Genetic characterization of the Wad Medani virus (WMV) (Reoviridae, Orbivirus), isolated from the ticks Hyalomma asiaticum Schulze et Schlottke, 1930 (Ixodidae: Hyalomminae) in Turkmenistan, Kazakhstan, and Armenia and from the ticks H. anatolicum Koch, 1844 in Tajikistan

Full Text

При проведении зондирования территорий среднеазиатских республик и Закавказья в рамках программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в разных экосистемах Северной Евразии выделены 14 штаммов вируса Вад Медани (Wad Medani virus - WMV, Orbivirus, Reoviridae). 10 штаммов WMV изолированы в Туркмении [1-5]; 2 - в Казахстане [6-10]; 1 - в Таджикистане [11-13], 1 - в Армении [14]. Прототипный штамм WMV изолирован R. Taylor и со- авт. из клещей Rhipicephalus sanguineus Latreille, 1806 (Ixodidae: Rhipicephalinae), собранных в ноябре 1952 г. с овец в окрестностях пос. Вад Медани (Судан; 16° с. ш., 38° в. д.). Вирус был отнесен к группе Кемерово (Reoviridae, Orbivirus) [15, 16]. Позднее более 20 штаммов WMV были изолированы из клещей Hyalomma asiaticum Schulze et Schlottke, 1929, H. anatolicum Koch, 1844 (Ixodidae: Hyalomminae), Am- blyomma cajennense Fabricius, 1787 (Ixodidae: Ambly- omminae), Boophilus microplus Canestrini, 1888, Rh. guil- honi Morel et Vassiliades, 1963, Rh. evertsi Neumann, 1897 (Ixo-didae: Rhipicephalinae) в Судане, Египте, Сенегале, Индии, Пакистане, Иране, Ямайке [16, 17]. Антитела к WMV обнаружены у верблюдов, буйволов [16]. Известны 2 штамма, изолированные A. Rudnik из клещей B. microplus, которые были собраны в январе 1961 г. в округе Селетар в Сингапуре (01°02' с. ш., 103°50' в. д.) [18]. Однако вирус Селетар не принято в настоящее время рассматривать в качестве самостоятельного [19]. Род Orbivirus объединяет безоболочечные вирусы (90 нм), геном которых представлен 10 сегментами двуцепочечной РНК длиной от 800 до 4000 п. н. о. соответственно. Суммарная длина генома прототипного вируса синего языка овец (BTV - bluetongue virus) составляет 19,2 тыс. п. н. о. [19]. К орбивирусам относятся патогены человека и животных, такие как вирусы группы Кемерово (KEMV - Kemerovo virus), лихорадки Корри- парта (CORV - Corriparta virus), лихорадки Чангвинола (CGLV - Changuinola virus), африканской чумы лошадей (AHSV - African horse sickness virus), BTV и др. [20]. Орбивирусы принадлежат экологической группе арбо- вирусов, т. е. их передача позвоночным хозяевам происходит посредством кровососущих членистоногих. В зависимости от переносчика можно выделить три главные экологические группы орбивирусов: 1) передаваемые мокрецами (Culicoides borne, сем. Heleidae); 2) передаваемые комарами (mosquitoes borne); 3) передаваемые клещами (tick borne). WMV принадлежит группе клещевых орбивирусов и входит в антигенную серогруппу B, которая также объединяет вирусы группы Кемерово[1], Иери (Ieri) и Баку [19]. Геномные данные для клещевых вирусов в настоящее время известны только для вируса Баку (BAKV - Baku virus) и вирусов группы Кемерово, включая GIV [21-23]. В настоящей работе методом полногеномного секвенирования (next-generation sequencing) определена практически полная последовательность генома WMV (штамм LEIV-8066Tur), изолированного из клещей Hyalomma asiaticum, которые собраны с овец в Бахарденском районе Туркмении, и проведен молекулярно-генетический и филогенетический анализ группы клещевых орбивирусов. Материалы и методы Прототипный штамм вируса Вад Медани (LEIV- 8066Tur) получен из Государственной коллекции вирусов (ГКВ) РФ при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизирован- ной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4 сут) мышей забивали в соответствии с правилами этичного содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 700 мкл лизирующего буфера RLT (QIA- GEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделяли набором «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) из 350 мкл буфера в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориме- тра Qubit (Invitrogen, США). Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле- ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплециро- ванной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illumina, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIA- GEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (BioRad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) с применением набора «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили, используя программу «CLC Genomics Workbench 5.5» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей осуществляли с помощью сервиса BLASTX (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Генетическую дистанцию определяли по модели p-dis- tance с попарным удалением гэпов. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с использованием программы MEGA5 по методу максимального правдоподобия (maximum likelihood) с 1000-кратным бутстреп-тестированием. Результаты и обсуждение В таксономии рода Orbivirus на основе серологических связей выделены четыре антигенные группы, A - D, которые соответствуют определенному экологическому комплексу, определяемому по типу членистоногого переносчика. В группу А включены вирусы, передаваемые мокрецами: BTV, AHSV и др. В группу В входят клещевые орбивирусы: WMV, BAKV, KEMV (включает GIV) и IERIV. Группы С и D включают москитные орбивирусы CORV и Вонгорр (WGRV - Wongorr virus) соответственно. При этом отдельный «вид» орбивирусов рассматривается как совокупность различных серотипов, которые могут обладать значительной дивергенцией [19]. С накоплением геномных данных классификация орбивирусов уточняется, в том числе на основе филогенетического анализа различных сегментов вирусного генома [27-32]. Филогенетически орбивирусы делятся на три кластера, которые в целом совпадают с антигенными и экологическими группами (рис. 1). Среди клещевых вирусов наиболее изучены вирусы группы KEMV, которая включает множество серотипов, экологически связанных с морскими птицами и иксодовыми (Ixodidae) клещами. Ранее нами была определена последовательность генома BAKV, экологически связанного с аргасовыми клещами (Argasidae) [23]. Рис. 1. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения аминокислотных последовательностей РНК- зависимой РНК-полимеразы орбивирусов. Положение вируса WMV указано черным кружком. Справа - названия филогенетических групп и преимущественный переносчик. Рис. 2. Филогенетическая структура группы клещевых вирусов рода Orbivirus, построенная на основе сравнения аминокислотных последовательностей белка T2(VP3) (белок внутреннего капсида). Геном орбивирусов представлен 10 сегментами двуцепочечной РНК, которые кодируют 7 структурных (VP1- VP7) и 4 неструктурных (NS1-NS4) белка. Наиболее консервативным белком орбивирусов является РНК- зависимая РНК-полимераза (Pol, VP1). Уровень гомологии WMV с клещевыми вирусами BAKV и GIV по аминокислотной последовательности Pol составляет 64%. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения аминокислотных последовательностей Pol, представлен на рис. 1. Из структурных белков наиболее консервативным считается протеин T2 (VP3), который формирует внутреннюю оболочку капсида. Гомология WMV по данному протеину составляет от 46 до 67% с комариными и клещевыми орбивирусами соответственно. Главные антигенные детерминанты орбивирусов расположены на трех белках внешнего слоя капсида (VP2, VP5 и VP7 (T13)). Наиболее дивергентными являются белки VP2 и VP5. Протеин VP2 формирует внешний слой капсида, и на его поверхности расположены главные нейтрализующие и рецепторсвязывающие сайты. Кроме того, белок VP2 является одним из факторов вирулентности орбивирусов. Антигенные детерминанты VP2 позволяют дифференцировать различные серо- типы внутри одного вида. Уровень гомологии WMV с другими клещевыми орбивирусами по аминокислотной последовательности белка VP2 составляет в среднем 26-30%. Протеин VP5 также участвует в определении серотипа вируса, возможно за счет обеспечения правильной конформации белка VP2. Его гомология между WMV и вирусами группы GIV достигает 45%. Протеин VP7 (T13) участвует во взаимодействии вириона с поверхностью клеток и так же, как и белок