Генетическая характеристика вируса Баткен (BKNV-Batken virus) (Orthomyxoviridae, Thogotovirus), изолированного из иксодовых клещей Hyalomma marginatum Koch, 1844 и комаров Aedes caspius Pallas, 1771 и Culex hortensis Ficalbi, 1889 в Средней Азии

Полный текст

Прототипный штамм LEIV-K306 вируса Баткен (BKNV - Batken virus) изолирован от иксодовых клещей Hyalomma marginatum Koch, 1844, собранных с овец в окрестностях районного центра Баткен в Киргизии в апреле 1970 г. [1, 2]. Впоследствии на территории Киргизии BKNV был изолирован из смешанного пула комаров Aedes caspius Pallas, 1771 и Culex hortensis Ficalbi, Для корреспонденции: Львов Дмитрий Константинович, акад. РАН; dk_lvov@mail.ru 1889 [3]. Результаты исследований показали [1, 3-5], что BKNV чрезвычайно близок к вирусу Дхори (DHOV - Dhori virus) (Orthomyxoviridae, Thogotovirus), который впервые изолирован от иксодовых клещей Hyalomma dromedarii Koch, 1844, собранных с верблюдов в индийском штате Гуджарат [6, 7]. Гомологичность оболочеч-ных белков DHOV и BKNV достигает 90% [5]. По со 33 вокупности признаков BKNV может рассматриваться в качестве регионального варианта DHOV [5, 8-10]. Вместе с DHOV и BKNV в род Thogotovirus (Orthomyxoviridae) входят вирусы Тогото (THOV - Thogoto virus) и Арагуари (ARGV - Araguary virus). THOV впервые изолирован в 1960 г. из пула клещей Rhipicephalus (Boophilus) decoloratus Koch, 1844 и Rhipicephalus evert-sii Neumann, 1897, собранных со скота в лесу Тогото в окрестностях г. Найроби (Кения). Позднее THOV был изолирован от людей, коров, верблюдов и клещей в Нигерии, Эфиопии, Кении, Камеруне, ЦАР, Уганде, Египте, Иране, Италии Португалии [11, 12]. ARGV, впервые изолированный в 1969 г. от опоссума (Philander opossum) в бразильском штате Амапа, по данным серологического обследования широко распространен у марсупиалов (Didelphis marsupialis) и проживающих в регионе людей [13]. Тоготовирусы патогенны для человека, они вызывают лихорадочные заболевания, которые в ряде случаев осложняются энцефалитом и могут заканчиваться летально [9, 14, 15]. В частности, DHOV послужил причиной лабораторного, по-видимому, аэрогенного заражения 5 из 10 работавших сотрудников: у больных наблюдались симптомы поражения ЦНС [15]. В настоящей работе с использованием метода полногеномного секвенирования впервые определена практически полная последовательность генома BKNV. На основе полученных данных проведен молекулярный филогенетический анализ, в результате которого показано, что BKNV обладает высокой гомологией с DHOV, но имеет различия по гомологии поверхностного гликопротеина НА. Материалы и методы Вирусные штаммы. Использованный в работе BKNV LEIV-306К получен из Государственной коллекции вирусов РФ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Для накопления вируса лиофи-лизированную суспензию восстановили в 1 мл культуральной среды ДМЕМ (с добавлением антибиотика) и использовали для интрацеребрального заражения новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-3 сут) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 1 мл реагента TRIzol (Life Technology, США) и гомогенизировали пластиковым пестиком. Все работы, связанные с получением и накоплением вирусного материала, проводили в боксовых помещениях, оборудованных и сертифицированных для работы с микроорганизмами II группы патогенности. Выделение РНК осуществляли согласно прилагаемой инструкции производителя данного реагента. Конечный осадок суммарной РНК растворяли в 100 мкл DEPC-обработанной воды. Для дополнительной очистки, а также для удаления низкомолекулярных фракций рибосомальной (5S) и транспортной РНК полученный препарат очищали набором «RNeasy mini kit» (QIA-GEN, Германия) в режиме clean-up на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли, используя флюориметр Qubit (Invitrogen, США). Для удаления ри-босомальной (18S и 28S) РНК использовали набор «Gen-Read rRNA depletion Kit» (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для этого брали не более 3 мкг суммарной РНК. После проведения деплеции количество РНК BKNV и DHOV составляло около 200 нг. Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование. Для получения кДНК около 100 нг деплецированной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIA-cube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illumi-na, США) в соответствии с инструкцией. Для селекции ДНК по размеру использовали реагент «AMpure XP» (Beckman Coulter, США) с расчетом получения ДНК-библиотек длиной более 270 н.о., что соответствует размеру вставки около 150 н.о. Данные требования к размеру ДНК-библиотек связаны с использованием для секвенирования набора, позволяющего секвенировать не более 150 н.о. в одну сторону. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли с помощью программы «CLC Genomics Workbench 5.5» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили, используя сервис BLASTX (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). Для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили, применяя программу MEGA5 по методу ближайшего соседа с 1000-кратным бутстреп-тестированием. Последовательности выравнивали по алгоритму ClustalW. Результаты и обсуждение Анализ данных полногеномного секвенирования вируссодержащего BKNV материала провели двумя способами. В первом случае проводили сборку de novo, во втором риды картировали на референсную последовательность генома DHOV, поскольку ранее было показано, что BKNV по структурным белкам обладает высокой гомологией с DHOV. Картирование является более эффективным методом, чем сборка de novo, что выражается в получении более длинных контигов с более глубоким покрытием. В результате, сочетая два метода, получили консенсусные последовательности, которые практически полностью перекрывали геном BKNV. Геном тоготовирусов представлен шестью сегментами РНК отрицательной полярности, которые кодируют семь протеинов (сегмент 6 кодирует две формы матриксного протеина, структура которых у TOGV и DHOV отличается). Наиболее консервативным белком является полимеразный 34 Уровень (в %) гомологии белков вируса Баткен (BKNV) LEIV-306K с тоготавирусами Вирусный белок Вирус PB2 (сегмент 1) PB1 (сегмент 2) PA (сегмент 3) HA (сегмент 4) NP (сегмент 5) М (сегмент 6) Дхори (DHOV) 96,1 98,2 96,1 90 96,6 96,3 Тогото (TOGV) 34,7 65,6 42 36,3 43,7 25,1 Джос (JOSV) 33,8 60,9 37,6 35,1 45,2 27,3 Вирус гриппа A 21,3 31,6 25 - 27,4 - Примечание. Также представлены данные о гомологии белков BKNV с вирусами гриппа А. белок PB1, кодируемый сегментом 2. РВ1 имеет структуру (включая полимеразные мотивы pre-A, A, B, C, D, E), характерную для всех вирусов с сегментированным РНК-геномом отрицательной полярности. Уровень гомологии РВ1 у ортомиксовирусов разных родов (например, Thogotovirus и Influenza virus A) достигает 30%. Между тоготови-русами гомология РВ1 составляет от 60% (между TOGV и DHOV) до 74% (между TOGV и вирусом Джос (JOSV)). Два других белка репликативного комплекса PB2 и PA более дивергенты - их гомология между DHOV и TOGV составляет около 40%, а с вирусами рода Influenza virus A - около 25%. Белки полимеразного комплекса BKNV обладают высоким уровнем гомологии с DHOV - 98 и 96% для PB1 и PA/PB2 соответственно (см. таблицу). Из структурных белков наиболее консервативным является белок нуклеокапсида (NP), кодируемый сегментом 5. Его гомология между DHOV и TOGV составляет около 45%. При этом уровень гомологии NP между TOGV и JOSV выше - 64%. Гомология NP BKNV с DHOV составляет 96% (см. таблицу). Белок NP является единственным структурным белком того-товирусов, который обладает определенной гомологией с ортомиксовирусами других родов. Так, NP DHOV обладает около 27% идентичности с NP вируса гриппа А (см. таблицу). Наиболее дивергентным белком можно считать матрикс-ный белок М (сегмент 6), уровень гомологии которого у DHOV с TOGV и JOSV примерно одинаков - около 25%. При этом между TOGV и JOSV данное значение достигает 54%. Данный сегмент у TOGV и DHOV отличается и по схеме альтернативного сплайсинга, который приводит к продукции у TOGV второй формы (удлиненной) белка М. Тогда как у DHOV найдена дополнительная рамка считывания, кодирующая небольшой (12 кДа) белок с неизвестной функцией. Структура сегмента 6 генома BKNV соответствует DHOV и обладает с ним 96% гомологии. Поверхностный гликопротеин HA (гемагглютинин) кодируется сегментом 