Молекулярная характеристика вируса Гиссар (GSRV - Gissar virus) (Bunyaviridae, Phlebovirus, группа Укуниеми), изолированного из клещей Argas reflexus Fabricius, 1794 (Argasidae), собранных в голубятне на территории Таджикистана

Полный текст

Два штамма вируса Гиссар (Gissar virus - GSRV) изолированы в 1982 г. от аргасовых клещей Argas reflexus, Fabricius, 1794 (так называемых голубиных клещей), собранных в августе 1982 г. в голубятне над жилым помещением в пос. Гиссар в окрестностях г. Душанбе, Таджикистан (38°40’ с. ш., 68°40’ в. д.) [1, 2]. По данным электронной микроскопии GSRV отнесен к семейству Bunyaviridae, однако его классификация до рода оказалась невозможной вследствие отсутствия антигенных связей с известными буньявирусами [3]. Семейство Bunyaviridae объединяет четыре рода обо- лочечных вирусов животных (Orthobunyavirus, Phlebovirus, Hantavirus и Nairovirus) и один род вирусов растений (Tospovirus). Геном буньявирусов представлен тремя сегментами РНК отрицательной (или амбивалентной) полярности (L-, M- и S -сегмент). В основном (за исключением вирусов рода Hantavirus), буньявирусы животных являются арбовирусами, т. е. заражение позвоночных животных происходит при укусе членистоногого переносчика (клещи или комары). Около 20 бу- ньявирусов, включая GSRV, в настоящее время входят в группу неклассифицированных [4, 5]. В настоящей работе методом полногеномного сек- венирования (next-generation sequencing, платформа Illu- mina) определена практически полная последовательность генома GSRV, что позволило провести филогенетический анализ и установить его таксономическое положение. На основании проведенного молекулярно-генетического и филогенетического анализа GSRV классифицирован как среднеазиатский вариант вируса Гранд Арбо (Grand Ar- baud virus - GAV) группы Уукуниеми (Uukuniemi) рода Phlebovirus (Bunyaviridae). Материалы и методы Прототипный штамм GSRV 5995 был получен из Государственной коллекции вирусов (ГКВ) РФ при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4 сут) мышей забивали в соответствии с правилами этичного содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 700 мкл лизирующего буфера RLT (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделяли набором «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) из 350 мкл буфера в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориме- тра Qubit (Invitrogen, США). Рис. 1. Результаты филогенетического анализа, проведенного методом ближайшего соседа для полномеразных аминокислотных последовательностей белка нуклеокапсида N (S-сегмент) семейства Bunyaviridae. GSRV обозначен черным треугольником. Справа указана принадлежность вирусов рода Plebovirus к экологическим группам в зависимости от членистоного переносчика. Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле- ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплецирован- ной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illumina, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIA- GEN, Германия). Измерение молярности полученных библиотек проводили методом ПЦР в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек осуществляли на приборе MiSeq (Illu- mina, США) с использованием набора «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили, используя программу «CLC Genomics Workbench 5.5» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей осуществляли с применением сервиса BLASTX (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW [6]. Генетическую дистанцию определяли по модели p-distance с попарным удалением гэпов. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с помощью программы MEGA5 по методу ближайшего соседа (neighbor joining) с 1000-кратным бутстреп- тестированием [7]. Результаты и обсуждение В результате обработки и первичного анализа данных полногеномного секвенирования генома GSRV определили протяженные нуклеотидные последовательности, обладающие гомологией с вирусами рода Phlebovirus (сем. Bunyaviridae). Результаты дальнейшего анализа показали, что определена полная нуклеотидная последовательность S-сегмента GSRV, тогда как последовательности сегментов M и L определены частично. Общая длина определенной последовательности составляет более 80% генома GSRV. Структура и размер S-сегмента GSRV является характерной для вирусов рода Phlebovirus. Длина S-сегмента составляет более 1700 н. о. S-сегмент кодирует два белка, которые расположены в двух открытых рамках считывания (ОРС) противоположной направленности (амби- сенс стратегия). ОРС структурного белка нуклеокапсида (N) кодируется в ориентации, комплементарной геномной РНК. Филогенетически вирусы рода Phlebovirus можно разделить на три главные ветви, две из которых представлены вирусами, передающимися клещами (клещевые флебовирусы), и одна - вирусами, передающимися комарами (вирусы москитных лихорадок) (рис. 1). Значение в патологии человека играют вирусы москитных лихорадок, из которых не менее 14 вызывают лихорадочные заболевания. Белок N GSRV обладает от 55 до 94% гомологии с вирусами группы Уукуниеми (Uukuniemi - UUKV) и 37-39% с москитными флебовирусами. Наибольший (94%) уровень гомологии GSRV достигает с GAV, который так же, как и GSRV, изолирован из клещей A reflexus Fabricius, 1794 из голубятни во Франции [8]. Второй белок, который кодирует S-сегмент, является неструктурным (NSs), его функция до конца не изучена. Предположительно NSs играет роль в подавлении системы врожденного иммунитета, блокируя продукцию интерферонов при инфекции [9, 10]. Гомология