VP2, является одним из факторов вирулентности, определяя, в частности инфекционность коровой частицы вириона. В интактном вирионе антигенные эпитопы VP7 (T13) скрыты и не блокируются нейтрализующими антителами. «Коровые» антигенные детерминанты VP7 (T13) являются группо- и видоспецифичными, на их основе построена современная классификация отдельных «видов» орбивирусов. Уровень гомологии WMV с вирусами группы GIV и BAKV не превышает 57%. Уровень гомологии VP7 (T13) среди вирусов группы GIV составляет 75-83%. Геномный сегмент 9 орбивирусов кодирует вирусный фермент VP6 (Hel), который обладает РНК-связывающей и геликазной активностью. Гомология WMV по белку VP6 (Hel) составляет 36 и 38% с GIV и BAKV соответственно. У GIV и BTV ранее показано наличие дополнительной открытой рамки считывания (ОРС) в сегменте 9, кодирующей белок длиной 194 а.о. (GIV) с неизвестной функцией, обозначаемый VP6a или NS4 [33]. При анализе последовательности данного сегмента BAKV и WMV ОРС для VP6a также была обнаружена. Нужно отметить, что хотя аминокислотные последовательности VP6a у GIV, BAKV и WMV обладают низким уровнем гомологии (20-30%), они имеют практически одинаковый размер (195 а.о.) и два близко расположенных старт - кодона. При этом длина ОРС у клещевых орбивирусов почти в 2 раза больше, чем у BTV [33]. На рис. 1-3 представлены результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения структурных и неструктурных белков орбивирусов. Положение WMV на дендрограмме в составе клещевых орбиви- русов совпадает для всех проанализированных белков. Согласно полученным данным, WMV является самостоятельным вирусом, филогенетически равноудаленным от вирусов группы KEMV. Эти данные подтверждают антигенную классификацию WMV как самостоятельный «вид» в антигенной группе В рода Orbivirus (Reoviridae). В Туркменистане штаммы WMV были изолированы из клещей Hyalomma asiaticum Schulze et Schlottke, 1929, собранных с овец и верблюдов весной 1972-1973 гг. в Иолотанском и Захметском районах Марыйской области с полуаридным типом ландшафтов [1, 3, 34] и в 1981 г. в пустынном ландшафте Бахарденского района Ашхабадской области [2]. В Казахстане штаммы WMV были изолированы из H. asiaticum в 1977 г. в пустынном ландшафте Балхашского района Алма-Атинской области, и уровень вирусо- форности иксодид был определен как 0,094% [6-10]. В Таджикистане WMV был изолирован из клещей H. an. anatolicum Koch, 1844 (зараженность - 0,002%), популяция которых составляла 76,5% от 49,2 тыс. собранных ик- содовых клещей [11, 12]. В условиях южного Таджикистана в течение года развивается 1-2 генерации ик- содовых клещей [11]. Вирус изолирован от голодных перезимовавших имаго, что свидетельствует о трансстадийной передаче вируса по ходу метаморфоза [8]. Показана экспериментальная инфекция WMV у телят при уровне вирусемии, обеспечивающем инфицирование на животных личинок H. an. anatolicum, которые передавали вирус по ходу метаморфоза до имагинальной стадии [35]. Эти особенности экологии H. an. anatolicum объясняют активность и стойкость природных очагов и высокий уровень иммунной прослойки населения, достигающий в южном Таджикистане 7,8%-10,3%, тогда как в северном Таджикистане эти показатели существенно ниже - 2,1% [35]. Рис. 3. Филогенетическая структура группы клещевых вирусов рода Orbivirus, построенная на основе сравнения аминокислотных последовательностей белка VP7(T13) (белок внешнего слоя капсида, несущий основные группоспецифичные антигенные детерминанты). В Армении штамм изолирован из клещей H. asiaticum, собранных в 1985 г. в Нахичеванской АССР [13]. Резюмируя результаты выделения WMV в Казахстане, Средней Азии и Закавказье, следует отметить основную значимость клещей H. asiaticum и H. anatolicum в поддержании природных очагов, приуроченных к пастбищным биоценозам аридного и полуаридного типа. Зондирование территорий Средней Азии, Казахстана и Закавказья проводили в рамках программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в разных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных ГКВ РФ [3б-40].

References

Supplementary files