Activity of the inositolcontaining phospholipid dimer analogues against human immunodeficiency virus

Full Text

За последние годы осуществлен огромный прорыв в исследовании вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и поиске антиретровирусных средств [1-3]. Однако, несмотря на достаточно успешное применение десятков химиопрепаратов, проблема лечения ВИЧ-инфекции остается по-прежнему актуальной. Быстровозникающая лекарственная устойчивость требует постоянного обновления арсенала средств [4-7]. В последнее время активно исследуются противовирусные свойства полианионных соединений различной природы, способных препятствовать проникновению вируса в клетки [8-10]. В качестве потенциальных ингибиторов вирусной адсорбции мы предложили димерные аналоги инозитсодержащих фосфолипидов. Подобная структура этих веществ позволяет варьировать количество, тип и взаиморасположение отрицательно заряженных групп в кольцах мио-инозита, что может модулировать противовирусную активность данных соединений [11, 12]. Цель настоящей работы - изучение активности ряда димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов в отношении ВИЧ 1-го типа (ВИЧ-1). Материалы и методы Клетки. В работе использовали перевиваемые лим-фобластоидные клетки человека МТ-4, полученные из коллекции культур клеток человека ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (производства ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН) с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН), 5 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина ("Pharmachim". Болгария) в виде суспензии в атмосфере, содержащей 5% CO2 при 98% влажности при 37°C. Вирусы. В качестве источника ВИЧ использовали штамм ВИЧ-1899А из коллекции штаммов ВИЧ ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России. Препараты. Исследовали 9 димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов (табл. 1), синтезированных авторами [11, 12]. В качестве антиретровирусного референс-препарата использовали препарат ретровир (азидотимидин) ("Gal-axoSmithClein", Бельгия). Исследование цитотоксического действия препаратов проводили на модели лимфобластоидных клеток в пластиковой 24-луночной панели ("Costar", США). К клеткам добавляли исследуемый препарат в разной концентрации. Клетки инкубировали при 37°C в атмосфере с 5% CO2 при 98% влажности несколько дней до момента учета результатов. Исследование противовирусной активности препаратов в отношении ВИЧ проводили на модели лимфобла-стоидных клеток в пластиковой 24-луночной панели. К клеткам добавляли исследуемый препарат и инфицировали ВИЧ в дозе 0,01 ТЦИД50/клетка. Соединения 1-9 вносили за 1 ч до заражения клеток. Культуры клеток инкубировали при 37°C в атмосфере с 5% CO2 при 98% влажности 5-7 дней. Репродукцию ВИЧ изучали с помощью оценки вирусиндуцированного цитопатического действия в культурах клеток. Учет результатов проводили окрашиванием клеток с помощью 0,4% красителя трипанового синего и световой микроскопии, а также окрашиванием клеток с помощью тетразолиевого красителя (метод МТТ) со спек-трофотометрией. Методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих иммуноферментных наборов фирмы "Bio-Rad" (Франция) определяли вирусный антиген p24 в культуральной жидкости согласно инструкции изготовителя и учитывали с помощью фотометра “Multiscan” при длине волны 492 нм. Степень защиты клеток от цитодеструктивного действия ВИЧ определяли по формуле: А - В % защиты =-• 100%, ^ К - В где A - количество жизнеспособных клеток в опытной группе; B - то же в инфицированной культуре (контроль ВИЧ); K - то же в неинфицированной культуре (контроль клеток). Исследование противовирусной активности соединений на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1. По оси абсцисс - концентрация (в мкг/мл) препарата; по оси ординат -защита (в %). 