Генетическая характеристика вируса лихорадки долины Сырдарьи (SDVFV - Syr-Darya valley fever virus) (Picornaviridae, Cardiovirus), изолированного от человека и клещей Hyalomma as.asiaticum (Hyalomminae), Dermacentor daghestanicus (Rhipicephalinae) (Ixodidae) и Ornithodoros coniceps (Argasidae) в Казахстане и Туркмении


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Вирус лихорадки долины Сырдарьи (SDVFV - Syr-Darya valley fever virus) выделен в июле 1973 г. в Сырдарьинском районе Кзыл-Ординской области в Казахстане из крови лихорадящего больного и на основании электронной микроскопии и антигенных связей, отнесен к роду Cardiovirus (Picornaviridae). SDVFV также изолировали из клещей Hyalomma as. asiaticum Schulze et Schlottke, 1929 (Hyalomminae) (1 штамм) и Dermacentor daghestanicus Olenev, 1929 (Rhipicephalinae) (7 штаммов), собранных в пойме рек Сырдарья и или при зараженности клещей 0,5%. в настоящей работе методом полногеномного секвенирования (next-generation sequencing) определена полная нуклеотидная последовательность генома SDVFV (штамм LEIV-Tur2833) (GenBank ID: KJ191558). Установлено, что филогенетически SDVFV наиболее близок к вирусам Тейлера мышей (TMEV) и вилюйского энцефаломиелита человека (VHEV). Уровень гомологии генома SDVFV с VHEV и TMEV, определенный для области Р1 (структурные белки), на нуклеотидном уровне составляет 75 и 91%, а на аминокислотном - 80 и 93% соответственно. Гомология SDVFV с TMEV и VHEV по регионам Р2 и Р3, кодирующим неструктурные белки, достигает 96-98%.

Полный текст

По состоянию на 2012 г. в состав рода Cardiovirus (Picornaviridae) включены вирусы энцефаломиокардита (EMCV - encephalomyocarditis virus) и тейловирус (ThV - theilovirus). EMCV состоит из двух типов: EMCV-1 и EMCV-2. ThV включает в качестве вариантов теравирус (TRV - theravirus), 9 типов вируса Саффолд (SAFV - Saf- fold virus), вирус Тейлера мышей (TMEV - Theiler’s murine encephalomyelitis virus) и вирус вилюйского энцефаломиелита человека (VHEV - Vilyuisk human encephalomyelitis virus) [1-6]. Вирус лихорадки долины Сырдарьи (SDVFV - Syr- Darya valley fever virus) выделен в июле 1973 г. в Сырда- рьинском районе Кзыл-Ординской области в Казахстане из крови лихорадящего больного [7-9], а также от клещей Hyalomma as. asiaticum Schulze et Schlottke, 1929 (Hyalomminae) (1 штамм) и Dermacentor daghestanicus Olenev, 1929 (Rhipicephalinae) (7 штаммов), собранных в пойме рек Сырдарья и Или при зараженности клещей 0,5% [10-13]. Вирус был также изолирован из клещей Ornithodoros capensis Neumann, 1901 (Argasidae), собранных в 1973 г. в гнездовье чайковых птиц (Laridae Vigors, 1825 и Sternidae Bonaparte, 1838) на островах залива Кара-Богаз-Гол в Туркмении [14-16]. По данным электронной микроскопии и выявленных в РСК антигенных связях с вирусами энцефаломиокардита и Сихотэ-Алинь (SAV - Sikhote-Alin) SDVFV отнесен к роду Cardiovirus сем. Picornaviridae [8, 9, 17]. Антиген- но родственный SAV выделен от клещей Ixodes persul- catus Schulze, 1930 (Ixodinae), собранных в июле 1970 г. с дикого кабана Sus scrofa Linnaeus, 1758 в предгорьях хребта Сихотэ-Алинь в Красноармейском районе Приморского края [18, 19]. В настоящей работе геном SDVFV был секвенирован с использованием технологии полногеномного секвенирования (next-generation sequencing). На основании проведенного молекулярно-генетического анализа показано, что SDVFV является вариантом ThV и филогенетически близок к VHEV, который также способен вызывать лихорадочное заболевание у людей. Материалы и методы Прототипные штаммы вирусов лихорадки долины Сырдарьи (LEIV-Tur2833) и Сихотэ-Алинь (Prm113) получены из Государственной коллекции вирусов (ГКВ) РФ при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4 сут) мышей забивали в соответствии с правилами этичного содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 700 мкл лизирующего буфера RLT (QIA- GEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделена набором «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) из 350 мкл буфера в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориме- тра Qubit (Invitrogen, США). Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле- ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплецирован- ной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с помощью набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Il- lumina, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом ПЦР в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000), согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирова- ние ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (Illu- mina, США) с использованием набора «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли, используя программу «CLC Genomics Workbench 5.5» (CLC bio, США). |"Т|УР4| VP3 | VP2 | VP1 |2A|2B| 2C | ЗА | 3C | 3D 0,7 ------- ! f-I !-I---------- •---- 1-1 1 r 1 1 I-I 1----------------------- !------------ !-I--- •--------- 1-I !-- * 1-------- •---- 1-1--- |-l--- ! ’-I 1 1-1 1------------- 1---- 1-1--- 1- •---- 1-1-- 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 Position 1,0 0,98 0,96 0,94 0,92 0,9 ^ 0,88 1 o.se 'e 0,84 00 0,82 0,8 0,78 0,76 0,74 0,72 Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью сервиса BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» ----------------- Theilovirus Vilyuisk enceph. virus Window: 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Kimura (2-parameter), ТЛ: 2,0 Рис. 1. Гомология аминокислотной последовательности полипротеина- предшественника SDVFV LEIV-Tur2833 с ThV и VHEV По вертикали - значения гомологии (similarity) для каждой позиции полипротеина (по горизонтали). Сверху указана схема полипротеина. Данные получены с использованием программы SlimPlot 3.5.1 (http://sray.med.som.jhmi.edu/SCRoftware/simplot). (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Генетическую дистанцию определяли по модели p-distance с попарным удалением гэпов. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли с применением программы MEGA5 по методу максимального правдоподобия (maximum likelihood) с 1000-кратным бутстреп- тестированием. Результаты и обсуждени В результате обработки данных полногеномного секве- нирования определили полную последовательность генома SDVFV (штамм LEIV-Tur2833) (GenBank ID: KJ191558). Геном вирусов сем. Picornaviridae представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности (длина 7-8,8 тыс. н. о.), которая имеет одну протяженную открытую рамку считывания. 5’-конец РНК не кэпирован, но ковалентно связан с вирусным белком VPg. Трансляция вирусных белков происходит в виде полипротеина-предшественника (Р0), который в результате многоступенчатого процессинга с участием клеточных и вирусных протеаз нарезается на отдельные структурные (область P1) и неструктурные (области P2, P3) протеины [1]. Общая длина кодирующей области SDVFV составила 6912 н. о. (2303 а. о.). При первоначальном анализе полученной последовательности установлено, что наибольшей гомологией SDVFV обладает с различными вариантами ThV (род Cardiovirus), включая VHEV, который изолирован из аутопсийного материала погибших при вспышке энцефаломиелита в Якутии (вилюйский энцефалит) [3]. При анализе полноразмерных последовательностей полипротеина кардиовирусов выявили, что SDVFV обладает 85 и 95% гомологией с TMEV на нуклеотидном и аминокислотном уровне соответственно. Суммарный уровень гомологии полной нуклеотидной последовательности SDVFV с VHEV составляет 83%, а аминокислотной - 91%. Гомологи SDVFV c различными вариантами EMCV не превышает 55%. Для анализа вариабельности различных областей полипротеина SDVFV, VHEV и ThV использовали программу SlimPlot 3.5.1 (http://sray.med.som.jhmi.edu/ SCRoftware/simplot) (рис. 1). Как видно на рис. 1, область полипротеина Р1, соответствующая структурным белкам (VP1-VP4), более дивергентна, чем области Р2 и Р3, кодирующие неструктурные белки (2A-2C и 3А-3D). На некоторых участках Р1 дивергенция между SDVFV, TMEV и VHEV достигает 10 и 30% соответственно, что объясняет их антигенные