накоплении PUUV и вирусного антигена в органах рыжей полевки в разные сроки после заражения; горизонтальной передаче вируса; врожденном и приобретенном иммунитете у этих грызунов в природных и лабораторных условиях [5, 7, 8, 13]. В настоящем сообщении представлены ранее не опубликованные данные длительных экспериментальных исследований (1987-1988 гг.) по изучению гуморального иммунитета у зараженных рыжих полевок и его связи с накоплением вирусного антигена в органах. Материалы и методы Вирус. Для заражения использовали PUUV, штамм Казань 6Cg., 39 пассаж, изолированный из легких рыжей полевки [7]. Животные. Моделью служили рыжие полевки лабораторной линии нашего института [14].162 полевки обоего пола (86$ и 76$) в возрасте 3-16 мес, предварительно проверенные на отсутствие антител (Лт) к хантавирусам, были заражены PUUV внутримышечно по 100 ИД50/ 0,3мл. Титрование вируса проводили методом конечных разведений путем заражения лабораторных полевок; титры рассчитывали по методу Рида и Минча. Инфекционная доза (ИД50) вызывала образование антигена и / или Ат к PUUV у 50% особей. Полевки содержались по 10-12 особей в отдельных клетках от 5 дней до 14 мес. На 5, 10, 14, 20, 30-е сутки после заражения и далее ежемесячно у животных прижизненно брали кровь из ретроорбитального синуса (~0,1 мл), разводили в 4 раза фосфатным буфером (pH 7,4) и исследовали на наличие специфических АТ непрямым методом флюоресцирующих антител (НМФА) по ранее описанной методике [7]. Всего исследовали 1329 сывороток, из которых 1209 сывороток от 116 особей, обследованных в динамике не менее 5 раз, использовали для сравнительного анализа иммунного статуса инфицированных полевок. Для выявления антигена (АГ) в вышеуказанные сроки, по 5-7 полевок умерщвляли эфиром и готовили 10% суспензию тканей на среде Игла ( исходный титр обозначили как неразведенный). Индикацию Аг в крови, экскретах и органах и последующее его титрование проводили прямым иммуноферментным методом (ИФМ) по ранее описанной методике [7]. По уровню накопления AT оценивали интенсивность течения инфекции в организме полевок [5, 8]. Концентрации АТ оценивали в показателях среднегеометрических титров (СГТ -log2). При статистической обработке материала использовали стандартные методы расчета средних величин и их ошибок. Уровень достоверности составлял не менее 95%. Рис. 1. Изменение в динамике гуморального иммунитета у рыжих полевок трех иммунологических групп после экспериментального заражения PUUV (штамм Казань 6 C. g.). Результаты Период после заражения Обследовано сывороток в группах А, Б, В А Б В СГТ АТ АГ СГТ АТ АГ СГТ АТ АГ Сутки: 5-30-е 165:105:78 8,2 ± 0,2 Н. и. 7,2 ± 0,2 Н. и. 6,4 ± 0,2 Н. и. Месяцы: 2-4-й 149:100:75 8,9 ± 0,1 6/11 7,3 ± 0,1 0/5 4,7 ± 0,1 1/3 5-7-й 113:78:64 6,8 ± 0,1 5/9 5,7 ± 0,1 2/6 4,1 ± 0,1 0/4 8-10-й 82:54:50 7,7 ± 0,2 7/14 5,9 ± 0,2 2/12 4,5 ± 0,2 1/3 11-12-й 31:17:27 6,3 ± 0,2 3/9 5,0 ± 0,3 1/4 3,7 ± 0,1 0/10 13-14-й 8:7:7 8,3 ± 0,3 3/7 6,5 ± 0,7 0/5 4,3 ± 0,4 0/5 Всего ... 548:361:300 7,9 ± 0,1 24/50 6,5 ± 0,1 5/32 4,7 ± 0,1 2/25 Показатели гуморального иммунитета СГТ АТ и число особей с АГ в легких рыжих полевок трех иммунологических групп в разные периоды после экспериментального заражения PUUV (штамм Еазань 6 С. g.) Диапазон АТ % особей с АГ в легких 5,7-9,3 5,0-7,5 3,7-6,8 48,0 15,6 Гуморальный иммунитет. Динамика и групповые различия. Сравнительный анализ показателей иммунитета 116 полевок обоего пола, обследованных многократно, позволил выделить три группы особей с разным уровнем иммунного ответа: А - высоким, Б - средним и В - низким (рис.1). Периодичность, прослеживаемая в динамике иммуногенеза во всех группах, в общих чертах была сходной: 5-30-е сутки - нарастание уровня АТ; 2-4-й месяц - относительная стабильность; 5-7 и 11-12-й месяц - снижение уровня АТ; 8-10 и 13-14-й месяц - повторная активизация иммуногенеза (табл. 1). При этом, характер процесса у особей с разным иммунным статусом имел свои особенности. В течение опыта, начиная с 10-х суток, группы весьма существенно отличались между собой по уровню и диапазону колебаний СГТ АТ (р < 0,001). У полевок группы А отмечен ускоренный и интенсивный тип иммунного ответа с наиболее ярко выраженной периодичностью. Уже на 10-е сутки после заражения больше половины особей этой группы имели АТ, тогда как в группе В - меньше трети (р<0,01). 