4 и также является дивергентным белком. Это поверхностный гликопротеин, обладающий рецепторными функциями и несущий основные антигенные детерминанты ортомиксовирусов. Уровень гомология DHOV с TOGV и JOSV по HA составляет 35%. При этом между TOGV и JOSV гомология HA достигает только 44%, что является наименьшим значением для всех белков между данными вирусами. Гомология HA BKNV с DHOV также составляет минимальное из всех белков значение - 90%. Дивергенция HA при высоком уровне гомологии других белков у BKNV и DHOV объясняет антигенные различия между этими близкородственными вирусами. Поскольку гомология остальных структурных и неструктурных белков BKNV и DHOV составляет 9698%, можно заключить, что BKNV является топотипным, характерным для Средней Азии и Закавказья вариантом DHOV. Эволюционное расхождение BKNV и DHOV по поверхностному гликопротеину, вероятно, связано с локальными экологическими особенностями, хотя их ареалы перекрываются. Необходимо отметить, что BKNV значительно чаще, чем DHOV, изолировали от комаров, что также может быть связано с различиями в структуре НА данных вирусов. Для анализа в качестве референс-последовательности генома DHOV использовали про-тотипный штамм DHOV 1313/61 (ID GenBank М65866), изолированный в Индии в 1973 г. Все представители рода Thogotovirus тесно связаны с иксодовыми клещами - ранее этот род даже назывался Orthoacarivirus, с тем чтобы подчеркнуть экологическую связь с иксодовыми клещами (Acari: Parasitiformes, Ixodidae Koch, 1844) [9, 14]. Тесная экологическая связь DHOV/BKNV с клещами рода Hyalomma, в частности H. marginatum, определяет выявленный ареал, практически совпадающий с ареалом вируса кКгЛ [9, 10, 16-18]. DHOV выделен в Индии [6], Египте [11], южной части Португалии [11]; на территории бывшего СССР, BKNV - в Киргизии [1, 3] и Армении [19]; DHOV - в Астраханской области [1922] и Азербайджане [19]. DHOV выделен от клещей H. dromedarii в Индии и Египте [6, 11, 12]; H. marginatum - в Португалии [11], Азербайджане и в Астраханской области [1, 19, 20-22]; Ornithodoros lahorensis - в Азербайджане; Dermacentor marginatus - в Армении, от комаров Anopheles hyrcanus - в Астраханской области [20]; BKNV из смешанного пула комаров Aedes caspius и Culex hortensis - в Киргизии [3]. При серологическом мониторинге в Киргизии антитела (АТ) к BKNV были обнаружены у людей (0,3%), овец (1%), крупного рогатого скота (КРС) (1,3%) [3]. Вирус-нейтрализующие АТ к DHOV выявлены в индийских штатах Гуджарат и Заурастра у 100% верблюдов, 19% лошадей, 2% коз и не отмечены у КРС, овец, собак и свиней. Иммунная прослойка среди домашних животных не обнаружена в штате Кашмир [6, 14]. Данные о природном резервуаре тоготовирусов среди диких позвоночных долгое время отсутствовали до выделения в Астраханской области DHOV от зайца-русака (Lepus europaeus Pallas, 1778) [22]. DHOV был также изолирован из внутренних органов молодого баклана, добытого в 1-й декаде июля 2006 г. на острове Жемчужный, расположенном в северо-западной части Каспийского моря (45°00' с. ш., 48°18' з. д.), примерно в 100 км к югу от нижнего пояса дельты Волги (Среднеазиатская физико-географическая страна). Вируснейтрализующие АТ к DHOV на острове Жемчужный обнаружены у 10% больших бакланов (Phalacrocorax carbo Linnaeus, 1758), у 16,7% серебристых чаек (Lams argentatus Pontoppidan, 1763). У птицы, от которой выделен штамм DHOV, наблюдались клинические признаки заболевания: дыхательная недостаточность, неспособность к полету, потеря координации [23]. Имеются данные о чувствительности птиц водно-околоводного комплекса к заражению тоготовирусами [5, 8]. Стойкий очаг арбовируса при отсутствии кровососущих переносчиков (комары, ик-содовые и аргасовые клещи) определяет уникальность экологической ситуации на острове Жемчужный. Это дает основание для предположений об иных механизмах 35 передачи вируса - через зараженный планктон и аэрозольным путем [23]. Зондирование территорий Средней Азии, Закавказья и Русской равнины проводили в рамках Программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных Государственной коллекции вирусов РФ [10, 16, 17, 19, 24].

Список литературы

Дополнительные файлы