Genetic characterization of the Syr-Darya valley fever virus (SDVFV) (Picornaviridae, Cardiovirus) isolated from the blood of the patients and ticks Hyalomma as. asiaticum (Hyalomminae), Dermacentor daghestanicus (Rhipicephalinae) (Ixodidae) and Ornithodoros coniceps (Argasidae) in Kazakhstan and Turkmenistan

Full Text

По состоянию на 2012 г. в состав рода Cardiovirus (Picornaviridae) включены вирусы энцефаломиокардита (EMCV - encephalomyocarditis virus) и тейловирус (ThV - theilovirus). EMCV состоит из двух типов: EMCV-1 и EMCV-2. ThV включает в качестве вариантов теравирус (TRV - theravirus), 9 типов вируса Саффолд (SAFV - Saf- fold virus), вирус Тейлера мышей (TMEV - Theiler’s murine encephalomyelitis virus) и вирус вилюйского энцефаломиелита человека (VHEV - Vilyuisk human encephalomyelitis virus) [1-6]. Вирус лихорадки долины Сырдарьи (SDVFV - Syr- Darya valley fever virus) выделен в июле 1973 г. в Сырда- рьинском районе Кзыл-Ординской области в Казахстане из крови лихорадящего больного [7-9], а также от клещей Hyalomma as. asiaticum Schulze et Schlottke, 1929 (Hyalomminae) (1 штамм) и Dermacentor daghestanicus Olenev, 1929 (Rhipicephalinae) (7 штаммов), собранных в пойме рек Сырдарья и Или при зараженности клещей 0,5% [10-13]. Вирус был также изолирован из клещей Ornithodoros capensis Neumann, 1901 (Argasidae), собранных в 1973 г. в гнездовье чайковых птиц (Laridae Vigors, 1825 и Sternidae Bonaparte, 1838) на островах залива Кара-Богаз-Гол в Туркмении [14-16]. По данным электронной микроскопии и выявленных в РСК антигенных связях с вирусами энцефаломиокардита и Сихотэ-Алинь (SAV - Sikhote-Alin) SDVFV отнесен к роду Cardiovirus сем. Picornaviridae [8, 9, 17]. Антиген- но родственный SAV выделен от клещей Ixodes persul- catus Schulze, 1930 (Ixodinae), собранных в июле 1970 г. с дикого кабана Sus scrofa Linnaeus, 1758 в предгорьях хребта Сихотэ-Алинь в Красноармейском районе Приморского края [18, 19]. В настоящей работе геном SDVFV был секвенирован с использованием технологии полногеномного секвенирования (next-generation sequencing). На основании проведенного молекулярно-генетического анализа показано, что SDVFV является вариантом ThV и филогенетически близок к VHEV, который также способен вызывать лихорадочное заболевание у людей. Материалы и методы Прототипные штаммы вирусов лихорадки долины Сырдарьи (LEIV-Tur2833) и Сихотэ-Алинь (Prm113) получены из Государственной коллекции вирусов (ГКВ) РФ при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4 сут) мышей забивали в соответствии с правилами этичного содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 700 мкл лизирующего буфера RLT (QIA- GEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделена набором «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) из 350 мкл буфера в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориме- тра Qubit (Invitrogen, США). Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле- ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплецирован- ной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с помощью набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Il- lumina, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом ПЦР в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000), согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирова- ние ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (Illu- mina, США) с использованием набора «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли, используя программу «CLC Genomics Workbench 5.5» (CLC bio, США). |"Т|УР4| VP3 | VP2 | VP1 |2A|2B| 2C | ЗА | 3C | 3D 0,7 ------- ! f-I !-I---------- •---- 1-1 1 r 1 1 I-I 1----------------------- !------------ !-I--- •--------- 1-I !-- * 1-------- •---- 1-1--- |-l--- ! ’-I 1 1-1 1------------- 1---- 1-1--- 1- •---- 1-1-- 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 Position 1,0 0,98 0,96 0,94 0,92 0,9 ^ 0,88 1 o.se 'e 0,84 00 0,82 0,8 0,78 0,76 0,74 0,72 Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью сервиса BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» ----------------- Theilovirus Vilyuisk enceph. virus Window: 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Kimura (2-parameter), ТЛ: 2,0 Рис. 1. Гомология аминокислотной последовательности полипротеина- предшественника SDVFV LEIV-Tur2833 с ThV и VHEV По вертикали - значения гомологии (similarity) для каждой позиции полипротеина (по горизонтали). Сверху указана схема полипротеина. Данные получены с использованием программы SlimPlot 3.5.1 (http://sray.med.som.jhmi.edu/SCRoftware/simplot). (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Генетическую дистанцию определяли по модели p-distance с попарным удалением гэпов. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли с применением программы MEGA5 по методу максимального правдоподобия (maximum likelihood) с 1000-кратным бутстреп- тестированием. Результаты и обсуждени В результате обработки данных полногеномного секве- нирования определили полную последовательность генома SDVFV (штамм LEIV-Tur2833) (GenBank ID: KJ191558). Геном вирусов сем. Picornaviridae представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности (длина 7-8,8 тыс. н. о.), которая имеет одну протяженную открытую рамку считывания. 