Detection of conservative and variable epitopes of the pandemic influenza virus A(H1N1)pdm09 hemagglutinin using monoclonal antibodies

Full Text

Вирус гриппа A(H1N1)pdm09 возник в результате реассортации двух свиных генотипов вируса гриппа A(H1N1) - американского и евразийского весной 2009 г. на территории Мексики и быстро распространился в мире, став этиологическим агентом пандемии 20092010 гг. [1, 2] и доминирующим в этиологии подъемов уровня заболеваемости сезонов 2010-2011 и 2012-2013 гг. [3-5]. Результаты антигенного анализа пандемических штаммов показали, что они не претерпели значительного антигенного дрейфа в течение трех сезонов, в то же время отмечена их генетическая вариабельность [3, 6, 7]. В настоящее время для быстрой идентификации возбудителя гриппа наиболее широко используют методы детекции вирусной РНК с помощью различных ПЦР тест-систем [2, 3, 8]. Типирование выделенных штаммов A(H1N1)pdm09 проводят серологическими методами с помощью диагностических поликлональных сывороток, полученных при иммунизации хорьков и крыс [3, 6, 9]. Использование моноклональных антител (МКА) к гемагглютинину (HA) в качестве специфических иммунных реагентов может существенно повысить качество индикации вирусов гриппа [10-12] и выявить антигенные различия между штаммами. Кроме того, МКА незаменимы при изучении тонкой антигенной структуры HA [13, 14-16]. В зарубежной литературе мало данных об антигенных свойствах вируса A(H1N1)pdm09, так как с помощью МКА были изучены лишь единичные штаммы этого вируса [10, 13, 15]. Нами получена панель из шести вирус-нейтрализующих МКА к HA штамма вируса гриппа A/ IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl - первого пандемического вируса, выделенного в РФ и депонированного в Государственную коллекцию вирусов РФ при ФГБУ "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского" Минздрава России [1, 17]. При взаимодействии с гомологичным штаммом A/ IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl МКА различались по им-мунохимическим свойствам и нейтрализующей активности [17]. Способность МКА выявлять современные штаммы пандемического вируса ранее не исследовали. Можно предположить, что получение таких результатов позволит, с одной стороны, уточнить и дополнить имеющиеся данные об антигенной структуре HA, с другой - усовершенствовать диагностику гриппа. Цель настоящей работы - с помощью МКА к HA вируса A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl провести анализ антигенных свойств штаммов пандемического вируса гриппа, циркулировавших на территории РФ в 2009-2012 гг., и на основании полученных данных разработать иммуноферментный метод дифференциальной диагностики пандемических вирусов гриппа. Материалы и методы Вирусы. Использовали 24 штамма пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09, в том числе вирус А/IIVMoscow/01/2009 (H1N1)swl, к которому были получены МКА, эталонный штамм ВОЗ A/California/07/2009, и 22 штамма, выделенных в РФ в 2009-2012 гг. из носоглоточных смывов и секционного материала. Кроме того, в работу включили штаммы эталонных и сезонных вирусов гриппа А подтипов A(Н1N1), A(ffiN2) и A(H3N2), вирус гриппа A/Swine/Wisconsin/1/67 А(ШШ), имеющий "свиной" HA, 2 вируса гриппа птиц подтипов А(И5Ш) и А(ШШ6) и вирус гриппа В. Штаммы перечислены в табл. 1 и 2. Вирусы культивировали в аллантоисной полости 9-10-дневных развивающихся куриных эмбрионов, а также в перевиваемой клеточной линии почки собаки MDCK, как описано ранее [3]. Вирусы получены из Государственной коллекции вирусов РФ при ФГБУ "НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского" Минздрава России. МКА и референс-сыворотки. Использовали 6 МКА (1E7, 3D9, 3A3, 6A3, 5F7, 10G2) к вирусу А/IIVMoscow/01/2009 (H1N1)swl [17]. Для проведения реакции торможения гемагглютинации (РТГА) МКА использовали в виде асцитных жидкостей. Для выполнения иммуноферментного анализа (ИФА) МКА очищали из асцитных жидкостей с помощью аффинной хроматографии на колонке с Protein A-Sepharose CL-4B (Sigma, США) по методике фирмы. Концентрацию белка в очищенных препаратах МКА определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм. Для идентификации штаммов