8,0 Примечание. Здесь и в табл. 2: А - группа полевок с высокой иммунореактивно- сью, Б - средней, В - низкой (п = 55;35;26). Н.и. - не исследовали; * - число особей с АГ в легких/число обследованных полевок. Сероконверсия у 50% полевок с высокой иммунореактивностью продолжалась еще в течение 2-го месяца; у 1/3 зверьков стабильно высокие титры АТ (1:640-2560) сохранялись на 3-4-й, а у единичных - даже на 5-6-й месяц после заражения. Напротив, сравнительно интенсивное анти- телообразование в группе В происходило только в 1-й период, а начиная со 2-го месяца большинство особей имели устойчиво низкий иммунный статус. Титры АТ у отдельных полевок периодически снижались даже ниже порогового уровня (< 1:10), и в течение 5-7 и 12-го месяца доля таких зверьков достигала более чем 20-40%. Небольшие подъемы уровня АТ на 4 и 8-10-й месяц отмечены только у единичных особей. Полевки группы Б по всем параметрам занимали промежуточное положение. При сходстве динамики иммуногенеза, они существенно отличались от полевок группы А интенсивностью процесса во все сроки наблюдения, за исключением 10-14 дней. Показатели иммунитета у них были существенно ниже, чем в группе А, как при минимуме на 7-й месяц (5,1 ± 0,1 и 5,7 ± 0,2; р < 0,01), так и при повторной активизации иммуногенеза на 8-10-й месяц (р < 0,001) (см. табл. 1). Иммунный минимум у большинства особей этих групп приходился на 6- й и/или 7-й месяц. У полевок групп Б и В титры АТ к концу наблюдения (в течение 11-12 и 13-14-го месяца) достоверно не отличались. Группы полевок с разной иммунореактивностью: А - высокой; Б - средней, В - низкой (п = 55; п = 35; п = 26 соответственно); М - средние показатели. По вертикали - СГТ АТ (-log2). Здесь и на рис. 2: по горизонтали сутки и месяцы после заражения. Во всех группах присутствовали взрослые особи разного пола. В среднем, показатели иммунитета у самок, большинство из которых принесло потомство, были выше, чем у половозрелых самцов (6,9 ± 0,09 и 6,6 ± 0,08; р = 0,01), однако значимые различия отмечены только в некоторые сроки: в группе В на 2-й месяц (р < 0,01), а в группах Б и А на 9-й и 10-й месяц соответственно (р < 0,01). Связи уровня иммунного ответа с возрастом мы не обнаружили. Накопление вирусного антигена. АГ впервые выявили на 5-е сутки в крови (4,3% из 162 особей) и кале (28,6% из 70), а на 10-е сутки в органах. В течение нескольких месяцев после заражения антигенемия имела транзиторный характер и с 10-х суток по 7-й месяц зафиксирована у 4,5% из 157 особей. Повышенный уровень АГ в крови наблюдали только в период повторной активизации иммуногенеза (27,4% из 73). Всего в ходе эксперимента его обнаружили у 36 зараженных полевок и у половины из них - на 8-10-й месяц, а до и после - лишь у единичных особей. При сравнении уровней накопления АГ в органах полевок с разной иммунореактивностью мы установили, что у особей с высоким иммунным статусом АГ присутствовал чаще и в более высоких концентрациях, чем у полевок двух других групп (табл. 2). По результатам обследования всех органов, доля особей с АГ в группе А была достоверно выше, чем в группе В (р < 0,05). Наиболее значимые различия отмечены в частоте его присутствия в легких и головном мозге (р < 1 Таблица 18/24 7/15 10/16 11/23 15/23 9/17 Таблица 2 Частота и интенсивность накопления АГ в органах и экскретах рыжих полевок, имеющих разную иммунореактивность, со 2-го по 14-й месяц после заражения PUUV (штамм Еазань 6 C. g.)) Орган % особей с АГ (M ± m/макс. титр АГ А (п = 46) Б (п = 26) В (п = 23) р Легкие 48,0 ± 7,1/256 15,6 ± 6,4/8 8,0 ± 5,4/Н. р.