различия. Совокупные значения гомологии SDVFV с VHEV и TMEV, определенные для области Р1, на нуклеотидном уровне составляют 75 и 91%, тогда как для аминокислотной последовательности - 93 и 80% соответственно. Гомология VHEV с TMEV по Р1 также составляет 80%. Дендрограмма, построенная на основе сравнения Р1 области полипротеина методом ближайшего соседа, представлена на рис. 2, а. Филогенетически SDVFV группируется на одной ветви с TMEV и VHEV. Область Р2 кодирует вирусные ферменты протеазу (2А), хеликазу (2С) и интегральных мембранных белка (ИМБ 2В). Гомология аминокислотной последовательности данного участка SDVFV с TMEV и VHEV составляет 97 и 98% соответственно. Для области Р3 (включает вирусную протеазу 3С, РНК-зависимую РНК- полимеразу 3D, белок VPg и ИМБ 3А) значения гомологии составили, в среднем 96%. При этом уровень дивергенции между VHEV и TMEV также не превышает 5%. Результаты филогенетического анализа, проведенного для областей Р2 и Р3, представлены на рис. 2, б и 2, в соответственно. По своей вирулентности SDVFV занимает промежуточное положение между наиболее вирулентным EMCV и наименее вирулентным SAV, вызывая заболевания у взрослых мышей и сирийских хомячков [17]. Вирус обнаруживают после заражения белых мышей при всех путях заражения в мозгу, легких, печени, селезенке, почках, в крови с 48 до 168 ч после заражения (срок наблюдения) [17]. При подкожном заражении зеленых мартышек возникало клинически легкое заболевание, но при патолого-анатомическом исследовании отмечено явление менингоэнцефалита с преимущественным вовлечением в процесс подкорковых структур головного мозга, мозжечка, мелкоочаговой пневмонии, гепатита и инфекционной селезенки [8, 17]. Иммунная прослойка к SDVFV среди населения, проживающего в пустынной ландшафтной зоне, колеблется от 1 до 3,5%, в степной - 0,5%, горном ландшафте - 0%. Иммунная прослойка к SDVFV среди домашних животных в пойменных ландшафтах рек Сырдарья, Или, Эмба и Талас достигает 11-16%, тогда как в степной и горной зонах Казахстана обнаружены лишь единичные находки антител. Эти данные свидетельствуют о приуроченности природных очагов в Казахстане к пойменным пастбищным биоценозам пустынной ландшафтной зоны [8, 9, 11-13]. Рис. 2. Филогенетическое положение SDV в составе рода Cardiovirus, определенное по различным регионам полипротеина-предшественника: а - по области структурных белков P1 (включает белки VP1-VP4); б - по региону P2 (включает белки 2А, 2B, 2С); в - по региону Р3 (включает белки 3А, 3B, 3C и 3D). Принципиально иная экологическая ситуация в природных очагах обнаружена в западной части ареала в Туркменистане, где циркуляция SDVFV связана с гнездовьями колониальных морских птиц и аргасовы- ми клещами [14-16]. Все заболевшие лихорадкой долины Сырдарьи указывают в анамнезе присасывание клещей за 5-7 сут до начала болезни. Начало заболевания острое, с лихорадкой с температурой до 40°C, обильной полиморфной розеолезно-петехиальной сыпью на 3-4-е сутки болезни (с локализацией на конечностях, груди, животе), ознобом, слабостью и благоприятным исходом. Длительность заболевания около 10-14 сут [7-9]. Зондирование территории Казахстана и Средней Азии проводили в рамках программы по биобезопасности и изучения биоразнообразия в разных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных ГКВ РФ [12, 20-22].
×

Список литературы

  1. Knowles N.J., Hovi T., Hyypia T., King A.M.Q., Lindberg A.M., Pallansh M.A. Picornaviridae. In: King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J., eds. Virus taxonomy: 9th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. London: Elsevier; 2012: 855-80.
  2. Philipps A., Dauber M., Groth M., Schirrmeier H., Platzer M., Krumbholz A. et al. Isolation and molecular characterization of a second serotype of the encephalomyocarditis virus. Vet. Microbiol. 2012; 161 (1-2): 49-57.
  3. Liang Z., Kumar A.S., Jones M.S., Knowles N.J., Lipton H.L. Phylogenetic analysis of the species Theilovirus: emerging murine and human pathogens. J. Virol. 2008; 82 (23): 11545-54.