в РТГА использовали крысиные референс-сыворотки против штаммов пандемического вируса гриппа А/IIV-Moscow/01/2009 и A/ California/07/2009, полученные в ФГБУ "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского" Минздрава России [3]. РТГА проводили с использованием 0,75% взвеси эритроцитов человека I (0) группы или кур по стандартной методике [2, 3]. Доза вирусов гриппа для использования в РТГА составляла 8 агглютинирующих единиц в реакции гемагглютинации (РГА). Конъюгацию очищенных МКА с пероксидазой хрена (Sigma, США) выполняли перийодатным методом [18]. Сандвич-вариант ИФА для выявления вирусов гриппа выполняли, как описано ранее [11]. Кратко: МКА сорбировали в лунки 96-луночных панелей в концентрации 5 35 мкг/мл; после отмывки в лунки добавляли вируссодержащие жидкости, инкубировали 2 ч при 37°С. Затем добавляли конъюгаты - МКА к HA вируса гриппа, меченные пероксидазой хрена, и инкубировали 1 ч при 37°С. Выявление ферментативной активности связавшейся перок-сидазы проводили с использованием субстрата тетраме-тилбензидин (Sigma, США). Оптическую плотность (ОП) измеряли на планшетном иммуноферментном анализаторе "Sunrise" (Tecan, Швейцария) при длине волны 450/620 нм. Пробы считали положительными, если их ОП превышала критическую. Последнюю вычисляли как среднюю ОП отрицательных контролей (незараженные аллантоисные или культуральные жидкости, контроль конъюгата) плюс две величины стандартного отклонения. Конкурентный ИФА проводили, как описано ранее [11], с некоторыми модификациями. В лунки 96-луночной панели, предварительно сенсибилизированные вирусом гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl (2 мкг/мл), наносили очищенные МКА в концентрации 100 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при 4°С. После отмывки добавляли конъюгированные с пероксида-зой хрена МКА в разведениях, позволяющих получить ОП в пределах 1-1,5 при взаимодействии с вирусом гриппа в отсутствии конкурирующих МКА, и инкубировали 1 ч при 37°С. Спектрофотометрическое измерение активности пероксидазы проводили, как описано выше. Конкурентные отношения между МКА выражали как степень подавления связывания меченых МКА (конъю 36 гатов) с вирусом гриппа конкурирующими немечеными МКА и выражали в процентах. Анализ аминокислотных последовательностей пандемических вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 и выравнивание аминокислотных остатков (а.о.) штаммов проводили с помощью международной базы данных GenBank [19]. А.о. в HA нумерованы со стартового метионина с учетом сигнального пептида - а.о. в позиции 18 соответствует позиции 1 в зрелом HA после отщепления сигнального пептида [20, 21]. Результаты и обсуждение Исследовали взаимодействие панели МКА к HA штамма MIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl в РТГА с 22 штаммами пандемического вируса гриппа, изолированными на территории РФ в 2009-2012 гг. Установили значительные различия по степени подавления МКА гемагглюти-нирующей активности штаммов A(H1N1)pdm09 (см. табл. 1). МКА 5F7 выявляло все исследованные штаммы, при этом отметили высокое антигенное родство вируса A/ПV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl и 18 штаммов по эпитопу, к которому направлено данное МКА (25-100% гомологичного титра). Активность взаимодействия МКА 5F7 в РТГА с другими 4 штаммами отличалась в большей степени (6-12% гомологичного титра). МКА 3A3 и 10G2 с титрами, сходными с гомологичными, реагировали в РТГА с 16 и 13 штаммами соответственно. Среднюю степень родства (6-24% гомологичного титра) по эпитопам, опознаваемым данными МКА, обнаружили между вирусом A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl и 4 штаммами. С рядом штаммов антигенное родство оказалось ничтожно мало - не более 5% гомологичного титра. МКА 3A3 и 10G2 не выявляли в РТГА штаммы A/IIV-Moscow/13/2011 и A/IIV-Yaroslavl/32/2011 соответственно. МКА 1E7, 3D9 и 6A3 активно (> 25% гомологичного титра) выявляли в РТГА только 2-3 штамма из 22 исследованных (см. табл. 1). Среднюю степень родства (6-24% гомологичного титра) по эпитопам A/IIVMoscow/01/2009, реагирующим с МкА 1E7, 3D9 и 6A3, обнаружили в 13, 5 и 3 пандемических штаммах соответственно. Остальные