* А от Б и В < 0,001 Бурый жир 28,9 ± 6,8/256 12,5 ± 6,8/2 13,0 ± 7,0/Н. р. - Слюнные железы 22,2 ± 6,2/256 8,3 ± 5,6/Н. р. 4,3 ± 4,2/Н. р. А от В < 0,05 Головной мозг 31,8 ± 7,0/16 4,5 ± 4,4/32 4,5 ± 4,4/Н. р. А от Б и В < 0,001 Спинной мозг 25,0 ± 6,5/32 4,5 ± 4,4/Н. р. 4,5 ± 4,4/Н. р. А от Б и В < 0,01 Печень 24,4 ± 6,4/16 18,2 ± 8,2/8 18,2 ± 8,2/2 - Селезенка 8,9 ± 4,2/8 14,8 ± 6,8/2 9,5 ± 6,4/2 - Лимфоузлы + тимус 4,7 ± 3,2/4 4,8 ± 4,6/Н. р. 10,0 ± 6,7/Н. р. - Почки 13,3 ± 5,1/4 0 0 А от Б и В Мочевой пузырь, моча 2,1 ± 2,1/Н. р. 4,5 ± 4,4/Н. р. 4,5 ± 4,4/Н. р. - Прямая кишка, кал 2,3 ± 2,3/Н. р. 4,3 ± 4,2/Н. р. 0 - Всего особей с АГ в органах, % (абс.) 72,0 ± 6,6 (33) 53,8 ± 9,8 (14) 43,5 ± 10,3 (10) А от В < 0,05 Примечание. * - исходный титр АГ (Н. р.- не разведенный). 50- 8-10-й 11-12-й 13-14-й | б □ в 10-30-е 2-4-й 5-7-й Рис. 2. Накопление АГ в органах рыжих полевок в разные периоды после экспериментального заражения PUUV (% от числа зверьков с АГ). Доля особей с АГ в органах: а - только в легких; б - в легких и других органах; в - в других органах (-легкие); 18/24. - число особей с АГ/ число обследованных полевок. 0,001), спинном мозге и слюнных железах (р < 0,01), а также в почках. Для полевок группы А характерна высокая степень генерализации инфекции; АГ обнаружили в 5-9 органах у 18,2% из 33 носителей, выявленных в ходе эксперимента как в ранние, так и поздние сроки, а у большинства носителей из двух других групп (п = 24) он присутствовал в 1-3 органах, редко - в 4. Кроме того, у полевок с высоким иммунным статусом наиболее ярко проявился пневмотропизм РиГГУ(см. табл. 1, 2). Присутствие АГ в легких зафиксировали у 73% из всех носителей этой группы, тогда как среди зверьков с меньшей иммунореактивностью у достоверно меньшего количества: у 36% из 14 и 20% из 10 соответственно (р < 0,01). Следует отметить и периодичность в присутствии АГ в легких, что хорошо видно при анализе более полных данных, включающих результаты обследования зверьков в ранние сроки (10-30 дней) (рис. 2). В два первых периода и на 8-10-й месяц его выявили в легких более 80-70% носителей, тогда как в остальные сроки, особенно на 11-14-й месяц - существенно реже (р < 0,001). В это время АГ чаще определяли в печени, буром жире, спинном и головном мозге, что связано, по-видимому, с депонированием вируса в этих органах в латентную фазу инфекции. Сравнение данных о накоплении АГ у самок и самцов не выявило между ними существенных различий как при учете только легких: 32,9 ± 5,2 и 36,9 ± 6,9 (п = 76$; 65$), так и всех обследованных органов: 55,7 ± 5,9 и 63,8 ± 6,3 (п = 70$; 54$$ (р > 0,05). Возрастные различия между полевками также отсутствовали. Обсуждение По теории Е.С. Шварца с соавт., природные популяции грызунов характеризуются генетической и физиологической разнокачественностью [15]. Это подтверждается наблюдениями о существовании разных функциональных группировок в природных и виварных популяциях рыжих полевок [14]. Наши длительные наблюдения за полевками, экспериментально зараженными PUUV, выявили существенные различия в иммунореактивности и накоплении вирусного антигена в органах трех групп особей. Для полевок с высоким иммунным статусом (А) были характерны: раннее появление специфических антител, ускоренный и интенсивный тип иммуногенеза, широкая генерализация инфекции, ярко выраженные пневмотропизм и периодичность процесса. У полевок со средней и низкой иммунореактивностью отметили замедленный темп иммуногенеза и существенно меньшая его интенсивность, ограниченная диссеминация вируса и малая степень поражения всех органов, включая