Генетическая характеристика вируса лихорадки долины Сырдарьи (SDVFV - Syr-Darya valley fever virus) (Picornaviridae, Cardiovirus), изолированного от человека и клещей Hyalomma as.asiaticum (Hyalomminae), Dermacentor daghestanicus (Rhipicephalinae) (Ixodidae) и Ornithodoros coniceps (Argasidae) в Казахстане и Туркмении

Полный текст

По состоянию на 2012 г. в состав рода Cardiovirus (Picornaviridae) включены вирусы энцефаломиокардита (EMCV - encephalomyocarditis virus) и тейловирус (ThV - theilovirus). EMCV состоит из двух типов: EMCV-1 и EMCV-2. ThV включает в качестве вариантов теравирус (TRV - theravirus), 9 типов вируса Саффолд (SAFV - Saf- fold virus), вирус Тейлера мышей (TMEV - Theiler’s murine encephalomyelitis virus) и вирус вилюйского энцефаломиелита человека (VHEV - Vilyuisk human encephalomyelitis virus) [1-6]. Вирус лихорадки долины Сырдарьи (SDVFV - Syr- Darya valley fever virus) выделен в июле 1973 г. в Сырда- рьинском районе Кзыл-Ординской области в Казахстане из крови лихорадящего больного [7-9], а также от клещей Hyalomma as. asiaticum Schulze et Schlottke, 1929 (Hyalomminae) (1 штамм) и Dermacentor daghestanicus Olenev, 1929 (Rhipicephalinae) (7 штаммов), собранных в пойме рек Сырдарья и Или при зараженности клещей 0,5% [10-13]. Вирус был также изолирован из клещей Ornithodoros capensis Neumann, 1901 (Argasidae), собранных в 1973 г. в гнездовье чайковых птиц (Laridae Vigors, 1825 и Sternidae Bonaparte, 1838) на островах залива Кара-Богаз-Гол в Туркмении [14-16]. По данным электронной микроскопии и выявленных в РСК антигенных связях с вирусами энцефаломиокардита и Сихотэ-Алинь (SAV - Sikhote-Alin) SDVFV отнесен к роду Cardiovirus сем. Picornaviridae [8, 9, 17]. Антиген- но родственный SAV выделен от клещей Ixodes persul- catus Schulze, 1930 (Ixodinae), собранных в июле 1970 г. с дикого кабана Sus scrofa Linnaeus, 1758 в предгорьях хребта Сихотэ-Алинь в Красноармейском районе Приморского края [18, 19]. В настоящей работе геном SDVFV был секвенирован с использованием технологии полногеномного секвенирования (next-generation sequencing). На основании проведенного молекулярно-генетического анализа показано, что SDVFV является вариантом ThV и филогенетически близок к VHEV, который также способен вызывать лихорадочное заболевание у людей. Материалы и методы Прототипные штаммы вирусов лихорадки долины Сырдарьи (LEIV-Tur2833) и Сихотэ-Алинь (Prm113) получены из Государственной коллекции вирусов (ГКВ) РФ при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4 сут) мышей забивали в соответствии с правилами этичного содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 700 мкл лизирующего буфера RLT (QIA- GEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделена набором «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) из 350 мкл буфера в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориме- тра Qubit (Invitrogen, США). Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле- ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплецирован- ной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с помощью набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Il- lumina, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом ПЦР в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000), согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирова- ние ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (Illu- mina, США) с использованием набора «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли, используя программу «CLC Genomics Workbench 5.5» (CLC bio, США). |"Т|УР4| VP3 | VP2 | VP1 |2A|2B| 2C | ЗА | 3C | 3D 0,7 ------- ! f-I !-I---------- •---- 1-1 1 r 1 1 I-I 1----------------------- !------------ !-I--- •--------- 1-I !-- * 1-------- •---- 1-1--- |-l--- ! ’-I 1 1-1 1------------- 1---- 1-1--- 1- •---- 1-1-- 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 Position 1,0 0,98 0,96 0,94 0,92 0,9 ^ 0,88 1 o.se 'e 0,84 00 0,82 0,8 0,78 0,76 0,74 0,72 Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью сервиса BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» ----------------- Theilovirus Vilyuisk enceph. virus Window: 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Kimura (2-parameter), ТЛ: 2,0 Рис. 1. Гомология аминокислотной последовательности полипротеина- предшественника SDVFV LEIV-Tur2833 с ThV и VHEV По вертикали - значения гомологии (similarity) для каждой позиции полипротеина (по горизонтали). Сверху указана схема полипротеина. Данные получены с использованием программы SlimPlot 3.5.1 (http://sray.med.som.jhmi.edu/SCRoftware/simplot). (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Генетическую дистанцию определяли по модели p-distance с попарным удалением гэпов. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли с применением программы MEGA5 по методу максимального правдоподобия (maximum likelihood) с 1000-кратным бутстреп- тестированием. Результаты и обсуждени В результате обработки данных полногеномного секве- нирования определили полную последовательность генома SDVFV (штамм LEIV-Tur2833) (GenBank ID: KJ191558). Геном вирусов сем. Picornaviridae представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности (длина 7-8,8 тыс. н. о.), которая имеет одну протяженную открытую рамку считывания. 