5’-конец РНК не кэпирован, но ковалентно связан с вирусным белком VPg. Трансляция вирусных белков происходит в виде полипротеина-предшественника (Р0), который в результате многоступенчатого процессинга с участием клеточных и вирусных протеаз нарезается на отдельные структурные (область P1) и неструктурные (области P2, P3) протеины [1]. Общая длина кодирующей области SDVFV составила 6912 н. о. (2303 а. о.). При первоначальном анализе полученной последовательности установлено, что наибольшей гомологией SDVFV обладает с различными вариантами ThV (род Cardiovirus), включая VHEV, который изолирован из аутопсийного материала погибших при вспышке энцефаломиелита в Якутии (вилюйский энцефалит) [3]. При анализе полноразмерных последовательностей полипротеина кардиовирусов выявили, что SDVFV обладает 85 и 95% гомологией с TMEV на нуклеотидном и аминокислотном уровне соответственно. Суммарный уровень гомологии полной нуклеотидной последовательности SDVFV с VHEV составляет 83%, а аминокислотной - 91%. Гомологи SDVFV c различными вариантами EMCV не превышает 55%. Для анализа вариабельности различных областей полипротеина SDVFV, VHEV и ThV использовали программу SlimPlot 3.5.1 (http://sray.med.som.jhmi.edu/ SCRoftware/simplot) (рис. 1). Как видно на рис. 1, область полипротеина Р1, соответствующая структурным белкам (VP1-VP4), более дивергентна, чем области Р2 и Р3, кодирующие неструктурные белки (2A-2C и 3А-3D). На некоторых участках Р1 дивергенция между SDVFV, TMEV и VHEV достигает 10 и 30% соответственно, что объясняет их антигенные различия. Совокупные значения гомологии SDVFV с VHEV и TMEV, определенные для области Р1, на нуклеотидном уровне составляют 75 и 91%, тогда как для аминокислотной последовательности - 93 и 80% соответственно. Гомология VHEV с TMEV по Р1 также составляет 80%. Дендрограмма, построенная на основе сравнения Р1 области полипротеина методом ближайшего соседа, представлена на рис. 2, а. Филогенетически SDVFV группируется на одной ветви с TMEV и VHEV. Область Р2 кодирует вирусные ферменты протеазу (2А), хеликазу (2С) и интегральных мембранных белка (ИМБ 2В). Гомология аминокислотной последовательности данного участка SDVFV с TMEV и VHEV составляет 97 и 98% соответственно. Для области Р3 (включает вирусную протеазу 3С, РНК-зависимую РНК- полимеразу 3D, белок VPg и ИМБ 3А) значения гомологии составили, в среднем 96%. При этом уровень дивергенции между VHEV и TMEV также не превышает 5%. Результаты филогенетического анализа, проведенного для областей Р2 и Р3, представлены на рис. 2, б и 2, в соответственно. По своей вирулентности SDVFV занимает промежуточное положение между наиболее вирулентным EMCV и наименее вирулентным SAV, вызывая заболевания у взрослых мышей и сирийских хомячков [17]. Вирус обнаруживают после заражения белых мышей при всех путях заражения в мозгу, легких, печени, селезенке, почках, в крови с 48 до 168 ч после заражения (срок наблюдения) [17]. При подкожном заражении зеленых мартышек возникало клинически легкое заболевание, но при патолого-анатомическом исследовании отмечено явление менингоэнцефалита с преимущественным вовлечением в процесс подкорковых структур головного мозга, мозжечка, мелкоочаговой пневмонии, гепатита и инфекционной селезенки [8, 17]. Иммунная прослойка к SDVFV среди населения, проживающего в пустынной ландшафтной зоне, колеблется от 1 до 3,5%, в степной - 0,5%, горном ландшафте - 0%. Иммунная прослойка к SDVFV среди домашних животных в пойменных ландшафтах рек Сырдарья, Или, Эмба и Талас достигает 11-16%, тогда как в степной и горной зонах Казахстана обнаружены лишь единичные находки антител. Эти данные свидетельствуют о приуроченности природных очагов в Казахстане к пойменным пастбищным биоценозам пустынной ландшафтной зоны [8, 9, 11-13]. Рис. 2. Филогенетическое положение SDV в составе рода Cardiovirus, определенное по различным регионам полипротеина-предшественника: а - по области структурных белков P1 (включает белки VP1-VP4); б - по региону P2 (включает белки 2А, 2B, 2С); в - по региону Р3 (включает белки 3А, 3B, 3C и 3D). Принципиально иная экологическая ситуация в природных очагах обнаружена в западной части ареала в Туркменистане, где циркуляция SDVFV связана с гнездовьями колониальных морских птиц и аргасовы- ми клещами [14-16]. Все заболевшие лихорадкой долины Сырдарьи указывают в анамнезе присасывание клещей за 5-7 сут до начала болезни. Начало заболевания острое, с лихорадкой с температурой до 40°C, обильной полиморфной розеолезно-петехиальной сыпью на 3-4-е сутки болезни (с локализацией на конечностях, груди, животе), ознобом, слабостью и благоприятным исходом. Длительность заболевания около 10-14 сут [7-9]. Зондирование территории Казахстана и Средней Азии проводили в рамках программы по биобезопасности и изучения биоразнообразия в разных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных ГКВ РФ [12, 20-22].

References

Supplementary files