легкие. Сходные варианты развития хантавирусной инфекции описаны и у других представителей семейства Cricetidae - оленьих хомячков (Piromyscus maniculatus), зараженных вирусом Sin Nombre (SNV); вирус удавалось выделить только из зверьков с диссеминированным типом инфекции [16]. Известно, что у рыжих полевок и полевых мышей, зараженных PUUV и Hantaan (HTNV), соответственно, в течение 1-го месяца преобладают низкоавидные АТ [13, 17]; кроме того, в крови и органах рыжих полевок выявлены иммунные комплексы (ИК) [7]. Роль ИК в патогенезе хантавирусных инфекций у грызунов изучена мало, но по результатам исследований на других экспериментальных моделях хорошо известно их участие в реализации различных иммунологических механизмов [18]. По совокупности наших данных можно предположить, что у полевок с разным иммунным статусом ИК образуются в различных условиях: при избытке нейтрализующих АТ - у полевок с высокой иммунореактивностью, а при недостаточном их количестве в ранние сроки - у прочих особей. По-видимому, в первом случае формируется персистирующая фракция, уровень которой, как известно, во многом определяется свойствами АТ, взаимодействующих с вирусными частицами. В случае низкоавидных АТ диссоциация ИК более выражена, что обеспечивает продолжительную персистенцию PUUV и антигенную стимуляцию иммунокомпетентных клеток и объясняет, отчасти, высокий уровень иммунного ответа и зараженности полевок группы А. Кроме того, ИК, выполняя роль медиатора, могут активировать эндотелий сосудов, повышая их проницаемость [19, 20]. У полевок двух других групп при увеличении концентрации АТ, число ИК с избыточным содержанием вируса уменьшается и, возможно, они полностью исчезают. Это, вероятно, приводит к освобождению части зверьков от вируса, о чем свидетельствует более низкое число носителей АГ начиная со 2-го месяца. По-видимому, ключевая роль в элиминации вируса принадлежит эффекторным Т-клеткам. Так, при изучении инфекции, вызванной HTNV в присутствии нейтрализующих АТ, было показано, что персистенция возникает в результате неспособности нефункциональных CD8+T клеток элиминировать вирус [21]. Установлено также, что при заражении клеток фибробластов рыжих полевок in vitro PUUV не индуцирует образование интерферона в [22]. В настоящее время рассматривается роль приобретенного и врожденного иммунитета в персистенции хантавирусов у природных хозяев [12]. Выявленные индивидуальные различия в восприимчивости к PUUV не связаны с принадлежностью полевок к определенным половозрастным группам. По-видимому, у рыжих полевок, как и у людей, существование нескольких типов иммунного ответа к PUUV (высокого, среднего, низкого) генетически детерминировано. В природе большая зараженность половозрелых самцов особенно связана с их подвижностью и характером поведения в репродуктивный период, что определяет ведущую роль самцов в сохранении и распространении инфекции в популяциях рыжей полевки [5]. Таким образом, выраженные различия в иммунореактивности и накоплении АГ в органах рыжих полевок свидетельствуют о вариабельности популяции по степени восприимчивости к PUUV и предполагают существование разных механизмов персистенции и адаптивной стратегии вируса во взаимоотношениях с хозяином. Вероятно, каждая из выявленных групп, играет особую роль, от их соотношения в популяции может зависеть цикличность течения эпизоотического процесса. Гетерогенность популяции по морфофизиологическим и иммунологическим параметрам определяет разнообразие условий существования вируса и создает предпосылки для его внутрипопуляционной изменчивости по признакам патогенности и иммуногенности. Для дальнейшего исследования взаимоотношений между сочленами экосистемы хантавирус-хозяин в естественных условиях необходимо одновременное изучение состава и состояния их популяций на всех фазах эпизоотического цикла.