NSs GSRV с gAv составляет 74%. C другими вирусами группы Укуниеми гомология NSs GSRV составляет от 26% (вирус Манава - MAWV) до 50% (вирус Залив Терпения - ZTV). Результаты филогенетического анализа буньявирусов животных, проведенного на основе полноразмерного S-сегмента, представлены на рис. 1. На дендрограмме GSRV входит в группу клещевых флебовирусов (UUKV), группируясь вместе с GAV. Рис. 2. Результаты филогенетического анализа, проведенного методом ближайшего соседа для полномеразных аминокислотных последовательностей полипротеина- предшественника оболочечных белков GnGc (М-сегмент) вирусов семейства Bunyaviridae. Рис. 3. Результаты филогенетического анализа, проведенного методом ближайшего соседа для полномеразных аминокислотных последовательностей РНК-зависимой РНК- полимеразы вирусов семейства Bunyaviridae. Структурные, поверхностные гликопротеины (Gn и Gc), несущие основные антигенные детерминанты буньявирусов, кодируются M-сегментом, при этом его структура у клещевых и москитных флебовирусов отличается. Белки Gn и Gc транслируются в виде полипротеина-предшественника GnGc, который подвергается сложному процессингу с участием клеточных ферментов [4, 11]. У москитных флебовирусов в результате процессинга образуется дополнительный неструктурный белок NSm, который так же, как и NSs, участвует в блокировании системы апоптоза и, таким образом, связан с патогенностью вируса для позвоночных хозяев [4, 12]. Клещевые флебовирусы (группы UUKV и Бханджа - BHAV) белок NSm не кодируют. Длина S-сегмента клещевых флебовирусов составляет около 3200 н. о., а размер кодируемого полипротеина-предшественника GnGc - 1008 а. о. (UUKV). Мы определили практически полную последовательность кодирующей области M-сегмента GSRV Уровень гомологии полипротеина-предшественника GnGc GSRV c GAV составляет 82%. L-сегмент буньявирусов кодирует вирусный фермент РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp). У вирусов рода Phlebovirus длина L-сегмента составляет около 6500 н. о. В настоящей работе установлены нуклеотидные последовательности трех фрагментов L-сегмента GSRV общей длиной около 4000 н. о. Гомология RdRp GSRV с клещевыми флебовирусами составляет 70-87,5%. Максимальный (87,5%) уровень гомологии по RdRp так же, как и по другим вирусным белкам, GSRV имеет с GAV Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения RdRp и полипротеина- предшественника GnGc, представлены на рис. 2 и 3 соответственно. Близкое расположение GSRV и GAV в группе клещевых флебовирусов сохраняется и совпадает с данными, полученными по всем трем сегментам генома. GSRV и GAV входят в группу UUKV, объединяющую большинство клещевых флебовирусов [13]. Вирусы, входящие в группу UUKV, обладают определенной экологической пластичностью, некоторые из них (например, ZTV) могут передаваться как клещами (аргасовыми (Argasidae) и иксодовыми (Ixodidae)), так и комарами. Вторая ветвь клещевых флебовирусов (серо- группы BHAV) и тяжелой лихорадки с тромбоцитарным синдромом (SFTSF и вирус Heartland) связаны только с иксодовыми клещами [14-17]. GSRV обладает высокой гомологией (94% по белку нуклеокапсида, 87,5% по RdRp и 82% по оболочеч- ным белкам GnGc) с GAV. Девять штаммов GAV были изолированы из пула 97 особей аргасовых клещей Argas reflexus Fabricius, 1794 (Argasidae), собранных в феврале 1966 г. в голубятне в районе Гажрон в г. Арль в дельте р. Роны (Камарг, Франция) (43° с. ш., 04° в. д.) [8]. Таким образом, филогенетическая близость и идентичные экологические особенности GSRV и GAV позволяют сделать вывод о том, что GSRV является среднеазиатским вариантом GAV. Независимо от географии распространения GSRV и GAV занимают узкую экологическую нишу, связанную с клещами A. reflexus и птицами (вероятно, преимущественно голубиными Columbidae). Репродукция GSRV в аргасовых клещах A. reflexus экспериментально доказана при титрах 2 lg (LD50)/20 мкл в течение 30 сут. Установлены трансстадийная и трансовариальная передача, возможность трансмиссивной передачи GSRV при кровососании на домашних и си- нантропных птицах. При экспериментальной инфекции малых горлиц Streptopelia senegalensis Linnaeus, 1766 (Columbidae) GSRV выделяли из крови птиц на 5, 9, 22 и 30-е сутки в титрах 1,5-2,5 lg (LD50)/20 мкл. Антитела к GSRV у населения обнаружены в 4,5%, у голубей Columba livia Gmelin, 1789 - в 2 % [18]. Аргасовые клещи A. reflexus распространены в некоторых западных провинциях Палеарктики. Ареал ограничивается с севера 51° с. ш. (в Западной Европе), с юга - 31°с. ш. (в Северной Африке) [18]. Цикл метаморфоза A. reflexus составляет около трех лет. Клещи заселяют привычные местообитания голубей, где гнездятся и другие виды птиц - ласточки, стрижи. Вне антропогенных ландшафтов A. reflexus обнаружен в многолетних скальных гнездовьях птиц. Личинки A. reflexus найдены в Европе на горной ласточке Ptyonoprogne rupestris Scopoli, 1769, в Египте - на домовом сыче Athene noctua Scopoli, 1769, в Израиле - на сизом голубе Columba livia Gmelin, 1789 и щетинистой вороне Corvus rhipidu- rus Hartert, 1918, в Крыму - на галке Corvus monedula Linnaeus, 1758. Описаны массовые синантропные поселения клещей, препятствующие разведению голубей. В ночное время клещи могут спускаться в жилые помещения и присасываться к людям [19]. Работу по зондированию территорий Средней Азии проводили в рамках программы по биобезопасности и изучения биоразнообразия в разных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных ГКВ РФ [20-24].

Список литературы

Дополнительные файлы