вирусы либо не реагировали с данными МКА, либо реагировали очень слабо. Гемагглютинирующую активность эталонного штамма A/California/07/2009 все 6 МКА ингибировали так же эффективно, как и гомологичный вирус (см. табл. 1). МКА не реагировали в РТГА с эталонными и сезонными вирусами гриппа А подтипов, отличных от A(H1N1) pdm09, и с вирусом гриппа В (титры < 1:100, результаты не представлены). При постановке РТГА с поликлональными диагностическими сыворотками против вирусов A/IIVMoscow/01/2009 и A/California/07/2009 установили, что большинство изученных вирусов гриппа активно реагировали с сывороткой против A/IIV-Moscow/01/2009 (25-100% гомологичного титра) (см. табл. 1). 3 штамма (A/IIV-Moscow/34/2010, A/IIV-Vladimir/68/2011 и A/IlV-Yaroslavl/32/2011) отличались от вируса A/IIVMoscow/01/2009 (H1N1)swl более значительно (12,5% гомологичного титра), что можно расценивать как антигенные варианты. Сыворотка против вируса A/ California/07/2009 взаимодействовала со всеми исследованными штаммами практически одинаково (> 25% гомологичного титра) и не дифференцировала антигенные варианты (результаты не показаны). Абсолютные значения титров в РТГА поликлональных сывороток были меньше таковых в 20-80 раз при использовании МКА. Из представленных данных следует, что МКА 5F7, 3А3 и 10G2 обладали широким спектром взаимодей ствия практически со всеми изученными штаммами, при этом определяли высокую и среднюю степень гомологии с вирусом A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl. Это означает, что данные МКА направлены к консервативным эпитопам HA и могут применяться для идентификации штаммов пандемического вируса гриппа. Напротив, МКА 3D9 и 6A3 не выявляли до 30% штаммов, с остальными реагировали в низких титрах. Данные МКА направлены к вариабельным эпитопам HA и могут быть использованы для выявления антигенных различий в структуре HA пандемических штаммов. МКА 1E7 занимало промежуточное положение: большинство штаммов выявляли с помощью данного МКА, но степень антигенного родства HA этих штаммов с НА A/IIVMoscow/01/2009 была относительно невысокой (6-24% гомологичного титра). Следует отметить, что активность взаимодействия МКА с пандемическими штаммами не зависела ни от времени их циркуляции, ни от исхода заболевания (см. табл. 1). Антигенную специфичность МКА исследовали методом реципрокного конкурентного анализа. Все МКА подавляли реакцию связывания гомологичных конъюгатов с вирусом гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl (результаты не представлены). Частичное взаимное блокирование связывания (на 28-53%) показано между МКА 5F7 - 10G2 и 3А3 - 10G2. Кроме того, отметили несимметричное ингибирование реакции между разными МКА. Например, МКА 3D9 и 6А3 ингибировали связывание с вирусом только гомологичных конъюгатов, которые в свою очередь слабо реагировали с вирусом в присутствии МКА 5F7, 3А3, 10G2 и 1Е7. Наиболее сильным конкурентом проявило себя МКА 5F7, которое блокировало взаимодействие с вирусом конъюгатов всех 6 МКА. Данные конкурентного анализа свидетельствуют о том, что МКА распознают 6 Таблица 2 Выявление штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1) pdm09 с помощью МкА методом сандвич-ИФА Подтип Штамм вируса гриппа* Титр вируса в РГА ОП в ИФА** A(H1N1) A/IIV-Moscow/01/2009 1:2 3,0 pdm09 A/California/07/2009 1:32 3,0 A/IIV-Anadyr/177/2009 1:16 3,0 A/IIV-Elista/64/2009 1:4 2,1 A/IIV-Krasnodar/918/2011 1:2 2,3 A/IIV-Anadyr/101/2011 < 1:2 0,6 A/IIV-Moscow/83/2011 < 1:2 0,7 A/IIV-N.Novgorod/41/2011 < 1:2 0,3 A/IIV-Vladimir/35/2011 < 1:2 0,2 A/IIV-Tomsk/19/2012 < 1:2 0,4 A(H1N1)sw A/Swine/Wisconsin/1/67 1:4 0,04*** A(H1N1) A/Pekin/262/95 1:128 0,05 A/Solomon Islands/3/06 1:16 0,04 A(H2N2) A/Singapore/1/57 1:128 0,06 A(H3N2) A/Brisbane/10/07 1:128 0,05 A(H5N1) A/chicken/Primorje/1/08 1:256 0,03 A(H11N6) A/duck/England/56 1:16 0,02 B B/Brisbane/60/08 1:32 0,04 Примечание. * - аллантоисные и культуральные вируссодержащие жидкости в разведениях 1:2 - 1:10; ** - состав сандвич-ИФА: «захватывающие» антитела - смесь МКА 5F7 и 10G2, детектирующие антитела - смесь конъюгатов МКА 5F7 и 3A3; *** - отрицательные результаты определения вирусов (ОП критическая 0,07). 