Genetic characterization of the Batken virus (BKNV) (Orthomyxoviridae, Thogotovirus) isolated from the Ixodidae ticks Hyalomma marginatum Koch, 1844 and the mosquitoes Aedes caspius Pallas, 1771, as well as the Culex hortensis Ficalbi, 1889 in the Central Asia

Full Text

Прототипный штамм LEIV-K306 вируса Баткен (BKNV - Batken virus) изолирован от иксодовых клещей Hyalomma marginatum Koch, 1844, собранных с овец в окрестностях районного центра Баткен в Киргизии в апреле 1970 г. [1, 2]. Впоследствии на территории Киргизии BKNV был изолирован из смешанного пула комаров Aedes caspius Pallas, 1771 и Culex hortensis Ficalbi, Для корреспонденции: Львов Дмитрий Константинович, акад. РАН; dk_lvov@mail.ru 1889 [3]. Результаты исследований показали [1, 3-5], что BKNV чрезвычайно близок к вирусу Дхори (DHOV - Dhori virus) (Orthomyxoviridae, Thogotovirus), который впервые изолирован от иксодовых клещей Hyalomma dromedarii Koch, 1844, собранных с верблюдов в индийском штате Гуджарат [6, 7]. Гомологичность оболочеч-ных белков DHOV и BKNV достигает 90% [5]. По со 33 вокупности признаков BKNV может рассматриваться в качестве регионального варианта DHOV [5, 8-10]. Вместе с DHOV и BKNV в род Thogotovirus (Orthomyxoviridae) входят вирусы Тогото (THOV - Thogoto virus) и Арагуари (ARGV - Araguary virus). THOV впервые изолирован в 1960 г. из пула клещей Rhipicephalus (Boophilus) decoloratus Koch, 1844 и Rhipicephalus evert-sii Neumann, 1897, собранных со скота в лесу Тогото в окрестностях г. Найроби (Кения). Позднее THOV был изолирован от людей, коров, верблюдов и клещей в Нигерии, Эфиопии, Кении, Камеруне, ЦАР, Уганде, Египте, Иране, Италии Португалии [11, 12]. ARGV, впервые изолированный в 1969 г. от опоссума (Philander opossum) в бразильском штате Амапа, по данным серологического обследования широко распространен у марсупиалов (Didelphis marsupialis) и проживающих в регионе людей [13]. Тоготовирусы патогенны для человека, они вызывают лихорадочные заболевания, которые в ряде случаев осложняются энцефалитом и могут заканчиваться летально [9, 14, 15]. В частности, DHOV послужил причиной лабораторного, по-видимому, аэрогенного заражения 5 из 10 работавших сотрудников: у больных наблюдались симптомы поражения ЦНС [15]. В настоящей работе с использованием метода полногеномного секвенирования впервые определена практически полная последовательность генома BKNV. На основе полученных данных проведен молекулярный филогенетический анализ, в результате которого показано, что BKNV обладает высокой гомологией с DHOV, но имеет различия по гомологии поверхностного гликопротеина НА. Материалы и методы Вирусные штаммы. Использованный в работе BKNV LEIV-306К получен из Государственной коллекции вирусов РФ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Для накопления вируса лиофи-лизированную суспензию восстановили в 1 мл культуральной среды ДМЕМ (с добавлением антибиотика) и использовали для интрацеребрального заражения новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-3 сут) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 1 мл реагента TRIzol (Life Technology, США) и гомогенизировали пластиковым пестиком. Все работы, связанные с получением и накоплением вирусного материала, проводили в боксовых помещениях, оборудованных и сертифицированных для работы с микроорганизмами II группы патогенности. Выделение РНК осуществляли согласно прилагаемой инструкции производителя данного реагента. Конечный осадок суммарной РНК растворяли в 100 мкл DEPC-обработанной воды. Для дополнительной очистки, а также для удаления низкомолекулярных фракций рибосомальной (5S) и транспортной РНК полученный препарат очищали набором «RNeasy mini kit» (QIA-GEN, Германия) в режиме clean-up на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли, используя флюориметр Qubit (Invitrogen, США). Для удаления ри-босомальной (18S и 28S) РНК использовали набор «Gen-Read rRNA depletion Kit» (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для этого брали не более 3 мкг суммарной РНК. После проведения деплеции количество РНК BKNV и DHOV составляло около 200 нг. Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование. Для получения кДНК около 100 нг деплецированной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIA-cube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illumi-na, США) в соответствии с инструкцией. Для селекции ДНК по размеру использовали реагент «AMpure XP» (Beckman Coulter, США) с расчетом получения ДНК-библиотек длиной более 270 н.о., что соответствует размеру вставки около 150 н.о. Данные требования к размеру ДНК-библиотек связаны с использованием для секвенирования набора, позволяющего секвенировать не более 150 н.о. в одну сторону. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли с помощью программы «CLC Genomics Workbench 5.5» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили, используя сервис BLASTX (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). Для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили, применяя программу MEGA5 по методу ближайшего соседа с 1000-кратным бутстреп-тестированием. Последовательности выравнивали по алгоритму ClustalW. Результаты и обсуждение Анализ данных полногеномного секвенирования вируссодержащего BKNV материала провели двумя способами. В первом случае проводили сборку de novo, во втором риды картировали на референсную последовательность генома DHOV, поскольку ранее было показано, что BKNV по структурным белкам обладает высокой гомологией с DHOV. Картирование является более эффективным методом, чем сборка de novo, что выражается в получении более длинных контигов с более глубоким покрытием. В результате, сочетая два метода, получили консенсусные последовательности, которые практически полностью перекрывали геном BKNV. Геном тоготовирусов представлен шестью сегментами РНК отрицательной полярности, которые кодируют семь протеинов (сегмент 6 кодирует две формы матриксного протеина, структура которых у TOGV и DHOV отличается). Наиболее консервативным белком является полимеразный 34 Уровень (в %) гомологии белков вируса Баткен (BKNV) LEIV-306K с тоготавирусами Вирусный белок Вирус PB2 (сегмент 1) PB1 (сегмент 2) PA (сегмент 3) HA (сегмент 4) NP (сегмент 5) М (сегмент 6) Дхори (DHOV) 96,1 98,2 96,1 90 96,6 96,3 Тогото (TOGV) 34,7 65,6 42 36,3 43,7 25,1 Джос (JOSV) 33,8 60,9 37,6 35,1 45,2 27,3 Вирус гриппа A 21,3 31,6 25 - 27,4 - Примечание. Также представлены данные о гомологии белков BKNV с вирусами гриппа А. белок PB1, кодируемый сегментом 2. РВ1 имеет структуру (включая полимеразные мотивы pre-A, A, B, C, D, E), характерную для всех вирусов с сегментированным РНК-геномом отрицательной полярности. Уровень гомологии РВ1 у ортомиксовирусов разных родов (например, Thogotovirus и Influenza virus A) достигает 30%. Между тоготови-русами гомология РВ1 составляет от 60% (между TOGV и DHOV) до 74% (между TOGV и вирусом Джос (JOSV)). Два других белка репликативного комплекса PB2 и PA более дивергенты - их гомология между DHOV и TOGV составляет около 40%, а с вирусами рода Influenza virus A - около 25%. Белки полимеразного комплекса BKNV обладают высоким уровнем гомологии с DHOV - 98 и 96% для PB1 и PA/PB2 соответственно (см. таблицу). Из структурных белков наиболее консервативным является белок нуклеокапсида (NP), кодируемый сегментом 5. Его гомология между DHOV и TOGV составляет около 45%. При этом уровень гомологии NP между TOGV и JOSV выше - 64%. Гомология NP BKNV с DHOV составляет 96% (см. таблицу). Белок NP является единственным структурным белком того-товирусов, который обладает определенной гомологией с ортомиксовирусами других родов. Так, NP DHOV обладает около 27% идентичности с NP вируса гриппа А (см. таблицу). Наиболее дивергентным белком можно считать матрикс-ный белок М (сегмент 6), уровень гомологии которого у DHOV с TOGV и JOSV примерно одинаков - около 25%. При этом между TOGV и JOSV данное значение достигает 54%. Данный сегмент у TOGV и DHOV отличается и по схеме альтернативного сплайсинга, который приводит к продукции у TOGV второй формы (удлиненной) белка М. Тогда как у DHOV найдена дополнительная рамка считывания, кодирующая небольшой (12 кДа) белок с неизвестной функцией. Структура сегмента 6 генома BKNV соответствует DHOV и обладает с ним 96% гомологии. Поверхностный гликопротеин HA (гемагглютинин) кодируется