5’-конец РНК не кэпирован, но ковалентно связан с вирусным белком VPg. Трансляция вирусных белков происходит в виде полипротеина-предшественника (Р0), который в результате многоступенчатого процессинга с участием клеточных и вирусных протеаз нарезается на отдельные структурные (область P1) и неструктурные (области P2, P3) протеины [1]. Общая длина кодирующей области SDVFV составила 6912 н. о. (2303 а. о.). При первоначальном анализе полученной последовательности установлено, что наибольшей гомологией SDVFV обладает с различными вариантами ThV (род Cardiovirus), включая VHEV, который изолирован из аутопсийного материала погибших при вспышке энцефаломиелита в Якутии (вилюйский энцефалит) [3]. При анализе полноразмерных последовательностей полипротеина кардиовирусов выявили, что SDVFV обладает 85 и 95% гомологией с TMEV на нуклеотидном и аминокислотном уровне соответственно. Суммарный уровень гомологии полной нуклеотидной последовательности SDVFV с VHEV составляет 83%, а аминокислотной - 91%. Гомологи SDVFV c различными вариантами EMCV не превышает 55%. Для анализа вариабельности различных областей полипротеина SDVFV, VHEV и ThV использовали программу SlimPlot 3.5.1 (http://sray.med.som.jhmi.edu/ SCRoftware/simplot) (рис. 1). Как видно на рис. 1, область полипротеина Р1, соответствующая структурным белкам (VP1-VP4), более дивергентна, чем области Р2 и Р3, кодирующие неструктурные белки (2A-2C и 3А-3D). На некоторых участках Р1 дивергенция между SDVFV, TMEV и VHEV достигает 10 и 30% соответственно, что объясняет их антигенные различия. Совокупные значения гомологии SDVFV с VHEV и TMEV, определенные для области Р1, на нуклеотидном уровне составляют 75 и 91%, тогда как для аминокислотной последовательности - 93 и 80% соответственно. Гомология VHEV с TMEV по Р1 также составляет 80%. Дендрограмма, построенная на основе сравнения Р1 области полипротеина методом ближайшего соседа, представлена на рис. 2, а. Филогенетически SDVFV группируется на одной ветви с TMEV и VHEV. Область Р2 кодирует вирусные ферменты протеазу (2А), хеликазу (2С) и интегральных мембранных белка (ИМБ 2В). Гомология аминокислотной последовательности данного участка SDVFV с TMEV и VHEV составляет 97 и 98% соответственно. Для области Р3 (включает вирусную протеазу 3С, РНК-зависимую РНК- полимеразу 3D, белок VPg и ИМБ 3А) значения гомологии составили, в среднем 96%. При этом уровень дивергенции между VHEV и TMEV также не превышает 5%. Результаты филогенетического анализа, проведенного для областей Р2 и Р3, представлены на рис. 2, б и 2, в соответственно. По своей вирулентности SDVFV занимает промежуточное положение между наиболее вирулентным EMCV и наименее вирулентным SAV, вызывая заболевания у взрослых мышей и сирийских хомячков [17]. Вирус обнаруживают после заражения белых мышей при всех путях заражения в мозгу, легких, печени, селезенке, почках, в крови с 48 до 168 ч после заражения (срок наблюдения) [17]. При подкожном заражении зеленых мартышек возникало клинически легкое заболевание, но при патолого-анатомическом исследовании отмечено явление менингоэнцефалита с преимущественным вовлечением в процесс подкорковых структур головного мозга, мозжечка, мелкоочаговой пневмонии, гепатита и инфекционной селезенки [8, 17]. Иммунная прослойка к SDVFV среди населения, проживающего в пустынной ландшафтной зоне, колеблется от 1 до 3,5%, в степной - 0,5%, горном ландшафте - 0%. Иммунная прослойка к SDVFV среди домашних животных в пойменных ландшафтах рек Сырдарья, Или, Эмба и Талас достигает 11-16%, тогда как в степной и горной зонах Казахстана обнаружены лишь единичные находки антител. Эти данные свидетельствуют о приуроченности природных очагов в Казахстане к пойменным пастбищным биоценозам пустынной ландшафтной зоны [8, 9, 11-13]. Рис. 2. Филогенетическое положение SDV в составе рода Cardiovirus, определенное по различным регионам полипротеина-предшественника: а - по области структурных белков P1 (включает белки VP1-VP4); б - по региону P2 (включает белки 2А, 2B, 2С); в - по региону Р3 (включает белки 3А, 3B, 3C и 3D). Принципиально иная экологическая ситуация в природных очагах обнаружена в западной части ареала в Туркменистане, где циркуляция SDVFV связана с гнездовьями колониальных морских птиц и аргасовы- ми клещами [14-16]. Все заболевшие лихорадкой долины Сырдарьи указывают в анамнезе присасывание клещей за 5-7 сут до начала болезни. Начало заболевания острое, с лихорадкой с температурой до 40°C, обильной полиморфной розеолезно-петехиальной сыпью на 3-4-е сутки болезни (с локализацией на конечностях, груди, животе), ознобом, слабостью и благоприятным исходом. Длительность заболевания около 10-14 сут [7-9]. Зондирование территории Казахстана и Средней Азии проводили в рамках программы по биобезопасности и изучения биоразнообразия в разных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных ГКВ РФ [12, 20-22].

Список литературы

Дополнительные файлы