  4. Sun G., Zhang X., Yi M., Shao S., Zhang W. Analysis of the genomic homologous recombination in Theilovirus based on complete genomes. Virol. J. 2011; 8: 439.
  5. Jafari M., Haist V, Baumgartner W., Wagner S., Stein V.M., Tipold A. et al. Impact of Theiler’s virus infection on hippocampal neuronal progenitor cells: differential effects in two mouse strains. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2012; 38 (7): 647-64.
  6. Himeda T., Ohara Y. Saffold virus, a novel human Cardiovirus with unknown pathogenicity. J. Virol. 2012; 86 (3): 1292-6.
  7. Karimov S.K., Lvov D.K., Kiriushchenko T.V. Syr-Darya valley fever, a new virus disease in Kazakhstan. Arch. Virol. 1991; Suppl. 1: 345-8.
  8. Львов Д.К. Лихорадка долины Сыр-Дарьи. В кн.: Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я., ред. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: Медицина; 1989: 246-9.
  9. Львов Д.К. Лихорадка долины Сыр-Дарьи. В кн.: Львов Д.К., ред. Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. М.: МИА; 2013: 409-11.
  10. Каримов С.К., Львов Д.К., Киргощенко Т.В., Дробищенко Н.И., Роговая С.Г. Ареал негруппированного вируса в Казахстане. В кн.: Экология вирусов Казахстана и Средней Азии. Алма-Ата; 1980: 35-8.
  11. Каримов С.К., Львов Д.К., Киргощенко Т.В., Роговая С.Г., Приходько Е.Т., Скворцова Т.М. и др. Выделение негруппированного вируса от иксодовых клещей в южных областях Казахстана. В кн.: Экология вирусов. Баку; 1976: 88-90.
  12. Львов Д.К. Экология вирусов. В кн.: Львов Д.К, ред. Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. М.: МИА; 2013: 66-86.
  13. Львов Д.К., Ильичев В.Д. Миграция птиц и перенос возбудителей инфекции. М.: Наука; 1979.
  14. Lvov D.K. Natural foci of arboviruses in the USSR. In: Zhdanov V.M., ed. Sov. Med. Rev. Virol. UK: Harwood Academ. Publ. GmbH; 1987: 153-96.
  15. Lvov D.K., Avershin A.D., Andreev V.P. Surveillance for arboviruses in the Commonwelth of Independent states: relationships between ecological zones and virus distribution. Arch. Virol. 1991; Suppl. 1: 359-62.
  16. Сидорова Г.А., Андреев В.Л. Некоторые черты экологии новых арбовирусов, выделенных в Узбекистане и Туркмении. В кн.: Львов Д.К., ред. Экология вирусов. М.: АМН СССР; 1980: 108-14.
  17. Каримов С.К. Арбовирусы Казахстанского региона: Дис. д-ра мед. наук. Алма-Ата; 1983.
  18. Lvov D.K., Leonova G.N., Gromashevsky V.L., Shestakov V.L., Gofman Y.P., Skvortsova T.M. et al. Sikhote-Alin virus, a new member of the cardiovirus group (Picornaviridae) isolated from Ixodes persulcatus ticks in Primorie Region. Acta Virol. 1978; 22 (6): 458-63.
  19. Леонова Г.Н. Штамм П-113 вируса Сихотэ-Алинь. Депонент Государственной Коллекции вирусов № ГКВ 620. 1978.
  20. Lvov D.K. Ecological soundings of the former USSR territory for natural foci of arboviruses. In: Sov. Med. Rev. Virol. UK: Harwood Academ. Publ. GmbH; 1993: 1-47.
  21. Львов Д.К., Дерябин П.Г., Аристова В.А., Бутенко А.М., Галкина И.В., Громашевский В.Л. и др. Атлас распространения возбудителей природно-очаговых вирусных инфекций на территории Российской Федерации. М.: Издательство НПЦ ТМГ МЗ РФ; 2001.
  22. Щелканов М.Ю., Громашевский В.Л., Львов Д.К. Роль эколого-вирусологического районирования в прогнозировании влияния климатических изменений на ареалы арбовирусов. Вестник РАМН. 2006; 2: 22-5.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Львов Д.К., Альховский С.В., Щелканов М.Ю., Щетинин А.М., Дерябин П.Г., Гительман А.К., Аристова В.А., Ботиков А.Г., 2014

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах