Molecular genetic characterization of the Gissar virus (GSRV) (Bunyaviridae, Phlebovirus, Uukuniemi group) isolated from the ticks Argas reflexus Fabricius, 1794 (Argasidae) collected in dovecote in Tajikistan

Full Text

Два штамма вируса Гиссар (Gissar virus - GSRV) изолированы в 1982 г. от аргасовых клещей Argas reflexus, Fabricius, 1794 (так называемых голубиных клещей), собранных в августе 1982 г. в голубятне над жилым помещением в пос. Гиссар в окрестностях г. Душанбе, Таджикистан (38°40’ с. ш., 68°40’ в. д.) [1, 2]. По данным электронной микроскопии GSRV отнесен к семейству Bunyaviridae, однако его классификация до рода оказалась невозможной вследствие отсутствия антигенных связей с известными буньявирусами [3]. Семейство Bunyaviridae объединяет четыре рода обо- лочечных вирусов животных (Orthobunyavirus, Phlebovirus, Hantavirus и Nairovirus) и один род вирусов растений (Tospovirus). Геном буньявирусов представлен тремя сегментами РНК отрицательной (или амбивалентной) полярности (L-, M- и S -сегмент). В основном (за исключением вирусов рода Hantavirus), буньявирусы животных являются арбовирусами, т. е. заражение позвоночных животных происходит при укусе членистоногого переносчика (клещи или комары). Около 20 бу- ньявирусов, включая GSRV, в настоящее время входят в группу неклассифицированных [4, 5]. В настоящей работе методом полногеномного сек- венирования (next-generation sequencing, платформа Illu- mina) определена практически полная последовательность генома GSRV, что позволило провести филогенетический анализ и установить его таксономическое положение. На основании проведенного молекулярно-генетического и филогенетического анализа GSRV классифицирован как среднеазиатский вариант вируса Гранд Арбо (Grand Ar- baud virus - GAV) группы Уукуниеми (Uukuniemi) рода Phlebovirus (Bunyaviridae). Материалы и методы Прототипный штамм GSRV 5995 был получен из Государственной коллекции вирусов (ГКВ) РФ при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4 сут) мышей забивали в соответствии с правилами этичного содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 700 мкл лизирующего буфера RLT (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделяли набором «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) из 350 мкл буфера в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориме- тра Qubit (Invitrogen, США). Рис. 1. Результаты филогенетического анализа, проведенного методом ближайшего соседа для полномеразных аминокислотных последовательностей белка нуклеокапсида N (S-сегмент) семейства Bunyaviridae. GSRV обозначен черным треугольником. Справа указана принадлежность вирусов рода Plebovirus к экологическим группам в зависимости от членистоного переносчика. Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле- ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплецирован- ной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illumina, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIA- GEN, Германия). Измерение молярности полученных библиотек проводили методом ПЦР в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек осуществляли на приборе MiSeq (Illu- mina, США) с использованием набора «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили, используя программу «CLC Genomics Workbench 5.5» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей осуществляли с применением сервиса BLASTX (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW [6]. Генетическую дистанцию определяли по модели p-distance с попарным удалением гэпов. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с помощью программы MEGA5 по методу ближайшего соседа (neighbor joining) с 1000-кратным бутстреп- тестированием [7]. Результаты и обсуждение В результате обработки и первичного анализа данных полногеномного секвенирования генома GSRV определили протяженные нуклеотидные последовательности, обладающие гомологией с вирусами рода Phlebovirus (сем. Bunyaviridae). Результаты дальнейшего анализа показали, что определена полная нуклеотидная последовательность S-сегмента GSRV, тогда как последовательности сегментов M и L определены частично. Общая длина определенной последовательности составляет более 80% генома GSRV. Структура и размер S-сегмента GSRV является характерной для вирусов рода Phlebovirus. Длина S-сегмента составляет более 1700 н. о. S-сегмент кодирует два белка, которые расположены в двух открытых рамках считывания (ОРС) противоположной направленности (амби- сенс стратегия). ОРС структурного белка нуклеокапсида (N) кодируется в ориентации, комплементарной геномной РНК. Филогенетически вирусы рода Phlebovirus можно разделить на три главные ветви, две из которых представлены вирусами, передающимися клещами (клещевые флебовирусы), и одна - вирусами, передающимися комарами (вирусы москитных лихорадок) (рис. 1). Значение в патологии человека играют вирусы москитных лихорадок, из которых не менее 14 вызывают лихорадочные заболевания. Белок N GSRV обладает от 55 до 94% гомологии с вирусами группы Уукуниеми (Uukuniemi - UUKV) и 37-39% с москитными флебовирусами. Наибольший (94%) уровень гомологии GSRV достигает с GAV, который так же, как и GSRV, изолирован из клещей A reflexus Fabricius, 1794 из голубятни во Франции [8]. Второй белок, который кодирует S-сегмент, является неструктурным (NSs), его функция до конца не изучена. Предположительно NSs играет роль в подавлении системы врожденного иммунитета, блокируя продукцию интерферонов при инфекции [9, 10]. Гомология