37 близко расположенных, но различных эпитопов на молекуле HA. Результаты антигенного картирования НА методом эскейп-мутантов показали [14], что МКА 5F7, 3A3, 1E7, 3D9 и 6А3 направлены к сайту Sa (ключевые а.о. K170, G172, N173, N142, а.о. нумерованы как указано в разделе "Материалы и методы"), а МКА 10G2 - к топографически близкому сайту Sb (D204). Конкуренция между МКА 5F7 и 3А3 с 10G2 позволяет предположить, что МКА 5F7, 3А3 и/или 10G2 направлены к эпитопам, перекрывающим сайты Sa и Sb НА. О способности МКА взаимодействовать с консервативными а.о., локализованными в двух и даже в трех антигенных сайтах НА (Sa, Sb и Ca2), недавно сообщили [16]. Для выяснения причин различного взаимодействия штаммов пандемического вируса гриппа А(ИШ1) pdm09 с МКА в РТГА провели анализ последовательностей НА, помещенных в GenBank [19]. По сравнению с вирусом гриппа А/IIV-Moscow/01/2009 в 5 пандемических штаммах 2009-2012 гг. в молекуле HA выявлено 17 позиций а.о., в которых произошли замены (табл. 3). В эталонном штамме ВОЗ A/California/07/2009 обнаружили 4 аминокислотные замены по сравнению с X/IIV-Moscow/01/2009. Судя по результатам РТГА, выявивших полную гомологию этого штамма с А/IIVMoscow/01/2009 по всем 6 МКА (см. табл. 1), можно заключить, что замены S100P, T220S, Q240R и V338I не влияют на антигенные свойства. Экспериментальные данные подтвердили, что мутация, приводящая к замене T220S, практически не отражается на активности взаимодействия штаммов с поликлональной сывороткой против A/California/07/09 [9]. В штамме A/IIV-Anadyr/177/2009, выделенным от пациента с летальной первичной вирусной пневмонией (см. табл. 1) [2], выявили 3 замены, в том числе и вышеперечисленную V338I (см. табл. 3). Все МКА, кроме 1Е7, активно реагировали с этим штаммом (см. табл. 1). Таким образом, снижение взаимодействия МКА 1Е7 с вирусом может быть вызвано заменами в позициях K226T и/или D239G. В то же время замена D239G (или по номенклатуре зрелого HA H1 - D222G) ассоциируется не с изменением антигенных свойств, а с расширением рецепторной специфичности: вирусы с такой мутацией чаще выделяют от больных с летальным исходом заболевания из секционного материала нижних дыхательных путей [2, 5, 9, 20]. Отметили значимое снижение антигенного родства А/ПV-Moscow/01/2009 со штаммами A/IIV-Vla-dimir/35/2011, A/IIV-Moscow/83/2011 и A/IIV-Tomsk/ 19/2012 по эпитопам, взаимодействующим с МКА 1Е7, 3D9, 6A3, и 2 последних штаммов - также с МКА 10G2 (см. табл. 1). В данных штаммах обнаружили 4 замены в одинаковых позициях: D114N, S202T, E391K и S468N (см. табл. 3). Штаммы с подобными мутациями зареги-стированы [22], однако их антигенная характеристика не представлена. Замена E391K широко распространилась уже в конце 2009 г.; предполагают, что эта мутация усиливает взаимодействие между мономерами HA и играет определенную роль в слиянии мембран [7]. Результаты исследования ряда штаммов с заменой E391K с поликлональными сыворотками хорьков в РТГА показали, что на антигенные свойства HA эта замена не влияет [6]. А.о. E391 и S468 входят в состав малой субъединицы HA2 и, по-видимому, не могут менять антигенную специфичность указанных штаммов в отношении полученных МКА, которые реагируют с антигенными сайтами Sa и Sb в глобулярной части молекулы [14], образованной последовательностями большой субъединицы HA1. Остаток S202 входит в состав антигенного сайта Sb [21], к которому направлено МКА 10G2 [14]; с 2 из 3 штаммов с данной мутацией МКА 10G2 реагирует в РТГА слабо Таблица 3 Аминокислотные замены в молекуле HA штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 Аминокислотная позиция в HA штамма A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl Штамм вируса гриппа A/ California/07/2009 A/IIV Anadyr/177/2009 A/IIV Vladimir/35/2011 A/IIV Moscow/83/2011 A/IIV Tomsk/19/2012 ACR46981* AFM72832 ADC54195 AEI87742 AEI87582 AFH41323 S100 P** _*** - - - D114 - - N N N T137 - - - A - S138 - - - - N H155 - - - - R A156 - - V - - N173 - - - D - S202 - - T T T T220 S - - - - K226 - T - - - D239 - G X - - Q240 R - - - - V266 - - - - L V338 I I - - - E391 - - K K K K460 - - - E - S468 - - N N N Примечание. * - номер аминокислотной последовательности НА штамма в GenBank [19]; ** - замена а.