сегментом 4 и также является дивергентным белком. Это поверхностный гликопротеин, обладающий рецепторными функциями и несущий основные антигенные детерминанты ортомиксовирусов. Уровень гомология DHOV с TOGV и JOSV по HA составляет 35%. При этом между TOGV и JOSV гомология HA достигает только 44%, что является наименьшим значением для всех белков между данными вирусами. Гомология HA BKNV с DHOV также составляет минимальное из всех белков значение - 90%. Дивергенция HA при высоком уровне гомологии других белков у BKNV и DHOV объясняет антигенные различия между этими близкородственными вирусами. Поскольку гомология остальных структурных и неструктурных белков BKNV и DHOV составляет 9698%, можно заключить, что BKNV является топотипным, характерным для Средней Азии и Закавказья вариантом DHOV. Эволюционное расхождение BKNV и DHOV по поверхностному гликопротеину, вероятно, связано с локальными экологическими особенностями, хотя их ареалы перекрываются. Необходимо отметить, что BKNV значительно чаще, чем DHOV, изолировали от комаров, что также может быть связано с различиями в структуре НА данных вирусов. Для анализа в качестве референс-последовательности генома DHOV использовали про-тотипный штамм DHOV 1313/61 (ID GenBank М65866), изолированный в Индии в 1973 г. Все представители рода Thogotovirus тесно связаны с иксодовыми клещами - ранее этот род даже назывался Orthoacarivirus, с тем чтобы подчеркнуть экологическую связь с иксодовыми клещами (Acari: Parasitiformes, Ixodidae Koch, 1844) [9, 14]. Тесная экологическая связь DHOV/BKNV с клещами рода Hyalomma, в частности H. marginatum, определяет выявленный ареал, практически совпадающий с ареалом вируса кКгЛ [9, 10, 16-18]. DHOV выделен в Индии [6], Египте [11], южной части Португалии [11]; на территории бывшего СССР, BKNV - в Киргизии [1, 3] и Армении [19]; DHOV - в Астраханской области [1922] и Азербайджане [19]. DHOV выделен от клещей H. dromedarii в Индии и Египте [6, 11, 12]; H. marginatum - в Португалии [11], Азербайджане и в Астраханской области [1, 19, 20-22]; Ornithodoros lahorensis - в Азербайджане; Dermacentor marginatus - в Армении, от комаров Anopheles hyrcanus - в Астраханской области [20]; BKNV из смешанного пула комаров Aedes caspius и Culex hortensis - в Киргизии [3]. При серологическом мониторинге в Киргизии антитела (АТ) к BKNV были обнаружены у людей (0,3%), овец (1%), крупного рогатого скота (КРС) (1,3%) [3]. Вирус-нейтрализующие АТ к DHOV выявлены в индийских штатах Гуджарат и Заурастра у 100% верблюдов, 19% лошадей, 2% коз и не отмечены у КРС, овец, собак и свиней. Иммунная прослойка среди домашних животных не обнаружена в штате Кашмир [6, 14]. Данные о природном резервуаре тоготовирусов среди диких позвоночных долгое время отсутствовали до выделения в Астраханской области DHOV от зайца-русака (Lepus europaeus Pallas, 1778) [22]. DHOV был также изолирован из внутренних органов молодого баклана, добытого в 1-й декаде июля 2006 г. на острове Жемчужный, расположенном в северо-западной части Каспийского моря (45°00' с. ш., 48°18' з. д.), примерно в 100 км к югу от нижнего пояса дельты Волги (Среднеазиатская физико-географическая страна). Вируснейтрализующие АТ к DHOV на острове Жемчужный обнаружены у 10% больших бакланов (Phalacrocorax carbo Linnaeus, 1758), у 16,7% серебристых чаек (Lams argentatus Pontoppidan, 1763). У птицы, от которой выделен штамм DHOV, наблюдались клинические признаки заболевания: дыхательная недостаточность, неспособность к полету, потеря координации [23]. Имеются данные о чувствительности птиц водно-околоводного комплекса к заражению тоготовирусами [5, 8]. Стойкий очаг арбовируса при отсутствии кровососущих переносчиков (комары, ик-содовые и аргасовые клещи) определяет уникальность экологической ситуации на острове Жемчужный. Это дает основание для предположений об иных механизмах 35 передачи вируса - через зараженный планктон и аэрозольным путем [23]. Зондирование территорий Средней Азии, Закавказья и Русской равнины проводили в рамках Программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных Государственной коллекции вирусов РФ [10, 16, 17, 19, 24].

References

Supplementary files