NSs GSRV с gAv составляет 74%. C другими вирусами группы Укуниеми гомология NSs GSRV составляет от 26% (вирус Манава - MAWV) до 50% (вирус Залив Терпения - ZTV). Результаты филогенетического анализа буньявирусов животных, проведенного на основе полноразмерного S-сегмента, представлены на рис. 1. На дендрограмме GSRV входит в группу клещевых флебовирусов (UUKV), группируясь вместе с GAV. Рис. 2. Результаты филогенетического анализа, проведенного методом ближайшего соседа для полномеразных аминокислотных последовательностей полипротеина- предшественника оболочечных белков GnGc (М-сегмент) вирусов семейства Bunyaviridae. Рис. 3. Результаты филогенетического анализа, проведенного методом ближайшего соседа для полномеразных аминокислотных последовательностей РНК-зависимой РНК- полимеразы вирусов семейства Bunyaviridae. Структурные, поверхностные гликопротеины (Gn и Gc), несущие основные антигенные детерминанты буньявирусов, кодируются M-сегментом, при этом его структура у клещевых и москитных флебовирусов отличается. Белки Gn и Gc транслируются в виде полипротеина-предшественника GnGc, который подвергается сложному процессингу с участием клеточных ферментов [4, 11]. У москитных флебовирусов в результате процессинга образуется дополнительный неструктурный белок NSm, который так же, как и NSs, участвует в блокировании системы апоптоза и, таким образом, связан с патогенностью вируса для позвоночных хозяев [4, 12]. Клещевые флебовирусы (группы UUKV и Бханджа - BHAV) белок NSm не кодируют. Длина S-сегмента клещевых флебовирусов составляет около 3200 н. о., а размер кодируемого полипротеина-предшественника GnGc - 1008 а. о. (UUKV). Мы определили практически полную последовательность кодирующей области M-сегмента GSRV Уровень гомологии полипротеина-предшественника GnGc GSRV c GAV составляет 82%. L-сегмент буньявирусов кодирует вирусный фермент РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp). У вирусов рода Phlebovirus длина L-сегмента составляет около 6500 н. о. В настоящей работе установлены нуклеотидные последовательности трех фрагментов L-сегмента GSRV общей длиной около 4000 н. о. Гомология RdRp GSRV с клещевыми флебовирусами составляет 70-87,5%. Максимальный (87,5%) уровень гомологии по RdRp так же, как и по другим вирусным белкам, GSRV имеет с GAV Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения RdRp и полипротеина- предшественника GnGc, представлены на рис. 2 и 3 соответственно. Близкое расположение GSRV и GAV в группе клещевых флебовирусов сохраняется и совпадает с данными, полученными по всем трем сегментам генома. GSRV и GAV входят в группу UUKV, объединяющую большинство клещевых флебовирусов [13]. Вирусы, входящие в группу UUKV, обладают определенной экологической пластичностью, некоторые из них (например, ZTV) могут передаваться как клещами (аргасовыми (Argasidae) и иксодовыми (Ixodidae)), так и комарами. Вторая ветвь клещевых флебовирусов (серо- группы BHAV) и тяжелой лихорадки с тромбоцитарным синдромом (SFTSF и вирус Heartland) связаны только с иксодовыми клещами [14-17]. GSRV обладает высокой гомологией (94% по белку нуклеокапсида, 87,5% по RdRp и 82% по оболочеч- ным белкам GnGc) с GAV. Девять штаммов GAV были изолированы из пула 97 особей аргасовых клещей Argas reflexus Fabricius, 1794 (Argasidae), собранных в феврале 1966 г. в голубятне в районе Гажрон в г. Арль в дельте р. Роны (Камарг, Франция) (43° с. ш., 04° в. д.) [8]. Таким образом, филогенетическая близость и идентичные экологические особенности GSRV и GAV позволяют сделать вывод о том, что GSRV является среднеазиатским вариантом GAV. Независимо от географии распространения GSRV и GAV занимают узкую экологическую нишу, связанную с клещами A. reflexus и птицами (вероятно, преимущественно голубиными Columbidae). Репродукция GSRV в аргасовых клещах A. reflexus экспериментально доказана при титрах 2 lg (LD50)/20 мкл в течение 30 сут. Установлены трансстадийная и трансовариальная передача, возможность трансмиссивной передачи GSRV при кровососании на домашних и си- нантропных птицах. При экспериментальной инфекции малых горлиц Streptopelia senegalensis Linnaeus, 1766 (Columbidae) GSRV выделяли из крови птиц на 5, 9, 22 и 30-е сутки в титрах 1,5-2,5 lg (LD50)/20 мкл. Антитела к GSRV у населения обнаружены в 4,5%, у голубей Columba livia Gmelin, 1789 - в 2 % [18]. Аргасовые клещи A. reflexus распространены в некоторых западных провинциях Палеарктики. Ареал ограничивается с севера 51° с. ш. (в Западной Европе), с юга - 31°с. ш. (в Северной Африке) [18]. Цикл метаморфоза A. reflexus составляет около трех лет. Клещи заселяют привычные местообитания голубей, где гнездятся и другие виды птиц - ласточки, стрижи. Вне антропогенных ландшафтов A. reflexus обнаружен в многолетних скальных гнездовьях птиц. Личинки A. reflexus найдены в Европе на горной ласточке Ptyonoprogne rupestris Scopoli, 1769, в Египте - на домовом сыче Athene noctua Scopoli, 1769, в Израиле - на сизом голубе Columba livia Gmelin, 1789 и щетинистой вороне Corvus rhipidu- rus Hartert, 1918, в Крыму - на галке Corvus monedula Linnaeus, 1758. Описаны массовые синантропные поселения клещей, препятствующие разведению голубей. В ночное время клещи могут спускаться в жилые помещения и присасываться к людям [19]. Работу по зондированию территорий Средней Азии проводили в рамках программы по биобезопасности и изучения биоразнообразия в разных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных ГКВ РФ [20-24].

References

Supplementary files