35 Таблица 1 Структуры соединений 1 -9 Соединение Заместители Соединение Заместители Результаты и обсуждение Введение в культуральную среду неинфицированных клеток димерных аналогов инозитсодержащих фосфолипидов в концентрации 5 мкг/мл вызывало относительно небольшое (на 8,6-11,2%) снижение жизнеспособности клеток у препаратов 1, 2, 4-9 (табл. 2). Увеличение дозы соединений до 50 мкг/мл уменьшало жизнеспособность клеток на 9,7-15,5%. Наибольшую цитотоксичность отметили у соединения 3 - 11,6 и 21,8% при 5 и 50 мкг/мл соответственно. При исследовании противовирусных свойств данных соединений в отношении ВИЧ-1 обнаружили, что при внесении в культуральную жидкость незараженных клеток за 1 ч до инфицирования все препараты, за исключением соединения 4, проявили активность (см. табл. 2, рисунок). Однако при этом только у трех из них отметили ингибирование образования вирусиндуцированных синцитиев (соединения 2, 5 и 6). Наибольшей активностью обладал димерный полиол-5, 50% эффективная концентрация (ЭК50) которого составила 3,9 мкг/мл. При дозе 10 мкг/мл отметили отсутствие синцитиев. Соединения 2 и 6 обладали ЭК50 16,1 и 17,5 мкг/мл соответственно. В этой же концентрации для данных трех соединений наблю- 36 Таблица 2 Исследование цитотоксичности и противовирусных свойств соединений 1-9 Концен трация, мкг/мл Токсич Вирусная инфекция Соедине ние ность - жиз-неспособность, % жизнеспо собность, % защита, % синцитии, +/- 1 50 85,7 57,8 8,2 + 25 87,5 64,7 24,1 + 10 87,8 62,9 20,1 + 5 88,8 62,7 20,1 + 2 50 84,5 89,6 81,1 - 25 87,3 89,7 81,4 - 10 88,7 65,4 25,9 + 5 89,9 64,4 23,4 + 3 50 78,2 64,1 22,8 + 25 79,4 63,1 20,3 + 10 87,3 62,1 18,1 + 5 88,4 61,6 17,2 + 4 50 85,4 54,6 1,0 + 25 89,1 56,4 5,2 + 10 89,6 57,1 6,8 + 5 91,1 59,3 11,8 + 5 50 87,6 89,3 80,4 - 25 88,5 96,9 97,9 - 10 89,1 77,6 53,7 - 5 90,6 69,5 35,1 + 6 50 87,5 91,1 84,5 - 25 88,7 97,7 99,5 - 10 90,3 59,6 12,1 + 5 91,4 60,6 14,8 + 7 50 87,4 61,7 17,2 + 25 87,5 62,4 18,9 + 10 87,7 62,4 18,9 + 5 88,4 62,1 18,2 + 8 50 87,1 67,7 30,9 + 25 87,2 62,1 18,2 + 10 87,9 60,1 13,4 + 5 89,4 60,1 13,1 + 9 50 90,3 61,2 16,2 + 25 90,5 67,5 30,7 + 10 90,8 65,1 24,7 + 5 91,1 59,1 11,3 + Контроль клеток 97,9 - - - Контроль вируса - 32,6 - + дали также снижение уровня вирусного антигена p24. Активность этих соединений может быть обусловлена взаиморасположением в их структуре гидрофобных и гидрофильных фрагментов, необходимых для эффективного вмешательства в процесс вирусной адсорбции, а увеличение полярности при удалении бензоильных групп соединения 6 может быть причиной снижения активности димера 2. Обнаруженные результаты позволяют предположить влияние соединений 2, 5 и 6 на ранние этапы репродукции ВИЧ: стадию адсорбции ВИЧ на клетке и его проникновение в цитоплазму. Эффективные концентрации полученных соединений превышают таковую для первого антиретровирусного препарата ретровира, активность которого проявляется уже при дозах от 0,1 мкг/мл. Однако интересна принципиальная возможность получения новых нетоксичных соединений, нацеленных на блокирование других этапов цикла репродукции ВИЧ-1. Поэтому разработка новых полианионных соединений, способных вмешиваться в ранние стадии репликативного цикла ВИЧ, представляет собой перспективное дополнение антиретровирусной терапии, основу которой составляют ингибиторы вирусных ферментов. Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки России, соглашение 14.B37.21.1925.

References

Supplementary files