о. в штамме по сравнению с последовательностью штамма A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl; а.о. в HA нумерованы со стартового метионина с учетом сигнального пептида [20, 21]; *** - а.о., идентичные с последовательностью штамма A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)swl. 38 (см. табл. 1). В штаммах A/IIV-Vladimir/35/2011, A/IIVMoscow/83/2011 и A/IIV-Tomsk/19/2012, кроме того, обнаружили несколько индивидуальных дополнительных мутаций, которые приводят к заменам в регионе 137-266 а.о., но нам не удалось найти сведений об их влиянии на антигенные свойства. Часть измененных аминокислот картирована в сайте Са2 (H155R, A156V), замена N173D - в сайте Sa, этот а.о. входит в эпитопы для МКА 3A3, 1E7, 3D9, 6A3 [14]; в непосредственной топологической близости локализован рецепторсвязывающий домен [21]. Изучение более широкого набора генетически охарактеризованных вирусов с помощью МКА позволит расширить существующие представления об антигенной структуре и эволюции HA пандемических вирусов гриппа A(H1N1)pdm09, а также своевременно выявлять штаммы с потенциально опасными мутациями. Полученные данные послужили основой для разработки иммуноферментного метода дифференциальной диагностики пандемических штаммов вируса гриппа с помощью сандвич-варианта ИФА. До настоящего времени описана одна зарубежная тест-система, в которой использованы 2 МКА к HA пандемического вируса гриппа A/California/04/2009 [12], однако описание свойств данных МКА отсутствует. В настоящей работе для выявления вируса использовали МКА, которые направлены к наиболее консервативным эпитопам HA, опознаваемым МКА 5F7, 3А3 и 10G2, а также 1Е7. МКА 5F7 выбрали в качестве необходимого компонента сандвича в связи с широкой специфичностью взаимодействия с пандемическими вирусами в РТГА (см. табл. 1). Провели испытания около 20 вариантов сандвича. Оптимальным оказалось сочетание из 3 МКА к консервативным эпитопам: смесь МКА 5F7 и 10G2 в качестве «захватывающих» антител и смесь конъюгатов МКА 5F7 и 3A3 - в качестве детектирующих антител (см. табл. 2). Достигнуто избирательное определение штаммов пандемического вируса гриппа, вирусы других подтипов гриппа А и вирусы гриппа В в сандвиче не выявлялись. Важно, что некоторые штаммы вируса гриппа A(H1N1)pdm09 не обладали гемагглютинирующей активностью (титр в РГА < 1:2), тогда как ОП сигнала этих вирусов в сандвич-ИФА превышала порог чувствительности реакции более чем в 2,5 раза. Высокая чувствительность метода внушает надежду, что разработанный вариант сандвич-ИФА позволит определять пандемические вирусы гриппа A(H1N1) pdm09 непосредственно в материалах от больных, до выделения штаммов на куриных эмбрионах или в культуре клеток. Заключение Показано, что полученные МКА к пандемическому вирусу гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl выявляют 6 разных эпитопов на молекуле НА. МКА различаются по антигенному сродству к HA штаммов A(H1N1) pdm09, циркулировавших в РФ в 2009-2012 гг. 1 МКА - 5F7, направлено к наиболее консервативному эпитопу на молекуле HA и может быть использовано для индикации штаммов пандемического вируса гриппа в РТГА. 2 других эпитопа, опознаваемых МКА 3А3 и 10G2, также достаточно консервативны в структуре белка. С применением 3 данных МКА разработан высокочувствительный сандвич-вариант ИФА для дифференциального выявления пандемических вирусов гриппа. В противоположность этому 3 других МКА - 3D9, 6A3 и 1Е7 направлены к вариабельным эпитопам HA, чувствительны к аминокислотной замене в позиции D114N, нескольким заменам в антигенных сайтах Sa, Sb (S202T) и Ca2, а также в рецепторсвязывающем домене. Предварительные итоги эпидемического сезона 2012-2013 гг. показа ли, что как в РФ, так и в странах Европейского региона штаммы вируса гриппа A(H1N1)pdm09 стали ведущей причиной подъема уровня заболеваемости. МКА 3D9, 6A3 и 1Е7 могут использоваться для выявления различий в структуре HA штаммов A(H1N1)pdm09 в РТГА и изучения антигенного дрейфа штаммов пандемического вируса гриппа, выделенных в период последующих эпидемических сезонов.

References

Supplementary files